丘雨蓓, 李德雄， 陳江

口腔臨床中常面臨各種原因造成的顱頜面骨組織缺損或骨量不足。隨著生物材料研究的進(jìn)展，越來越多的研究將注意力集中在人工合成的骨修復(fù)材料上[1]。近年來，天然高分子材料因其來源廣、加工性能好、組織相容性佳等優(yōu)點(diǎn)備受研究者的關(guān)注。殼聚糖(chitosan, CS)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一與細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的多聚糖，具有良好的親水性和抗菌性[2]。但CS降解速度過快，機(jī)械強(qiáng)度低，一般不單獨(dú)用于制作三維支架，而常與其他材料混合使用。絲素蛋白(silk fibroin, SF)是一種天然纖維蛋白，具有良好的力學(xué)性能，含有α-螺旋、無規(guī)則卷曲和β-折疊三種結(jié)構(gòu)，與骨組織中的膠原蛋白結(jié)構(gòu)相似但卻無明顯的抗原性[3]。當(dāng)SF的α-螺旋和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構(gòu)時(shí)，能明顯降低其水溶性。研究發(fā)現(xiàn)，CS溶液和SF溶液混合后會促進(jìn)β-折疊形成，降低材料的降解速率，提高機(jī)械性能，并能保留兩種材料的優(yōu)點(diǎn)[4]。本研究擬采用SF和CS為原材料制備三維多孔支架，檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)在該材料上的黏附、增殖及成骨分化，探討其作為骨修復(fù)材料的可能。

1 材料與方法

1.1 SF-CS支架制備 將2 g CS粉(美國Sigma公司)溶解于100 mL 0.2 mmol/L乙酸溶液，磁力攪拌至CS完全溶解。將2 g的SF粉(實(shí)驗(yàn)組前期制備)溶解于100 mL去離子水中。將制備好的SF溶液和CS溶液按體積比3∶1比例混合，攪拌均勻后倒入24孔板中并置于-20 ℃冰箱冷凍。24 h后放入預(yù)冷好的真空冷凍干燥機(jī)(FD-1E-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)中干燥(-54 ℃，80 Pa)后用無水乙醇室溫交聯(lián)6 h。去離子水完全置換無水乙醇后再次冷凍干燥24 h，最終得到SF-CS支架。

1.2 SF-CS支架物理性能表征

1.2.1 支架表面形貌和孔徑檢測 將SF-CS支架用導(dǎo)電膠固定于檢測圓臺上，表面噴金處理，室溫下掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM，QUANTA450，美國FEI公司)觀察其表面形貌特征，并隨機(jī)測量3個(gè)樣本共75個(gè)孔徑，計(jì)算孔徑平均值。

1.2.2 支架孔隙率和吸水率檢測 采用無水乙醇檢測支架的孔隙率。在量筒中裝入10 mL無水乙醇(V1)，將底面積為2 cm2、高為1 cm的SF/CS復(fù)合材料放入量筒中，待充分浸泡后，記錄此時(shí)的乙醇體積為V2；取出材料后，剩余的乙醇體積記錄為V3，計(jì)算材料的孔隙率(共檢測10個(gè)樣品)：

孔隙率(%)=[(V1-V3)/(V2-V3)]×100%

采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)檢測材料的吸水率。將材料浸入PBS溶液中，待完全溶脹后取出，去除表面水分，稱質(zhì)量，記錄濕態(tài)支架的質(zhì)量為W1，后將材料置于65 ℃烘箱中完全烘干，稱質(zhì)量，記錄干態(tài)支架的質(zhì)量W2，計(jì)算支架的吸水率：

吸水率(%)=[(W1-W2)/W2]×100%

1.2.3 支架力學(xué)性能測量 制備高1.0 cm、直徑1.5 cm樣品，室溫下采用萬能材料試驗(yàn)機(jī)(中國島津公司)檢測SF-CS支架濕態(tài)下(PBS為浸泡液體)的壓縮強(qiáng)度，載荷0.1 kN，加載速度為 1 mm/min，壓縮量為80%，每組測量10個(gè)樣本，計(jì)算平均值。

1.3 細(xì)胞接種 將SF-CS支架切成厚度為1 mm的圓片，環(huán)氧乙烷滅菌后放入24孔板中。每孔加入1 mL完全培養(yǎng)基(L-DMEM培養(yǎng)基+10% FBS+1%青/鏈霉素)浸潤2 h后，每個(gè)樣本接種5×104個(gè)BMSCs。對照組將相同數(shù)量的BMSCs直接接種于24孔板中。將孔板放置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的 CO2培養(yǎng)箱中，每3 d更換1次培養(yǎng)基。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，每組3個(gè)樣本。

1.4 細(xì)胞黏附 細(xì)胞培養(yǎng)1 d后，光鏡下觀察對照組細(xì)胞的黏附形態(tài)，SEM觀察實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的形態(tài)。去除培養(yǎng)基，PBS輕輕沖洗，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS清洗3次，梯度乙醇脫水(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)，每次10 min；CO2臨界點(diǎn)干燥，樣本表面噴金，采用SEM觀察細(xì)胞在材料上的黏附情況。

1.5 細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)1、3、7 d后采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖。去除原培養(yǎng)基，每孔加入50 μL CCK-8和 500 μL完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育 2 h后，每孔吸出100 μL加入新的96孔板種，酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)測量450 nm波長處吸光度值OD。

1.6 細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因表達(dá)檢測 細(xì)胞接種方式同1.3。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后去除原培養(yǎng)液，更換成含成骨誘導(dǎo)液的完全培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+0.1 μmol/L地塞米松+50 mg/L維生素 C)，每 3 d更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)7 d后，采用TRIZOL法(美國Invitrogen公司)及RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)提取細(xì)胞的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄(ABI 2720,美國Thermo Fisher Scientific公司)成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR， qPCR)檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2(runt-related transcription factor-2，Runx-2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及骨鈣素(osteocalcin,OC)基因的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算各組基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 成骨基因引物序列Tab.1 The primer sequences for osteogenic genes

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差別比較。P<0.05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SF-CS支架的結(jié)構(gòu)特征 SF-CS支架物理形貌如圖1所示。所獲得的樣本為白色海綿狀圓柱體，與24孔板外形一致。SEM下，支架呈三維多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為(251.16±69.85) μm?？紫堵屎臀史謩e為(89.10±2.74)%和(280.25±9.07)%，壓縮強(qiáng)度為(0.54±0.07) mPa。

SF-CS：絲素-殼聚糖。A～C：支架外觀；D～E：支架表面形貌掃描電鏡觀(D： ×40；E： ×400)。圖1 SF-CS支架形貌特征Fig.1 The morphology characters of SF-CS scaffold

2.2 SF-CS支架對細(xì)胞黏附的影響 SF-CS支架三維多孔結(jié)構(gòu)對細(xì)胞黏附形態(tài)產(chǎn)生了明顯的影響。對照組BMSCs呈紡錘多角狀，緊貼培養(yǎng)皿底面呈二維生長(圖2A)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼附在SF-CS支架孔壁上，并沿著孔壁外形呈三維方向生長，細(xì)胞胞體變形和拉伸明顯，部分細(xì)胞伸出細(xì)長的偽足黏附到遠(yuǎn)處的孔壁上，細(xì)胞胞體呈懸空狀(圖2B)。

SF-CS：絲素-殼聚糖；BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。A： BMSCs在培養(yǎng)皿中的黏附形態(tài)( ×100)；B：BMSCs在SF-CS支架上的黏附形態(tài)掃描電鏡觀( ×2 500，箭頭所指為BMSCs)。圖2 BMSCs黏附形態(tài)Fig.2 The cell adhesion and morphology of BMSCs

2.3 SF-CS支架對BMSCs增殖能力的影響 兩組細(xì)胞的增殖趨勢良好。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞數(shù)量均明顯增加。在各個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖均高于對照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

與對照組比較，△：P<0.05。圖3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖情況Fig.3 The cell proliferation of bone mesenchymal stem cells for different culture period

2.4 SF-CS支架對BMSCs成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)7 d后，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，SF-CS支架上培養(yǎng)的細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因Runx-2、ALP及OC的mRNA表達(dá)水平均高于對照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

Runx-2:Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2；ALP：堿性磷酸酶；OC：骨鈣素。與對照組比較，△：P<0.05。圖4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因表達(dá)水平Fig.4 The osteogenic gene expressions level in bone mesenchymal stem cells

3 討 論

理想的骨修復(fù)支架材料應(yīng)具有良好的加工性能，當(dāng)填充在骨缺損及骨量不足區(qū)域時(shí)，能為新骨的生長提供三維空間，同時(shí)具有一定的孔徑和孔隙率，能為組織細(xì)胞的黏附、生長及分化提供微環(huán)境。本研究通過冷凍干燥法制備了SF-CS支架，在掃描電鏡下，SF-CS支架呈現(xiàn)三維多孔形貌，孔徑和孔隙率與人體骨組織(50～300 μm，75%～90%)相似，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能滿足非承重區(qū)如牙槽骨缺損骨修復(fù)支架的物理性能要求。

BMSCs是骨愈合過程中最重要的細(xì)胞，它的高度自我復(fù)制能力和多向分化潛能使其成為組織再生研究中應(yīng)用得最為廣泛的種子細(xì)胞。細(xì)胞在材料表面的黏附是細(xì)胞-材料相互作用的第一步，也是細(xì)胞實(shí)現(xiàn)增殖、遷移、分化等行為的基礎(chǔ)。材料表面是否有利于細(xì)胞的黏附和生長，是評價(jià)材料生物性能的一個(gè)重要指標(biāo)[5]。本研究中，BMSCs在SF-CS支架上具有良好的黏附能力，支架的三維多孔結(jié)構(gòu)明顯影響了細(xì)胞的黏附形態(tài)，細(xì)胞沿著孔壁外形鋪展，并伸出細(xì)長偽足黏附至遠(yuǎn)處孔壁。研究發(fā)現(xiàn)，絲狀偽足是細(xì)胞發(fā)生遷移的重要途徑[6]，說明SF-CS支架具有良好的生物相容性，有利于細(xì)胞的黏附和遷移。

BMSCs在材料上呈現(xiàn)出良好的增殖趨勢，CCK-8檢測結(jié)果表明，BMSCs在SF-CS支架上的增殖率高于二維平面培養(yǎng)的對照組，與既往的研究結(jié)果相似[7]。在細(xì)胞的成骨分化檢測中，實(shí)驗(yàn)組BMSCs 成骨分化相關(guān)基因Runx-2、ALP及OC的表達(dá)水平較對照組細(xì)胞上調(diào)。Runx-2及ALP是BMSCs成骨分化早期的重要標(biāo)志，OC是BMSCs成骨分化晚期的重要標(biāo)志，這些結(jié)果說明SF-CS支架能促進(jìn)BMSCs的成骨分化。以往研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)的微納形貌會對細(xì)胞功能產(chǎn)生巨大的影響[8-9]。相對于二維平面生長的對照組細(xì)胞，細(xì)胞在SF-CS三維支架上沿著多孔結(jié)構(gòu)呈立體生長，鋪陳面積大，胞體更為拉伸。細(xì)胞形態(tài)的變化會導(dǎo)致細(xì)胞骨架發(fā)生形變，這種形變能直接產(chǎn)生力學(xué)刺激并通過細(xì)胞膜上的相關(guān)蛋白傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，激活下游一系列信號通路，如MAPK通路、β-catenin通路等，從而對細(xì)胞增殖及分化等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響[10]。ZHANG等[11]發(fā)現(xiàn)，BMSCs具有更為拉伸的細(xì)胞形態(tài)和更大的細(xì)胞鋪展面積時(shí)，有利于成骨向分化。

綜上所述，本研究通過冷凍干燥法制備的三維多孔SF-CS支架利于BMSCs黏附，促進(jìn)其增殖和成骨分化，提示該材料具有作為骨修復(fù)材料的潛能，后續(xù)將進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該材料的成骨性能。