劉 偉，符禹婷，俞 健，王發(fā)祥，李向紅，劉永樂*

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410114）

冷凍面團(tuán)技術(shù)是指在面制品的生產(chǎn)過程中，運用冷凍技術(shù)對半成品進(jìn)行冷凍處理，將面團(tuán)制作和熟制流程獨立成兩個環(huán)節(jié)的面點新工藝[1]。相對傳統(tǒng)的面點加工和銷售方式，冷凍面團(tuán)相關(guān)產(chǎn)品具有成本低、保質(zhì)期長、便于運輸和冷藏、利于連鎖企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化的特點[2]，在中央廚房模式和連鎖經(jīng)營概念的日益普及的背景下，是我國傳統(tǒng)發(fā)酵面制品工業(yè)化的必然趨勢。然而，冷凍處理會降低冷凍面團(tuán)品質(zhì)，影響熟制后面制品的質(zhì)量，如酵母活性降低、發(fā)酵時間延長、持氣能力減弱、面團(tuán)強度受損、面包體積減小等[3-5]。關(guān)于冷凍損害面團(tuán)品質(zhì)的機理，目前普遍認(rèn)為冰晶的形成導(dǎo)致面團(tuán)中酵母菌活性降低、面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞、水分狀態(tài)改變等[5]。目前，添加合適的抗凍保護(hù)劑仍是改善面團(tuán)冷凍損害的最有效途徑，其中應(yīng)用和研究最多的保護(hù)劑主要有復(fù)合磷酸鹽、海藻糖、蔗糖酯、黃原膠、抗凍蛋白（肽）等[5-6]。

鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）是我國四大家魚之一，2018年全國養(yǎng)殖量達(dá)385.89萬 t，是我國第二大淡水養(yǎng)殖魚類[7]。但鰱魚肉質(zhì)發(fā)面、肌間刺多、土腥味重，不僅食用品質(zhì)差，而且價格低廉，是最典型的大宗低值淡水魚，目前仍缺乏具有競爭力的深加工途徑[8]。近年來，研究者關(guān)注到鰱魚肌肉[8-9]、肌肉蛋白[10]或加工副產(chǎn)物[11]的酶解產(chǎn)物具有優(yōu)良的抗凍活性，在冷凍魚糜[10-11]、酵母菌細(xì)胞[8-9]等的抗凍保護(hù)中應(yīng)用潛力巨大。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在酵母菌懸浮液中添加4 g/100 mL的優(yōu)選鰱魚酶解產(chǎn)物能將凍融處理后酵母菌存活率由0.71%提高至90%以上[12]，將該酶解產(chǎn)物作為抗凍劑添加至冷凍面團(tuán)中，能大幅提高冷凍面團(tuán)（6次凍融循環(huán)）的酵母菌存活率和發(fā)酵力保存率，緩解醒發(fā)時間延長的問題，并能提高面包的比容和感官品質(zhì)[13]。然而，肌肉或蛋白酶解產(chǎn)物的組成復(fù)雜，通常存在還原性肽（抗氧化性）[14-15]，而面團(tuán)中加入還原性物質(zhì)對面筋結(jié)構(gòu)的影響一般均為負(fù)面[16]，目前還沒有研究鰱魚酶解產(chǎn)物對面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性、面筋形成等特性影響的報道。本研究將以復(fù)合蛋白酶酶解鰱魚肌肉不同時間制備的酶解產(chǎn)物添加至冷凍面團(tuán)中，分析其對冷凍面團(tuán)焙烤、流變特性及面筋結(jié)構(gòu)等的影響，旨在為以鰱魚酶解產(chǎn)物作為冷凍面團(tuán)品質(zhì)改良劑及其定向調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鰱魚購自湖南長沙當(dāng)?shù)夭耸袌?，每尾質(zhì)量為（2.5f0.5）kg；白砂糖、食鹽 長沙市購；高筋面粉克明面業(yè)股份有限公司；活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；復(fù)合蛋白酶（≥1.5 AU/g） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；D-(+)-海藻糖二水合物（純度≥98%） 上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）（100 U/mg）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOTECH-5L生物酶反應(yīng)器 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；HMJ-A35M1型和面機 小熊電器股份有限公司；JCD-5型電動壓面機 浙江天喜網(wǎng)絡(luò)科技有限公司；YXD-Z204商用箱式電烤爐 廣州市三鼎金屬制品有限公司；TA.XT.Plus型物性測定儀 英國Stable Micro System公司；粉質(zhì)儀 北京東方孚德技術(shù)發(fā)展中心；HWS-250B恒溫恒濕箱 天津市泰思特儀器有限公司；TESCAN MIRA3場發(fā)射掃描電鏡 捷克TESCAN有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚酶解產(chǎn)物的制備

參考熊思佳等[12]的方法。新鮮鰱魚宰殺取肉，用組織搗碎機攪碎，按固液比1∶5（g/mL）與水混勻后加入酶反應(yīng)器，加入相當(dāng)于魚肉（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)按80%計）干質(zhì)量3%的復(fù)合蛋白酶，在50 ℃、pH 6.5f0.05條件下分別水解15、30、60、120、240 min，90 ℃滅酶15 min，于4 000hg離心15 min后，收集上清液進(jìn)行冷凍干燥，獲得酶解時間為15、30、60、120、240 min的鰱魚酶解產(chǎn)物（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為85%左右，水分和灰分等含量差異不大，水解度分別9.68%、13.57%、18.42%、23.27%、29.10%[12]），分別命名為SCMH-15、SCMH-30、SCMH-60、SCMH-120、SCMH-240。

1.3.2 冷凍面團(tuán)的制備

空白組面團(tuán)配方：面粉100%、去離子水50%、白砂糖5%、食鹽1%、干酵母0.4%；陽性對照組和實驗組面團(tuán)分別以同樣質(zhì)量的海藻糖溶液（40 g/L）和鰱魚酶解產(chǎn)物溶液（40 g/L）替代去離子水，相當(dāng)于抗凍劑的焙烤百分比約為2%。

按配方稱取面粉、白砂糖、食鹽、干酵母，混合均勻置于和面機中，加入水或抗凍劑溶液，自動和面10 min，面團(tuán)分成若干個30 g的小面團(tuán)，放入面包模具中壓平，封口膜封口，分別進(jìn)行0次和4次凍融循環(huán)（-18 ℃冷凍18 h，4 ℃解凍6 h為1次凍融循環(huán)）后測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.3 醒發(fā)時間的測定

面團(tuán)按1.3.2節(jié)的方法凍融處理0次或4次循環(huán)，置于恒溫恒濕箱（溫度30 ℃、相對濕度85%）中并開始計時，待面團(tuán)發(fā)酵至最高點觸碰到封口膜時記為發(fā)酵終點，所需時間即為面團(tuán)醒發(fā)時間。

1.3.4 面包比容測定

面團(tuán)按1.3.2節(jié)的方法凍融處理0次或4次循環(huán)，置于醒發(fā)箱中醒發(fā)3 h。將烤箱設(shè)定為180 ℃，上下火，預(yù)熱5 min，將醒發(fā)好的面團(tuán)放入烤箱中焙烤15 min，焙烤結(jié)束后將面包從模具中倒出，室溫冷卻30 min。參照GB/T 20981ü2007《面包》，采用菜籽填充劑法測定面包比容。

1.3.5 面團(tuán)拉伸強度測定

采用質(zhì)構(gòu)儀的抗拉測試探頭A/SPR測定。用一個手工面條機將面團(tuán)制成粗細(xì)均勻（直徑約2 mm）的圓柱形面條，固定在探頭夾具上。測試前、中、后速率分別設(shè)置為1、3、10 mm/s，距離為90 mm，觸發(fā)力5 g。

1.3.6 面團(tuán)黏附性和延展性測定

面團(tuán)黏附性：采用質(zhì)構(gòu)儀和P/0.5探頭測定，將面團(tuán)用壓面機壓成厚度為4 mm的面片，鋪在白瓷板上，設(shè)置測試前、中、后速率分別為1、0.5、10 mm/s，作用力1 N，返回距離10 mm，接觸時間5 s，觸發(fā)力0.049 N，測得曲線的最高點對應(yīng)的力為面團(tuán)最大黏附力，能量即曲線所圍成的總面積代表面團(tuán)黏附性[17]。

面團(tuán)延展性：采用質(zhì)構(gòu)儀的破裂測試裝置HDP/TPB和P/1s探頭測試，將4 mm的面片固定在HDP/TPB夾具上，測試前、中、后速率分別設(shè)置為1、1、10 mm/s，距離70 mm，觸發(fā)力0.049 N，通過探頭與面片接觸后向下移動，以探頭從接觸面片到面片破裂所運行的距離表示樣品的延展性，最大力表示樣品的韌性[18]。

1.3.7 粉質(zhì)特性測定

空白組、海藻糖組和SCMH-30組小麥粉分別按1.3.2節(jié)加入配方中除水以外的物質(zhì)混勻，葡萄糖氧化酶組（SCMH-30+GOD）在SCMH-30組的基礎(chǔ)上加入20 mg/kg（以面粉質(zhì)量計算）GOD；參照GB/T 14614ü2006《小麥粉 面團(tuán)的物理特性 吸水量和流變學(xué)特性的測定 粉質(zhì)儀法》測定面粉的粉質(zhì)特性。

1.3.8 掃描電鏡觀察面團(tuán)顯微結(jié)構(gòu)

參考Xin Chen等[19]的方法稍作修改。將新鮮面團(tuán)和凍融4次的面團(tuán)置于-70 ℃超低溫冰箱冷凍12 h，真空冷凍干燥，制得樣品。將凍干的樣品用手從中間掰開，避免面筋結(jié)構(gòu)的機械損傷，噴金后用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組實驗進(jìn)行3個平行，以 fs表示，結(jié)果以O(shè)rigin 2018軟件繪圖；樣本均數(shù)以SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析，先進(jìn)行Welch檢驗（α=0.05），方差齊者用Duncan法進(jìn)行多重比較，方差不齊者用Dunnet-T3分析，結(jié)果以小寫字母在圖表中標(biāo)注，不同字母表示不同處理樣本在相同凍融循環(huán)次數(shù)時差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚酶解產(chǎn)物對冷凍面團(tuán)發(fā)酵和焙烤特性的影響

如表1所示，凍融處理前，各組面團(tuán)的醒發(fā)時間在61～67 min之間，面團(tuán)焙烤后面包比容在2.24～2.38 mL/g之間，均無顯著差異（P＞0.05）。凍融循環(huán)處理4次后，各組面團(tuán)醒發(fā)時間均顯著增加，面包比容均顯著降低，可能是因為凍融過程中冰晶的形成和重結(jié)晶導(dǎo)致面團(tuán)中酵母菌、面筋結(jié)構(gòu)的損傷導(dǎo)致其產(chǎn)氣和持氣能力下降所致[20]?？瞻捉M面團(tuán)經(jīng)4次凍融循環(huán)后，醒發(fā)時間延長至170 min（增幅為159%），面包比容僅為1.54 mL/g（降幅達(dá)34%），而海藻糖組和SCMH-15、SCMH-30、SCMH-60組面團(tuán)凍融前后醒發(fā)時間和面包比容的變化幅度均小于空白組，表明其添加有利于減輕面團(tuán)的冷凍損害，保持酵母菌活力，抑制面包比容下降；其中，海藻糖組和SCMH-30組醒發(fā)時間的延長幅度分別為106%和92%，面包比容減小幅度分別為25%和26%，說明其對面團(tuán)的抗凍保護(hù)效果相對最好。海藻糖有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，能通過結(jié)合水分子減少冰晶生成，已被證實是一種優(yōu)良的抗凍保護(hù)劑[21-22]；課題組前期研究表明，不同鰱魚酶解產(chǎn)物的氨基酸組成和含量差別不大，但隨著水解度增加，其分子質(zhì)量分布明顯變化、小分子組分含量逐漸增加[23]；其中SCMH-30組60%以上的肽分子質(zhì)量在1 000～2 000 Da之間[8]，對酵母菌的抗凍保護(hù)效果最佳[12]，其能吸附體系中的自由水而限制水分子流動，增加不凍結(jié)水含量、抑制冰晶的形成，從而顯著提高了酵母菌凍融過程中的存活率[9]。因此，鰱魚酶解產(chǎn)物也是一種潛在的冷凍面團(tuán)抗凍劑。

表1 鰱魚酶解產(chǎn)物對冷凍面團(tuán)醒發(fā)時間和面包比容的影響Table 1 Effects of SCMHs on proofing time of frozen dough and bread specific volume

2.2 鰱魚酶解產(chǎn)物對冷凍面團(tuán)拉伸強度的影響

如圖1所示，凍融前，空白組與海藻糖組面團(tuán)的拉伸強度差異不大，但所有添加酶解產(chǎn)物的面團(tuán)的拉伸強度均有所降低，說明添加鰱魚酶解產(chǎn)物一定程度上削弱了面團(tuán)的拉伸強度，可能是因為酶解產(chǎn)物中的還原性肽影響了面筋蛋白的聚合和二硫鍵的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，從而降低了面團(tuán)筋力[24-25]；李向紅等[15]報道水解度10%左右的鰱魚酶解產(chǎn)物抗氧化活性最高，本研究SCMH-15和SCMH-30的水解度分別為9.68%和13.57%，而SCMH-15和SCMH-30組面團(tuán)的拉伸強度顯著低于其他組（P＜0.05），進(jìn)一步證實了鰱魚酶解產(chǎn)物中的還原性肽損害了面筋強度的推測。4次凍融循環(huán)后，所有處理組面團(tuán)的拉伸強度均有所降低，說明其面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在凍融過程中受到了破壞[26]；其中空白組降幅超過18%，海藻糖、SCMH-15、SCMH-30組的降幅分別為2%、4%和1%，遠(yuǎn)小于空白組，這與其具有較好的抗凍保護(hù)活性一致。

圖1 鰱魚酶解產(chǎn)物對冷凍面團(tuán)拉伸強度的影響Fig.1 Effects of SCMHs on the tensile strength of frozen dough

2.3 鰱魚酶解產(chǎn)物對冷凍面團(tuán)黏附性的影響

研究過程中發(fā)現(xiàn)在相同條件下和面，加入部分鰱魚酶解產(chǎn)物的面團(tuán)黏度較大，采用質(zhì)構(gòu)儀測定相應(yīng)面片的黏附性，結(jié)果如圖2所示。凍融前空白組和海藻糖組面團(tuán)的黏附性分別為98、97 mNgs，最大黏附力分別為1 408、1 326 mN，無顯著差異（P＞0.05）；但添加了酶解產(chǎn)物后面團(tuán)黏附性均有一定程度增加，這與和面時觀察到的現(xiàn)象一致，其中SCMH-15和SCMH-30組面團(tuán)的黏附性分別為171 mNgs和197 mNgs，最大黏附力分別為1 889 mN和1 755 mN，顯著高于空白組和海藻糖組（P＜0.05），也高于其他SCMH組，可能與SCMH-15和SCMH-30的抗氧化活性最高有關(guān)[15]。4次凍融循環(huán)后，所有組面團(tuán)的黏附性和最大黏附力均顯著上升，與Lu Lu等[27]報道的結(jié)果類似，可能是因為凍融處理損傷了面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和淀粉顆粒，對水分子的束縛性減弱以致水分遷移釋放，從而使面團(tuán)黏性變大[26,28]。

2.4 鰱魚酶解產(chǎn)物對冷凍面團(tuán)延展性的影響

面團(tuán)的延展性是基于質(zhì)構(gòu)儀的穿透模式測試，圖3為穿破測試的力-延展曲線圖。凍融前海藻糖組和空白組的曲線高度相似，但全部酶解產(chǎn)物組曲線的力明顯減小，延展距離稍有增加，說明添加酶解產(chǎn)物使面團(tuán)的韌性（抗延展阻力）減小，影響了面團(tuán)的延展性，這可能與酶解產(chǎn)物的還原性影響了面筋的筋力有關(guān)；其中，SCMH-15和SCMH-30組的力最小，而且力-延展曲線不典型（與空白組相比），主要是因為其面團(tuán)黏附性大，導(dǎo)致抗延展阻力小且測試過程中穿破非瞬時發(fā)生[29]。經(jīng)過4次凍融循環(huán)后，所有面團(tuán)的延展距離均有所增加，可能與凍融后面團(tuán)筋力受損有關(guān)；其中空白組面團(tuán)的延展距離增加了約13%，而海藻糖、SCMH-15、SCMH-30組的延展距離分別增加了7%、2%和5%，表明其樣品延展性受凍融循環(huán)處理的影響相對較小，這也與其抗凍保護(hù)效果的結(jié)果基本一致。

2.5 鰱魚酶解產(chǎn)物對冷凍面團(tuán)結(jié)構(gòu)的影響

綜合上述結(jié)果，鰱魚酶解產(chǎn)物中SCMH-30對冷凍面團(tuán)的抗凍保護(hù)效果最好，而對面團(tuán)黏附性和拉伸強度等影響也相對較大，故選擇SCMH-30組面團(tuán)觀察其顯微結(jié)構(gòu)在凍融處理前后的差異，結(jié)果如圖4所示。凍融前，空白組面團(tuán)結(jié)構(gòu)均勻，淀粉顆粒密集的深埋在面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中[30]；海藻糖組面團(tuán)結(jié)構(gòu)與空白組相似，但SCMH-30組面團(tuán)中淀粉顆粒被面筋包埋的程度明顯較淺，可能是因為SCMH-30中的還原性物質(zhì)影響了面筋網(wǎng)絡(luò)的形成，導(dǎo)致面筋形成較少或部分二硫鍵被破壞，這也是其黏彈和拉伸強度相對較差的主要原因。4次凍融循環(huán)后，空白組面團(tuán)出現(xiàn)了大的孔隙（圓圈所示），許多淀粉顆粒從面筋蛋白中脫離，表明凍融過程中面筋網(wǎng)絡(luò)受到了破壞[31]；而且部分淀粉顆粒發(fā)生變形（箭頭所示），可能與凍融過程中形成的大冰晶擠壓有關(guān)[32]。與空白組相比，海藻糖組面團(tuán)中也觀察到部分淀粉顆粒變形，但淀粉顆?；旧暇偳对诿娼罹W(wǎng)絡(luò)中；而SCMH-30組面團(tuán)結(jié)構(gòu)與海藻糖組相似，但淀粉顆粒未觀察到明顯變形，進(jìn)一步證實了其對冷凍面團(tuán)的良好抗凍保護(hù)效果。

圖4 鰱魚酶解產(chǎn)物對冷凍面團(tuán)面筋顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of SCMHs on the gluten microstructure of frozen dough

2.6 鰱魚酶解產(chǎn)物對冷凍面團(tuán)粉質(zhì)特性的影響

粉質(zhì)特性反映面粉通過加水在形成面團(tuán)過程中的流變學(xué)特性，對最終面團(tuán)的品質(zhì)具有重要的影響[33]。由表2可見，空白組和海藻糖組面粉的吸水率、面團(tuán)形成和穩(wěn)定時間、弱化度、粉質(zhì)指數(shù)均無顯著差異，表明添加海藻糖對面粉的粉質(zhì)特性影響不大；然而，SCMH-30組面粉的吸水率相對空白組降低不顯著（P＞0.05），但面團(tuán)形成時間、穩(wěn)定時間、粉質(zhì)指數(shù)均顯著降低，弱化度則顯著上升（P＜0.05），說明SCMH-30的添加明顯改變了面粉的粉質(zhì)特性，使面團(tuán)的筋力和彈性下降，影響其加工性能。

表2 鰱魚酶解產(chǎn)物對面粉粉質(zhì)特性的影響Table 2 Effects of SCMHs on the farinographical properties of wheat flour

此外，相對SCMH-30組，SCMH-30+GOD組面粉的吸水率、粉質(zhì)指數(shù)顯著增加，弱化度則顯著降低（P＜0.05），面團(tuán)的形成時間和穩(wěn)定時間也有所增加，說明GOD的添加能明顯改善鰱魚酶解產(chǎn)物對面粉粉質(zhì)特性的不利影響。GOD是一種常見的面團(tuán)改良劑[34]，能產(chǎn)生H2O2將面團(tuán)中的自由巰基氧化成二硫鍵，促進(jìn)面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成，從而改善面粉的粉質(zhì)特性[35]。這也證實了鰱魚酶解產(chǎn)物中的還原性肽可能是改變面團(tuán)的流變性質(zhì)的主要因素，而通過添加氧化劑等方式可調(diào)控其負(fù)面影響。

3 結(jié) 論

鰱魚價格低廉，每年養(yǎng)殖產(chǎn)量約400萬 t，是最典型的大宗低值淡水魚，將其酶解后加工成抗凍劑是提升其附加值的重要途經(jīng)之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鰱魚酶解產(chǎn)物具有優(yōu)良的酵母菌抗凍保護(hù)活性，是一種潛在的冷凍面團(tuán)品質(zhì)改良劑。本研究將系列鰱魚酶解產(chǎn)物作為抗凍劑分別加入冷凍面團(tuán)中，面團(tuán)醒發(fā)時間、面包比容測定和電鏡觀察結(jié)果均證明了其良好的冷凍面團(tuán)抗凍保護(hù)活性，能改善4次凍融循環(huán)后面團(tuán)的發(fā)酵性能和焙烤特性。然而，鰱魚酶解產(chǎn)物組分復(fù)雜，其含有的某些還原性肽可能會給面團(tuán)面筋結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定帶來負(fù)面影響，從而導(dǎo)致面團(tuán)黏附性增加、韌性和拉伸強度減小，最終影響冷凍面團(tuán)及其產(chǎn)品的品質(zhì)。粉質(zhì)特性分析表明，添加酶解產(chǎn)物使面粉的吸水率、面團(tuán)形成和穩(wěn)定時間、粉質(zhì)指數(shù)顯著降低，弱化度顯著上升，而同時加入GOD能顯著改善面粉的粉質(zhì)特性，進(jìn)一步印證了酶解產(chǎn)物的還原性是損害面團(tuán)流變性質(zhì)的重要原因，也為后續(xù)定向調(diào)控酶解產(chǎn)物對冷凍面團(tuán)的改良作用提供了新思路。