陳玥彤，張閃閃，李文意，于文浩，趙曉芳，劉婷婷,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林省糧食精深加工與高效利用工程研究中心，吉林 長春 130118；3.吉林省糧食精深加工與副產(chǎn)物高效利用技術(shù)創(chuàng)新重點實驗室，吉林 長春 130118；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食用菌加工技術(shù)集成科研基地，吉林 長春 130118）

黑木耳（Auricularia auricula）是我國重要的藥食同源真菌，其中多糖為其主要的活性成分，高達70%以上[1]。相關(guān)研究表明黑木耳多糖具有抗氧化[2]、抗癌[3]、提高免疫[4]等多種功能活性，其生物活性取決于它們的結(jié)構(gòu)特征，包括單糖組成、糖苷鍵類型、分支結(jié)構(gòu)和構(gòu)象特征等[5]。目前相比于多糖的物理修飾，化學修飾（例如硫酸鹽修飾、磷酸鹽修飾、羧甲基修飾等）更能提高其生物活性[6]。其中磷酸化修飾是多糖支鏈結(jié)構(gòu)中羥基被游離的磷酸根基團取代的過程，由于磷酸根帶3個負電荷，通過增強多糖的電負性影響多糖的某些活性[7]。Chen Ling等[8]將南瓜多糖進行磷酸化修飾，發(fā)現(xiàn)磷酸化可使其體外抗氧化活性增強。Deng Chao等[9]報道磷酸化處理可擴展多糖的鏈構(gòu)象，明顯增強其抗腫瘤活性。此外，大量研究表明抗氧化活性往往與降血糖作用具有一定的相關(guān)性，對食用菌多糖進行磷酸化修飾有助于推動降血糖等諸多領(lǐng)域的應用。

調(diào)查顯示，我國目前有9 300萬糖尿病患者[10]。糖尿病是指一組以高血糖水平長期維持為特征的代謝性疾病[11]，市場上用于糖尿病的降糖藥物主要為雙胍類、阿卡波糖和沃格利波糖，這些藥物雖然可增加葡萄糖的儲存或抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性，但也有一定的副作用，如腸胃氣脹和腹瀉等[12]。相關(guān)研究表明，食用菌多糖是治療糖尿病的有效途徑。但有關(guān)磷酸化修飾多糖降血糖活性研究卻鮮有報道。因此，本實驗以黑木耳多糖為原料進行磷酸化修飾，并對其結(jié)構(gòu)及體外降血糖活性進行表征與評價，以期為黑木耳高值化利用和新型功能性食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳 吉林省博林生物科技有限公司；葡聚糖標準品 瑞典Pharmacia公司；α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 上海源葉生物科技有限公司；三偏磷酸鈉（sodium trimetaphosphate，STMP）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）、濃硝酸、三羥甲基氨基甲烷、鉬酸銨、無水乙醇、三氯甲烷等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IR Prestige-21傅里葉紅外光譜儀、SSE-550掃描電子顯微鏡 日本島津公司；UV210紫外-可見光分光光度計美國Unico公司；1515型高效液相色譜儀 美國Waters公司；AV600核磁共振儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳多糖的制備

稱取5 g 120 目黑木耳粉，料液比1∶70（g/g），高壓反應釜內(nèi)提取（1.0 MPa、110 ℃、60 min），離心，Sevag法脫蛋白（6次），經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白含量為5%以下時進行濃縮、醇沉、凍干即為黑木耳多糖，記為AAP。

1.3.2 磷酸化黑木耳多糖的制備

參照Duan Zhen等[13]的方法，略作修改。分別稱取5 g STPP、2 g STMP溶解于超純水中，配制70 mg/mL的磷酸化試劑。加入AAP 1 g、硫酸鈉5 g，溶解后調(diào)節(jié)pH值至9.0，分別在60、70、80、90 ℃反應5 h。樣液透析（8 000～14 000 Da）48 h后，濃縮凍干即為磷酸化黑木耳多糖，記為PAAP-1、PAAP-2、PAAP-3、PAAP-4。

1.3.3 磷酸化黑木耳多糖結(jié)構(gòu)測定

1.3.3.1 磷酸根含量的測定

采用鉬藍比色法[14]測定，取5 mL樣液通過標準曲線測定其磷酸根含量。

1.3.3.2 分子質(zhì)量測定

將2.0 mg/mL AAP及PAAP-（1～4）多糖溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，然后注入高效凝膠滲透色譜儀。測試條件：高效液相色譜儀Ultrahydrogel 500、Ultrahydrogel 2000色譜柱（7.8 mmh300 mm）；示差折光檢測器；流動相為0.1 mol/L超純水；流速0.5 mL/min；柱溫和檢測器溫度均為35 ℃，進樣量25 μL[15]。

1.3.3.3 單糖組成測定

多糖的衍生：將水解干燥后的AAP及PAAP-（1～4）加入1 mL吡啶，1 mL硅烷化試劑，于70 ℃恒溫干燥箱中反應30 min。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-17（30 mh0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度280 ℃，氫火焰離子化檢測器溫度300 ℃，載氣為氮氣，柱壓73.0 kPa，柱流量1.00 mL/min，分流比10∶1，進樣量1 μL[16]。

1.3.4 磷酸化多糖的結(jié)構(gòu)測定

1.3.4.1 紫外光譜分析

將AAP與PAAP-（1～4）分別配制成1 mg/mL溶液置于比色皿中，在190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描[17]。

1.3.4.2 剛果紅實驗

稱取5 mg多糖純品AAP、PAAP-（1～4）溶解于2 mL超純水中，取2 mL剛果紅（80 μmol/L）溶液與不同體積的1 mol/L NaOH溶液配制為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaOH溶液。采用紫外-可見光分光光度計在波長400～600 nm范圍內(nèi)記錄最大吸收波長[18]。

1.3.4.3 紅外光譜分析

分別稱取2 mg AAP及PAAP-（1～4）與200 mg烘干至恒質(zhì)量的KBr研磨均勻，壓片，收集范圍為4 000～400 cm-1的紅外光譜[19]。

1.3.4.4 掃描電鏡測定

取一定質(zhì)量的AAP及PAAP-（1～4）純品平鋪于導電膠，吹去未粘住的多糖粉末，放入離子濺射儀真空噴金30 s，再將樣品置于電子顯微鏡下（1h10-5Pa、20 kV）觀察，選取合適區(qū)域拍照[20]。

1.3.4.5 核磁共振波譜分析

取AAP及PAAP-（1～4）以D2O為溶劑加入到核磁管中，在600 MHz核磁共振譜儀上測定，探針溫度為60 ℃；掃描次數(shù)16次；空掃次數(shù)0次；脈沖角度30°；弛豫延遲時間1.0 s[21]。

1.3.5 磷酸化多糖體外降血糖活性測定

1.3.5.1 抑制α-淀粉酶活性

采用DNS比色法[22]測定，對AAP及PAAP-（1～4）進行α-淀粉酶抑制活性的測定，按式（1）計算抑制率：

式中：A0為以等體積蒸餾水取代待測溶液吸光度；A1為以等體積磷酸鹽緩沖液取代α-淀粉酶溶液吸光度；A2為以等體積蒸餾水和磷酸鹽緩沖液分別取代待測溶液和α-淀粉酶溶液吸光度。

1.3.5.2 抑制α-葡萄糖苷酶活性

參照張夢晴[23]的方法，對AAP及PAAP-（1～4）進行α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定，按式（2）計算抑制率：

式中：A1為樣品吸光度；A0為以磷酸鹽緩沖溶液代替多糖溶液的吸光度；A2為測定磷酸化黑木耳多糖溶液反應體系的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

結(jié)果以 fs表示，采用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸化多糖的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 黑木耳多糖磷酸根含量的測定結(jié)果

黑木耳多糖中磷酸根含量作為磷酸化修飾程度的評價指標，其生物活性取決于磷酸根含量的多少[24]。由表1可以看出，磷酸根含量隨反應溫度的升高逐漸遞增，在90 ℃時磷酸根質(zhì)量分數(shù)為8.49%。這是因為能量的升高會使高分子鍵的活性增強，磷酸化試劑的利用率也會隨之增加。

表1 不同溫度修飾下黑木耳多糖磷酸根含量Table 1 Phosphate contents of A.auricularia polysaccharides modified at different temperatures

2.1.2 相對分子質(zhì)量測定結(jié)果

多糖的生物活性與分子質(zhì)量之間相互關(guān)聯(lián)，因此對AAP及PAAP-（1～4）相對分子質(zhì)量進行測定。由表2可以看出，PAAP的相對分子質(zhì)量明顯低于AAP。低分子質(zhì)量多糖通過抑制腸道內(nèi)碳水化合物的降解對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用[25]，這也為修飾后黑木耳多糖降血糖活性升高提供理論依據(jù)。隨溫度升高磷酸化黑木耳多糖相對分子質(zhì)量明顯降低，其多分散指數(shù)接近1，說明AAP及PAAP的平均相對分子質(zhì)量分布集中，純度較高。

表2 AAP及PAAP-1、PAAP-2、PAAP-3、PAAP-4的高效凝膠滲透色譜測定結(jié)果Table 2 Results of HPGPC analysis of AAP, PAAP-1, PAAP-2,PAAP-3 and PAAP-4

2.1.3 磷酸化多糖的單糖組成

如圖1所示，利用高效液相色譜分析，與標準單糖衍生后的保留時間進行對比，AAP主要是由Rib、Fuc、Xyl、Fru、Man、Gal、Glu組成的雜多糖，其構(gòu)成單糖基的物質(zhì)的量比為0.6∶0.41∶1.1∶1.18∶19.72∶0.74∶18.09。PAAP-（1～4）主要由Fuc、Xyl、Fru、Man、Gal、Glu組成的雜多糖，雖其相互間具有相似的單糖組成，但構(gòu)成單糖基的物質(zhì)的量比有所差異，分別為0.57∶1.31∶1.31∶13.03∶1.18∶27.78（PAAP-1），0.27∶2.03∶2.14∶20.62∶0.57∶18.04（PAAP-2），0.43∶1.55∶2.01∶14.06∶0.73∶20.69（PAAP-3），0.36∶0.52∶1.42∶1.62∶20.35∶0.94∶22.88（PAAP-4）。

圖1 標準單糖（a）與AAP（b）、PAAP-1（c）、PAAP-2（d）PAAP-3（e）和PAAP-4（f）的色譜圖Fig.1 GC chromatograms of mixed standards of monosaccharides (a)as well as AAP (b), PAAP-1 (c), PAAP-2 (d), PAAP-3 (e), and PAAP-4 (f)

2.1.4 紫外光譜分析

圖2顯示AAP及PAAP-（1～4）在260 nm和280 nm波長處均無明顯的吸收峰，因此可以說明黑木耳多糖及磷酸化修飾多糖核酸和蛋白質(zhì)含量較低。黑木耳多糖經(jīng)修飾后形成了化學鍵束縛，從而導致紫外吸收強度有所減弱，其峰值明顯降低。

圖2 AAP及PAAP-（1～4）的紫外光譜掃描Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of AAP and PAAP-1, 2, 3 and 4

2.1.5 剛果紅實驗

剛果紅有序的螺旋構(gòu)象可與多糖結(jié)合形成絡(luò)合物，通過紫外-可見最大吸收波長是否紅移測定有無三股螺旋結(jié)構(gòu)。相關(guān)文獻表明，多糖的構(gòu)象以螺旋形式存在時，將發(fā)揮較為關(guān)鍵的功能活性，其螺旋結(jié)構(gòu)中存在的β-1,3-分支殘基，可提高抗氧化及抗腫瘤活性[26]。如圖3可知，AAP與剛果紅對照組相比無明顯差異，但多糖經(jīng)磷酸化修飾后，磷酸根發(fā)生了取代反應在低NaOH濃度下最大吸收波長極具增加，說明其發(fā)生了分子間作用力變化，具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。因此可以猜測，磷酸化黑木耳多糖與β-1,3-糖苷鍵形成三螺旋構(gòu)象時可提高多糖的生物活性，為后續(xù)體外降糖研究提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖3 不同NaOH濃度下剛果紅和AAP、PAAP-（1～4）紫外-可見光最大吸收波長變化Fig.3 Maximum absorption wavelengths of Congo red and AAP,PAAP-1, 2, 3 and 4 under different NaOH concentrations

2.1.6 紅外光譜分析

如圖4可以看出，AAP及PAAP吸收峰為典型的多糖吸收峰[27]，黑木耳多糖修飾前后主體結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。在3 336 cm-1處吸收峰主要是由OüH所引起，磷酸化修飾后吸收峰明顯增強，這是由于修飾后的氫鍵和主鏈長度被破壞，暴露出更多的氫鍵和烷基鍵。取代的磷酸根帶有2個—OH，增加了修飾后多糖的—OH個數(shù)，從而增加了其水溶性，使其具有更強的活性。2 921 cm-1附近處AAP及PAAP出現(xiàn)的中等強度吸收峰歸屬于CH2不對稱伸縮振動，1 617 cm-1處的弱吸收峰歸因于C＝O振動。不同的是磷酸修飾后多糖在1 205 cm-1附近處出現(xiàn)P＝O鍵的伸縮振動吸收峰，在898 cm-1附近處出現(xiàn)PüOüC鍵的特征吸收峰，這是由于羥基轉(zhuǎn)化為磷酸基團所導致，因此可以表明磷酸化多糖修飾成功。

圖4 AAP和PAAP-（1～4）的紅外光譜掃描Fig.4 IR spectra of AAP and PAAP-1, 2, 3 and 4

2.1.7 掃描電鏡分析

由圖5所示，AAP的主要形態(tài)為表面均勻的致密片層結(jié)構(gòu)，碎片大且平整光滑，無卷曲，部分出現(xiàn)堆積現(xiàn)象。這說明AAP的分子質(zhì)量偏大，形態(tài)均一，分子間作用力大。PAAP-（1～4）的掃描電鏡圖與AAP相比呈細小碎片狀，隨溫度的升高磷酸化多糖呈現(xiàn)蜷曲狀，說明其分子間作用力降低，氫鍵作用力減小與紅外推測相吻合。同時與黨參多糖修飾前表面光滑，有不規(guī)則和交錯的條紋，而修飾后表面粗糙不平，且有很多凸起的球體結(jié)果相似[28]。磷酸化修飾改變了多糖的空間形態(tài)，這與其與生理活性密切相關(guān)[29]。

圖5 AAP及PAAP-（1～4）掃描電鏡圖Fig.5 SEM micrographs of AAP and PAAP-1, 2, 3 and 4

2.1.8 核磁共振分析

PAAP-4的磷酸根含量較高，因此選取PAAP-4進行核磁測定。因磷酸鹽為弱電子吸收基團，磷酸化衍生物的13C核磁共振與非衍生多糖相似[30]。由圖6可以看出，AAP的C3、C5、C2、C4在δ69～76處，δ60.46為C6的化學位移，經(jīng)磷酸化修飾后，C6的化學位移向低場移動至δ69.27，這與碳信號附著在吸電子的磷酸基上時，會向低場移動結(jié)果一致。由此表明磷酸化修飾在C6位置上發(fā)生了取代反應。

圖6 AAP（A）與PAAP（B）13C核磁共振譜圖Fig.6 13C NMR spectra of AAP (A) and PAAP (B)

利用31P核磁共振進行譜圖分析，如圖7所示，相比AAP，PAAP在δ0.94、-8.19處出現(xiàn)新的信號峰，說明多糖中有2個不同位置的羥基被磷酸基取代，進一步驗證磷酸化修飾成功。

圖7 AAP（A）與PAAP（B）31P核磁共振譜圖Fig.7 31P NMR spectra of AAP (A) and PAAP (B)

2.2 磷酸化多糖體外降血糖活性

2.2.1α-淀粉酶抑制率

α-淀粉酶能夠催化淀粉、糖原和低聚糖α-1,4-糖苷鍵的水解，將二糖轉(zhuǎn)化為單糖，導致餐后血糖水平急劇升高[31]。由圖8可知，在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，PAAP-4和AAP的抑制率分別為41.08%和31.47%，PAAP-4較AAP的抑制率提高了10.03%，二者的IC50分別為5.835、3.038 mg/mL，可知同條件下，PAAP-4對α-淀粉酶的抑制能力達AAP樣液的1.92 倍?？捎行ㄟ^抑制α-淀粉酶活性從而抑制高聚糖的分解，達到降血糖目的[32]。

圖8 AAP及PAAP-（1～4）對α-淀粉酶的抑制率Fig.8 Inhibition rates of AAP and PAAPs on α-amylase

2.2.2α-葡萄糖苷酶抑制率

研究表明多糖與酶的結(jié)合導致α-葡萄糖苷酶的極性和分子構(gòu)象發(fā)生變化，部分酶活性喪失[32]。由圖9可知，隨著AAP及PAAP-（1～4）質(zhì)量濃度的升高，α-葡萄糖苷酶的抑制率也隨之增加。質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，PAAP-4和AAP的抑制率分別為56.89%和47.88%，PAAP-4較AAP的抑制率提高了9.01%，二者的IC50分別為27.22、10.66 mg/mL，可知同條件下，PAAP-4對α-葡萄糖苷酶的抑制能力達到AAP樣液的2.55 倍。

圖9 AAP及PAAP-（1～4）對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.9 Inhibitory effects of AAP and PAAPs on α-glucosidase

3 結(jié) 論

對加壓剪切聯(lián)合萃取的黑木耳多糖進行磷酸化修飾，當反應溫度為90 ℃修飾下磷酸根含量最高，為8.49%。紅外光譜顯示黑木耳多糖修飾后出現(xiàn)了磷酸基團的特征峰，修飾后多糖相對分子質(zhì)量明顯下降，剛果紅實驗表明修飾后黑木耳多糖出現(xiàn)三股螺旋結(jié)構(gòu)。核磁共振光譜分析結(jié)果表明磷酸化修飾主要發(fā)生在C6位的羥基上，且在δ0～1.5處出現(xiàn)了磷酸基團中P的信號峰。掃描電鏡顯示不同溫度下磷酸化多糖出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象，相比修飾前呈現(xiàn)細小碎片狀，與相對分子質(zhì)量結(jié)果相吻合。體外降糖實驗結(jié)果表明不同修飾后磷酸化多糖較未修飾前均具有更強的體外降血糖活性。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，PAAP-4活性最高且對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率分別為56.89%和41.08%。黑木耳多糖經(jīng)過磷酸化修飾后其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了衍生，磷酸化后的供氫能力增加從而降糖活性發(fā)生改變。以上為進一步研究磷酸化黑木耳多糖提供了理論依據(jù)，但目前磷酸化黑木耳多糖的降血糖作用機理還不明確，仍需進一步探討研究。