顏仁梁， 夏 黎， 周?chē)?guó)洪， 沈小鐘

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院， 廣州 510520)

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是指冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生急性狹窄和閉塞，引起心肌細(xì)胞缺血缺氧及壞死。隨著飲食結(jié)構(gòu)和快節(jié)奏的生活壓力，AMI發(fā)病率逐年攀升，且年輕人的發(fā)病比例越來(lái)越高[1]。AMI是由多種信號(hào)途徑參與調(diào)控的復(fù)雜病理過(guò)程，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)經(jīng)典的心血管疾病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因子[2]。生長(zhǎng)分化因子-15(Growth Differentiation Factor-15，GDF-15)屬GDFs家族，是TGF-β(Transforming Growth Factor-β)超家族的一份子[3]。已有研究表明：GDF-15與腫瘤、妊娠、神經(jīng)元損傷等多種疾病均相關(guān)[4-5]；GDF-15能夠修復(fù)缺血/再灌注損傷后的心肌，且在臨床研究中作為多種心源性疾病的診斷和預(yù)后指標(biāo)[1]；GDF-15在脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡抑制等方面發(fā)揮積極作用[6]；GDF-15可激活磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號(hào)通路(PI3K/Akt信號(hào)通路)，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的抗凋亡過(guò)程，發(fā)揮降低心肌細(xì)胞的氧化損傷的作用[7-8]。簡(jiǎn)而言之，GDF-15是心肌缺血再灌注損傷機(jī)制中的一個(gè)重要的保護(hù)性因子。

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一類(lèi)主要存在于百合科、蓼科和豆科等多種藥用植物中的一種多酚類(lèi)化合物，具有抗心肌缺血、抗氧化、抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎和抗腫瘤等生物活性[9-11]。已有研究[12]表明：白藜蘆醇通過(guò)激活PI3K/Akt通路來(lái)抑制AMI大鼠的心肌細(xì)胞線粒體凋亡作用。但白藜蘆醇是否能夠通過(guò)對(duì)上游的GDF-15的上調(diào)來(lái)激活PI3K/Akt通路，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，目前尚不明確。本研究旨在考察白藜蘆醇通過(guò)對(duì)GDF-15的上調(diào)來(lái)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，從而調(diào)控線粒體介導(dǎo)的抗凋亡機(jī)制，為白藜蘆醇對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用機(jī)制闡述提供研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD健康雄性大鼠60只，體質(zhì)量200±10 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2013-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為NO44007200014522。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施使用許可證號(hào)為SYXK(粵)2010-0059,保持室溫22～25 ℃、相對(duì)濕度60%～70%,自由進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)，所有操作均嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 藥物與試劑 氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、RIPA裂解液購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司，白藜蘆醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)購(gòu)自天津市紅橋區(qū)波蘭聽(tīng)生物試劑經(jīng)營(yíng)部，普萘洛爾購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，肌酸激酶(CK-MB)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司，總蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，GDF-15、PI3K、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)由浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠提供，蛋白電泳系統(tǒng)和酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)Bio-rad公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)科俊儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心肌缺血再灌注(I/R)模型制備 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，吸入異氟烷致大鼠深度麻醉，仰臥位固定。于心前區(qū)第3、4肋間橫向開(kāi)胸，肺動(dòng)脈圓錐與左心耳下約1 mm處采用5-0手術(shù)縫合線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，迅速將心臟沿肋間間隙放回胸腔，迅速擠出胸腔內(nèi)空氣，逐層縫合胸壁肌肉、皮膚。40 min后松開(kāi)結(jié)扎線再灌注2 h。

1.2.2 分組與給藥 60只SD大鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥普萘洛爾組、白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇中劑量組和白藜蘆醇高劑量組。陽(yáng)性藥普萘洛爾組術(shù)前2 h單次灌胃給予 1 mg/kg普萘洛爾；白藜蘆醇低、中、高劑量組分別按10、20、30 mg/kg的劑量每天單次灌胃，連續(xù)給藥7天；假手術(shù)組給予與模型組等體積的生理鹽水。第7天各組均按“1.2.1”中方法制備I/R大鼠模型，其中假手術(shù)組僅進(jìn)行開(kāi)胸、縫合處理。

1.2.3 血清酶學(xué)指標(biāo)測(cè)定 各組SD大鼠心肌缺血再灌注4 h后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血4 mL，以4 500 r/s離心5 min分離血清，-20 ℃保存待測(cè)。采用紫外分光光度計(jì)，分別按照乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法檢測(cè)LDH、CK-MB、SOD活力和MDA含量。

1.2.4 梗死范圍考察 取血后迅速摘取大鼠心臟，生理鹽水洗凈殘血，濾紙吸干，稱(chēng)全心質(zhì)量。心臟組織垂直其長(zhǎng)軸水平切片，每片厚12 mm，置入NBT溶液(pH 7.4)中37 ℃孵育15 min，壞死區(qū)域(Necrotic Zone，NZ)呈暗藍(lán)色，非壞死區(qū)域(None-crotic Zone，NNZ)呈暗紅色，將NZ和NNZ分離，濾紙吸干，梗死區(qū)域置于電子天平上稱(chēng)質(zhì)量。計(jì)算心肌梗死率(心肌梗死率=(梗死心肌質(zhì)量/全心質(zhì)量)×100%)。

1.2.5 大鼠心肌組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting):用RIPA裂解液從心肌組織勻漿中提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜浸泡于脫脂牛奶中，室溫密封4 h，加入1∶1 000的GDF-15、PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9一抗，4 ℃過(guò)夜，加入1∶500的GDF-15、PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9二抗，室溫孵育1.5 h，顯影。以β-actin作為內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌梗死率的影響

由6個(gè)實(shí)驗(yàn)組的急性心肌缺血大鼠的心臟染色和心肌梗死率(圖1)可知：模型組大鼠心臟的梗死率為34.69%，與假手術(shù)組相比呈極顯著增加(P<0.01)；給予陽(yáng)性藥普萘洛爾1 mg/kg后，急性心肌缺血大鼠的心肌梗死率下降至25.15%，與模型組相比呈顯著性差異(P<0.05)；分別給予白藜蘆醇低、中、高劑量后，各組心肌梗死率分別為32.36%、30.53%和24.94%，其中與模型組相比，白藜蘆醇高劑量組的心肌梗死率呈顯著性減少(P<0.05)。

2.2 白藜蘆醇對(duì)急性心肌梗死大鼠血清酶學(xué)指標(biāo)的影響

由表1可知：與假手術(shù)組相比，模型組I/R大鼠血清的CK-MB、LDH活力和MDA含量升高，SOD活力下降，與假手術(shù)組比較呈顯著性差異(P<0.01)；分別給予1 mg/kg普萘洛爾和各劑量的白藜蘆醇后，陽(yáng)性藥普萘洛爾組和白藜蘆醇中、高劑量組均不同程度降低CK-MB、LDH活力，抑制MDA生成并提高SOD活力(P<0.05，P<0.01)，且呈良好的劑量依賴(lài)關(guān)系。

圖1 白藜蘆醇對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死率的影響±s)

表1 白藜蘆醇對(duì)缺血再灌注大鼠血清中CK-MB、LDH、SOD活力和MDA含量的影響±s)

2.3 白藜蘆醇對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織GDF-15和PI3K/Akt相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖2可知：(1)Akt在各組間的表達(dá)無(wú)顯著差異。(2)與假手術(shù)組相比，模型組GDF-15的相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.01)，且PI3K和p-Akt的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，白藜蘆醇中、高劑量組GDF-15的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，白藜蘆醇高劑量組的PI3K和p-Akt的相對(duì)表達(dá)量也顯著升高(P<0.05)。

圖2 白藜蘆醇對(duì)缺血再灌注大鼠心肌組織的GDF-15、PI3K和p-Akt相對(duì)表達(dá)量的影響±s)

2.4 白藜蘆醇對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖3可知：與假手術(shù)組相比，模型組的Bax、caspase-3和caspase-9的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性藥普萘洛爾組和白藜蘆醇高劑量組顯著抑制Bax、caspase-3和caspase-9的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，白藜蘆醇高劑量組Bax/Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量比值顯著下降(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。

3 討論

心肌梗死是急性心臟損傷最常見(jiàn)的致病原因之一，臨床具有發(fā)病急、進(jìn)展快、病死率高和預(yù)后差異大等特點(diǎn)[13]。雖然近年來(lái)對(duì)心肌梗死的治療方案有較大進(jìn)展，但是，心肌梗死后血液再灌注導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞二次損傷的情況仍難以緩解，因此，減少I(mǎi)/R對(duì)心肌細(xì)胞的二次損傷在臨床治療心肌梗死和提高預(yù)后中具有重要意義[14]。白藜蘆醇具有多種生化和生理作用，包括抗血小板、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡和抗炎作用，對(duì)心肌細(xì)胞改善和心臟功能恢復(fù)具有良好的保護(hù)作用[15]。為了進(jìn)一步考察白藜蘆醇對(duì)I/R大鼠心肌的保護(hù)作用，本研究采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支再灌注的方法構(gòu)建I/R模型。研究結(jié)果顯示：結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支2 h再灌注4 h后，NBT染色結(jié)果表明I/R大鼠心肌梗死率顯著升高；血清酶學(xué)發(fā)現(xiàn)I/R大鼠血清的CK-MB、LDH活性和MDA含量顯著上升，SOD活性顯著下降，提示造模后CK-MB、LDH和MDA大量外流至外周血中，心肌細(xì)胞受到損傷，表明I/R模型構(gòu)建成功。通過(guò)給予Res后，與模型組比較，I/R大鼠心肌梗死率顯著下降，且CK-MB、LDH活性和MDA含量顯著下降，SOD活性顯著上升，驗(yàn)證了Res對(duì)I/R大鼠的心肌保護(hù)作用。

圖3 白藜蘆醇對(duì)缺血再灌注大鼠心肌組織的Bax/Bcl-2和caspase蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響±s)

GDF-15主要通過(guò)調(diào)節(jié)器官生長(zhǎng)、分化及組織修復(fù)等發(fā)揮抗炎、抗細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)效應(yīng)[16]。已有研究表明GDF-15具有心血管保護(hù)功能：GDF-15在正常的心肌細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，當(dāng)心肌出現(xiàn)急慢性炎癥、心肌缺血缺氧、心肌再灌注損傷等病理情況時(shí)，GDF-15會(huì)被內(nèi)源性因子誘導(dǎo)而表達(dá)水平明顯升高[17];在I/R動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，與野生型正常小鼠相比，GDF-15表達(dá)缺陷的小鼠的心肌梗死范圍擴(kuò)大，心肌細(xì)胞凋亡增加，而給予重組的GDF-15可有效減少心肌細(xì)胞凋亡[18]；GDF-15的表達(dá)對(duì)于改善心肌缺血的預(yù)后具有正向作用[19]； PI3K/Akt是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要通路，可通過(guò)調(diào)控下游的Bcl-2、Bax、caspase等多種靶蛋白，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[20]；在心肌細(xì)胞缺血或I/R后，PI3K/Akt通路被抑制，而線粒體凋亡可通過(guò)PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)，參與I/R后心肌細(xì)胞凋亡[21]。越來(lái)越多的研究表明：GDF-15可通過(guò)激活PI3K/Akt通路來(lái)抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[22]；GDF-15能通過(guò)激活PI3K及下游信號(hào)分子抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[23]；過(guò)表達(dá)的GDF-15通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，作為新穎的信號(hào)通路在心肌保護(hù)中發(fā)揮重要的作用[24]。

4 結(jié)論

本研究表明，Res可顯著提升GDF-15在I/R大鼠心肌細(xì)胞的過(guò)表達(dá)，進(jìn)一步激活PI3K/Akt通路，抑制Bax/Bcl-2、caspase-9和caspase-3的蛋白表達(dá)并促進(jìn)Bcl-2的蛋白表達(dá)，提示Res可能通過(guò)過(guò)表達(dá)GDF-15來(lái)促進(jìn)PI3K和Akt磷酸化，抑制線粒體凋亡途徑。