于飛?楊育華?趙陽(yáng)?通訊作者：黃天壬

摘要：目的：探究HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬的影響。方法：體外培養(yǎng)人肝癌 HepG2細(xì)胞;將HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為慢病毒空白載體（陰性對(duì)照）組、HBX-wt（野生型）組，HBX-A1762T/G1764A（實(shí)驗(yàn)）組。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)各組細(xì)胞 LC3B、P62、Beclin-1的表達(dá)情況;蛋白印跡分析法檢測(cè)各組細(xì)胞LC3B、Beclin-1、P62蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：與陰性對(duì)照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1基因表達(dá)水平升高（P <0.05），P62水平降低（P<0.05）;與陰性對(duì)照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高（P <0.05），P62蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。結(jié)論：HBV X區(qū) A1762T/G1764A雙突變可能調(diào)控了肝癌HepG2激活了細(xì)胞自噬的發(fā)生。HBV X區(qū) A1762T/G1764A突變可能是HBV所致HCC診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：肝癌，HBV，HBX 區(qū)A1762T/G1764A突變，自噬

【中圖分類號(hào)】R575 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2022）10--02

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC簡(jiǎn)稱肝癌）是世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在全球范圍內(nèi)，已有20多億人感染了乙肝病毒，全球HCC病例中大約53%與HBV感染有關(guān)[1]。一些報(bào)道也表明，乙肝病毒的遺傳特征，包括乙肝病毒的基因型和特定的基因突變，與肝細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)[2-5]。HBx由HBV的X開(kāi)放閱讀框編碼，在肝癌的發(fā)生過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明， HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變是肝細(xì)胞癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。HBV X 區(qū)的A1762T/G1764A突變?yōu)橛胁町惖臒狳c(diǎn)突變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。

自噬是一種保守的過(guò)程，通過(guò)這種過(guò)程，細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)包括錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器和各種入侵的病原體被移除，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[8]。有研究表明，HBx可以直接與第III類磷脂酰肌醇3-激酶I（PtdIns3K）結(jié)合，增強(qiáng)PtdIns3K的酶活性，并在Huh7.5細(xì)胞中誘導(dǎo)病毒DNA復(fù)制的自噬[9]。本研究在體外建立了人肝癌細(xì)胞HBX突變模型，以探討HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株自噬的影響，為肝癌治療提供可能的新靶點(diǎn)。

1 ? 材料與方法

1.1主要材料與試劑

人肝癌HepG2細(xì)胞株，課題組前期購(gòu)買。特級(jí)澳洲胎牛血清、DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)基：美國(guó)Gbico公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及qRT-PCR試劑盒：日本TaKaRa 公司。慢病毒表達(dá)載體HBX-A1762T/G1764A突變組、HBx野生型組、陰性對(duì)照組。HBX、PI3K、AKT、mTOR基因引物：上海生工生物工序股份有限公司。乙型肝炎病毒X多克隆抗體：美國(guó)Abcam公司。beta-Actin Rabbit mAb、LC3B Rabbit mAb、P62 Rabbit mAb、Beclin-1 Rabbit mAb：美國(guó)CST公司。

1.2 ?細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染

HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞密度約為30%-50%時(shí)，按慢病毒使用說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組：（1）轉(zhuǎn)染慢病毒空白載體的陰性對(duì)照組（NC），轉(zhuǎn)染含HBX野生基因型序列的野生型組（WT），轉(zhuǎn)染含HBX野生基因序列發(fā)生A1762T/G1764A位點(diǎn)聯(lián)合突變的實(shí)驗(yàn)組（EG）。

1.3 ?RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBX、LC3B、P62、Beclin-1的表達(dá)

按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，然后按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 °C變性10min，60°C退火 30s、72 °C延伸 40min，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算HBX、LC3B、P62、Beclin-1表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

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1.4 ?Western blot檢測(cè)HBx、LC3B、P62、Beclin-1蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白。取30μg蛋白樣品行SDS?PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、快速封閉液封閉后，加入一抗HBx、LC3B、P62、Beclin-1、β-actin （1∶1 000），4℃搖床孵化過(guò)夜;次日洗膜后加入1∶2000稀釋的山羊抗兔IgG作為二抗，室溫孵化1 h，TBST洗滌后，加入ECL顯色發(fā)光，凝膠成像儀成像。以為β-actin內(nèi)參，Image J軟件測(cè)定蛋白灰度值，計(jì)算各組各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 8.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行繪圖，計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 描述，多組間比較使用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行LSD-t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?HepG2細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染驗(yàn)證

將提取的總蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果如圖1所示：陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)任何條帶，而HBX-wt、HBX-A1762T/G1764A組在相對(duì)分子質(zhì)量約為17KD處存在顯著條帶，見(jiàn)圖1。以上結(jié)果說(shuō)明成功構(gòu)建了HepG2細(xì)胞模型。

2.2 ?HBX突變對(duì)HepG2細(xì)胞LC3B、P62、Beclin-1基因表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞LC3B、Beclin-1基因表達(dá)水平升高（P <0.05），P62基因表達(dá)水平降低（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3 ?HBX A1762T/G1764A突變對(duì)HepG2細(xì)胞LC3B、P62、Beclin-1蛋白表達(dá)情況的影響

與陰性對(duì)照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高（P <0.05），P62蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

3 ?討論

乙肝病毒感染仍然是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在世界范圍內(nèi)造成顯著的發(fā)病率和死亡率。約20億人，即世界人口的三分之一，有過(guò)去或現(xiàn)在感染過(guò)乙肝病毒的血清學(xué)證據(jù)，目前約有3.5億人持續(xù)感染[2]。慢性乙肝可導(dǎo)致慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬變和肝癌[3]。因此，探究HBV在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上尋找有效的措施防治HCC尤為重要。

自噬是一種分解代謝過(guò)程，通過(guò)引導(dǎo)陳舊/受損的細(xì)胞器（如線粒體）、蛋白質(zhì)聚集體和病原體進(jìn)行溶酶體降解來(lái)維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。溶酶體分解的產(chǎn)物（例如氨基酸和脂肪酸）被回收，并通過(guò)溶酶體膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。這些代謝物可以在蛋白質(zhì)和三磷酸腺苷的生產(chǎn)中重復(fù)使用[10]。在新陳代謝壓力或營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足的時(shí)期，自噬迅速上調(diào)，以維持能量生產(chǎn)，并為基本的細(xì)胞功能提供基石。同樣，缺乏葡萄糖或氨基酸或暴露在低氧環(huán)境中的細(xì)胞依賴自噬生存[11-12]。自噬缺陷導(dǎo)致蛋白質(zhì)在肝臟中積累，導(dǎo)致肝臟腫大、肝細(xì)胞死亡和肝功能衰竭[13]。HBV感染能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬反應(yīng)，但誘導(dǎo)自噬反應(yīng)的關(guān)鍵位點(diǎn)及具體是抑制還是激活作用目前處于探索之中。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組、HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組HepG2細(xì)胞LC3B、Beclin-1基因表達(dá)水平升高（P <0.05），P62基因表達(dá)水平降低（P<0.05）。與此同時(shí)HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高（P <0.05），P62蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。提示HBX的A1762T/G1764A雙突變可能在HepG2細(xì)胞的自噬過(guò)程中起到促進(jìn)作用，從而在HBV所致的HCC中起到了一定的作用。

綜上所述 HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變可能通過(guò)促進(jìn)HepG2細(xì)胞的自噬，影響了肝癌細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)功能，從而可能促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。

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基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金資助（編號(hào)：2019GXNSFDA245001）