張紹武 張浩

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗科, 沈陽 110032)

甲真菌病是最常見的皮膚科疾病之一，發(fā)病率約占臨床甲病的一半以上，病原菌包括皮膚癬菌、酵母菌和其他非皮膚癬菌性絲狀真菌等,國內(nèi)甲真菌病病原菌中皮膚癬菌占65%～70%，酵母菌占10%～30%。甲真菌病常表現(xiàn)為甲板增厚、分離、變色等臨床癥狀，其臨床表現(xiàn)有時不易與白甲癥、黃甲綜合征、甲銀屑病、甲扁平苔蘚等指(趾)甲疾病鑒別[1-5]，因此，病原學(xué)檢查是診斷和鑒別診斷甲真菌病的關(guān)鍵依據(jù)。

甲真菌病的實驗室檢查最常用的檢測方法是鏡檢法，鏡檢法主要有KOH濕片鏡檢和熒光鏡檢。KOH濕片鏡檢法因操作簡單快捷、成本低廉，為實驗室普遍采用，但該法陽性率僅為57.5%～69.23%[4-7]，且易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，導(dǎo)致臨床漏診或誤診；熒光染色法檢出率為70%～85%，但需要熒光顯微鏡[8-10]。本研究嘗試改變KOH濕片法的標(biāo)本消化方法，探討試管法KOH消化甲屑對甲真菌檢測效果的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑 10% KOH(10 g KOH加入蒸餾水溶解至100 mL), CFW真菌熒光染色液(Sigma-Aldrich,美國默克公司)。

儀器 OLYMPUS顯微鏡(日本，普通光源型號CX41FR，紫外光源型號MF-UV-LED-0-4)。

標(biāo)本 皮膚科門診疑似甲真菌感染的患者標(biāo)本160例。

1.2 方法

標(biāo)本處理及檢測 刮取病變處甲屑，平均分成3段，每段約(1～2)mm×(2～3)mm，編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其所在組分別命名為玻片法組、試管法組和Ⅲ組。玻片法為將甲屑Ⅰ直接置于潔凈玻片上，其上滴加20 μL 10% KOH，室溫靜置10 min后再加入20 μL CFW真菌熒光染色液混合，作用1 min后鏡檢。鏡檢后玻片法真菌檢查陰性的甲屑及殘存微量消化液(基本已風(fēng)干)轉(zhuǎn)入到0.6 mL無色滅菌離心管中，然后在離心管中加入10% KOH 20 μL，攪拌后靜置10 min，將管中混合液全部置于潔凈玻片上鏡檢。試管法為將甲屑Ⅱ轉(zhuǎn)入0.6 mL無色滅菌離心管中，然后在離心管中加入20 μL 10% KOH，攪拌后室溫靜置10 min后將全部混合液置于潔凈玻片上，上覆20 μL真菌熒光染色液作用1 min后鏡檢。將甲屑Ⅲ置于0.6 mL無色滅菌離心管中，加入0.1 mL 10% KOH溶液，攪拌后靜置于室溫環(huán)境中，分別在2 min、10 min、30 min、60 min、120 min混合溶液，然后用加樣槍吸取5 μL甲屑混懸液滴于潔凈載玻片上，標(biāo)本上再滴加5 μL 真菌熒光染色液，蓋上蓋玻片靜置1 min后鏡檢。

統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件,計數(shù)資料以百分率(%)表示,兩組之間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 玻片法和試管法檢出陽性率比較

160例標(biāo)本中玻片法檢出76例陽性，陽性率為47.5%。試管法檢出101例陽性，陽性率為63.12%。兩組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=79.925，P<0.05)。甲屑ⅠKOH玻片法鏡檢為陰性的84份標(biāo)本轉(zhuǎn)入試管中處理標(biāo)本后鏡檢26例標(biāo)本陽性，與KOH玻片法陽性數(shù)量之和是102份陽性，比KOH試管法甲真菌的陽性多1例，陽性率為63.75%，與KOH試管法的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.1011，P>0.05)。

2.2 玻片法和試管法顯微鏡下檢測結(jié)果

甲屑Ⅰ經(jīng)10% KOH作用10 min后，可見單個上皮細胞或少量上皮細胞團塊，但甲屑主體仍致密，且未見菌絲(見圖1A)；但將甲屑Ⅰ殘余甲屑置于離心管中消化后，致密的甲屑主體分離為多個小的上皮細胞團塊或上皮細胞，可見菌絲(見圖1B)。甲屑Ⅱ經(jīng)消化后，可見多處菌絲(見圖1C)。

圖1 KOH甲屑制片顯微鏡下圖. A. 甲屑Ⅰ經(jīng)10% KOH作用10 min(×40)；B. 甲屑Ⅰ鏡檢后殘留物經(jīng)10% KOH作用10 min(×400)；C. 甲屑Ⅱ經(jīng)10% KOH作用10 min(×400)

2.3 標(biāo)本處理時間與菌絲檢出量關(guān)系結(jié)果

甲屑Ⅲ經(jīng)10%KOH消化后，屑塊不斷軟化、膨脹，消化2 h甲屑的KOH溶液近似膠凍狀；且甲屑消化10 min時才可檢出菌絲。甲屑檢出菌絲的數(shù)量隨著消化時間的延長增加，但消化1 h后檢出的菌絲增幅漸緩，Ⅲ組隨機限一份鏡檢真菌陽性標(biāo)本作圖，見趨勢圖2。

圖2 甲屑Ⅲ消化時間和菌絲檢出量的關(guān)系

3 討 論

相同病損的甲屑標(biāo)本，以10% KOH玻片法處理甲屑10 min時檢出陽性率為47.5%，而經(jīng)10% KOH試管法處理甲屑10 min時真菌檢出陽性率為63.12%。KOH試管法和玻片法檢測甲屑真菌的結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義，推測是因為KOH消化甲屑的處理方式不同所致，傳統(tǒng)KOH濕片法是將待測皮屑或甲屑標(biāo)本放在潔凈玻片中央，其上滴加1滴10% KOH溶液，消化片刻后鏡檢。但往往因甲屑角質(zhì)層較厚，細胞間排列緊密，甲屑內(nèi)部細胞很難接觸至KOH，其中包裹的真菌成分不能暴露出來，造成漏診；且有時背景雜亂、菌絲和細胞重疊部分不易分辨，造成誤診[10-11]。甲屑標(biāo)本浸泡在裝有10% KOH溶液的離心管中比浸泡在玻片上，甲屑與KOH接觸面積更大，溶液固有的流動性更利于KOH消化甲屑中的細胞間基質(zhì)、將包裹在其中的菌絲游離出來。甲屑ⅠKOH玻片法鏡檢為陰性的84份標(biāo)本轉(zhuǎn)入試管中處理標(biāo)本后鏡檢26例標(biāo)本陽性，與KOH玻片法陽性數(shù)量之和，與KOH試管法的陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進一步驗證了將甲屑置于離心管中消化比KOH玻片法可獲得較好的檢測結(jié)果，此結(jié)論與馬元龍等[6]改變甲屑的處理方式可提高真菌檢出率的結(jié)論一致。

Afshar等[12]對189例疑似皮膚真菌病患者檢測發(fā)現(xiàn)，KOH消化標(biāo)本30 min、2 h、超過6 h后采用熒光染色法檢測標(biāo)本的陽性率分別為53.44%、62.96%、64.02%。本研究結(jié)果和Afshar等學(xué)者的結(jié)果一致，即甲屑消化時間和菌絲檢出量呈正相關(guān)。實驗中消化后游離菌絲少于混雜菌絲，且游離菌絲多為菌絲片段，推測是上皮細胞從細胞團塊中分離和攪拌時產(chǎn)生的力破壞所致。本實驗用KOH消化甲屑，消化2 min時未能檢出真菌、消化10 min時僅檢出1處真菌菌絲，表明消化時間不足可影響甲屑真菌的檢測結(jié)果，推測KOH消化時間不足可能是導(dǎo)致甲屑標(biāo)本KOH濕片法陽性率較低的原因之一。甲屑消化1 h后菌絲數(shù)量隨消化時間延長而增加的幅度減慢；且消化1 h鏡檢的甲屑標(biāo)本中有約20處可檢測出菌絲，檢出菌絲的幾率明顯增加。

本研究探討甲屑標(biāo)本處理方法對真菌檢測結(jié)果的影響，考慮到標(biāo)本檢測時間應(yīng)滿足臨床的需要，認(rèn)為將試管法處理甲屑1 h鏡檢可解決傳統(tǒng)KOH濕片法消化不充分造成的真菌假陰性檢測結(jié)果問題，提高真菌檢出幾率及提高檢測人員的工作效率，適合臨床推廣應(yīng)用。