朱健 吉兆奕 焦擁政 朱曉云 曹 袁國(guó)興 吳潔

惡病質(zhì)是各種惡性腫瘤尤其是晚期患者的主要并發(fā)癥，是造成死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重影響患者的生存期及生活質(zhì)量，預(yù)后差[1]。晚期腫瘤患者約50%～80%存在厭食和體重下降等惡病質(zhì)的表現(xiàn)[2]，且進(jìn)行性的腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)預(yù)后不佳，存活時(shí)間短，占所有癌癥死亡的近20%[3]。目前臨床尚缺乏合理的治療策略，尚無單一性、特異性的療效確切的藥物[4]。

中醫(yī)學(xué)雖無惡病質(zhì)病名，但其以納呆食少、倦怠乏力、消瘦等一系列臟腑虛損癥狀為主要臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)“虛勞”范疇[5]。中醫(yī)認(rèn)為脾為后天之本、氣血生化之源，從脾論治虛勞最早見于《金匱要略》，而脾虛也是腫瘤發(fā)病的基礎(chǔ)[6]。四君子湯是中醫(yī)治療脾胃氣虛的經(jīng)典方劑，近年研究文獻(xiàn)提示四君子能夠改善腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)，與抑制炎癥因子有關(guān)[7]，而具體機(jī)制未詳細(xì)闡明?；诖?，本課題組建立C57小鼠肺癌惡病質(zhì)模型，觀察四君子湯改善C57小鼠惡病質(zhì)狀態(tài)肌肉消耗的療效及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)近交系6～7周C57BL/6小鼠24只，雌雄各半，體質(zhì)量18～24 g，購(gòu)自中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院藥品鑒定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK京20000010號(hào))。

1.2 細(xì)胞株及種瘤方法

Lewis鼠源肺癌細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供。癌細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期更換，約3～4日待細(xì)胞鋪滿瓶底胰酶消化后，用PBS配置為1×107/mL細(xì)胞懸液。使用隨機(jī)數(shù)字表法選取18只小鼠，采用1 mL注射器抽取0.2 mL細(xì)胞懸液注入小鼠右腋皮下，7天后皮下可觸及瘤體，成瘤18只。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

四君子湯組方為：黨參、白術(shù)、茯苓、甘草(批號(hào)分別為：21081501、21100904、21072002、21082301，均由康美智慧藥房連鎖有限公司提供)，以9∶9∶9∶6配比，藥材由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院中藥房提供并煎湯取汁。醋酸甲地孕酮分散片(青島國(guó)海生物制藥有限公司，規(guī)格：40 mg，生產(chǎn)批號(hào)：16110502)，研磨杵研磨藥片，生理鹽水溶解，按照0.024 g/kg給藥。

1.4 主要試劑與儀器

兔來源一抗Activin-A、Myostatin、MuRF1及二抗均購(gòu)于中國(guó)ABclonal公司(生產(chǎn)批號(hào)：RP02516、A6913、A3101)，Western Blot相關(guān)試劑盒購(gòu)于中國(guó)Solarbio公司(生產(chǎn)批號(hào)：P1200、P1010)，人活化素A(Activin-A)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒分別購(gòu)于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司、武漢云克隆科技股份有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：YM-1058B、SEA133Ra)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

按照隨機(jī)數(shù)字表將上述成模的18只小鼠再次分為模型組、四君子組、地屈孕酮組，每組6只。此外，正常組為6只。其中四君子組以5倍臨床等效劑量，從接種第2日起開始灌胃，藥物濃度1 g/mL，每日1次灌胃，每次0.3 mL；模型組與正常組自接種第2日開始給予同等劑量的生理鹽水灌胃；地屈孕酮組從接種第2日開始每天給予甲地孕酮溶液，按照0.024 g/(kg·d)給藥，每天灌胃1次。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 動(dòng)態(tài)觀察小鼠進(jìn)食量和體質(zhì)量 給藥2周后處死動(dòng)物，眼球取血，分離血清，解剖留取動(dòng)物皮下腫瘤、脾臟、肝臟、腓腸肌標(biāo)本，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑，并稱取質(zhì)量，計(jì)算腫瘤及臟器指數(shù)(臟器質(zhì)量/體質(zhì)量)。

1.6.2 透射電鏡觀察肌纖維形態(tài) 取1 cm3骨骼肌組織若干塊，經(jīng)過乙醇梯度脫水、包埋切片染色等處理，置于JEOL-3010透射電子顯微鏡下觀察骨骼肌結(jié)構(gòu)，并用相機(jī)記錄。

1.6.3 檢測(cè)血液中炎癥因子水平 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)檢測(cè)血清TNF-α、Activin-A水平，按ELISA試劑盒說明書操作。

1.6.4 蛋白免疫印跡(Western Blot)法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)肌萎縮基因Myostatin、Activin-A、MuRF-1表達(dá)水平 取惡病質(zhì)小鼠骨骼肌組織2 mm3，加入裂解液及蛋白磷酸酶抑制劑，于超聲勻漿中提取蛋白，在4℃，12 000r/min條件下離心5分鐘，取上清后使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)過SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入抗體Myostatin、Activin-A、MuRF-1，4℃條件下孵育過夜，在漂洗、二抗孵育、洗膜等操作后，將PVDF膜浸泡于電化學(xué)發(fā)光顯色成圖。

取惡病質(zhì)小鼠骨骼肌組織，按照10～20 mg組織加入300 μL裂解液，進(jìn)行勻漿處理，按照RNA提取試劑盒的操作要求提取RNA，在納滴儀上檢測(cè)核酸濃度并確定無雜質(zhì)，配置20 μL反應(yīng)體系將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，配置20 μL熒光PCR反應(yīng)體系，使用StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線，輸出數(shù)據(jù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 四君子湯對(duì)肺癌惡病質(zhì)小鼠體質(zhì)量、腫瘤直徑、腫瘤質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組和地屈孕酮組相比，四君子組瘤體質(zhì)量降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺癌惡病質(zhì)小鼠體質(zhì)量、腫瘤直徑、腫瘤質(zhì)量比較

2.2 四君子湯對(duì)肺癌惡病質(zhì)小鼠脾臟、肝臟質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響

正常組無肝脾腫大現(xiàn)象發(fā)生，而肺癌惡病質(zhì)小鼠均有肝脾腫大現(xiàn)象發(fā)生。在脾臟質(zhì)量上，四君子組與模型組、地屈孕酮組差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。而對(duì)于肝臟質(zhì)量，與四君子組相比，模型組、地屈孕酮組肝臟質(zhì)量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組肺癌惡病質(zhì)小鼠脾臟、肝臟質(zhì)量及臟器指數(shù)比較

2.3 四君子湯對(duì)肺癌惡病質(zhì)小鼠骨骼肌(腓腸肌、比目魚肌、脛前肌)質(zhì)量及指數(shù)的影響

對(duì)腓腸肌進(jìn)行解剖、剝離、稱重，發(fā)現(xiàn)荷瘤各組小鼠與正常組比較，肌肉質(zhì)量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，四君子湯能夠改善骨骼肌的絕對(duì)質(zhì)量(P<0.05)，地屈孕酮組無顯著改變，四君子組較模型組骨骼肌/體質(zhì)量指數(shù)有升高的趨勢(shì)。見表3。

2.4 四君子湯對(duì)肺癌惡病質(zhì)小鼠骨骼肌纖維形態(tài)學(xué)的影響

各組小鼠腓腸肌纖維橫截面切片經(jīng)蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，在電鏡下可觀察到正常組小鼠腓腸肌紋路清晰，骨骼肌細(xì)胞排列緊密，呈圓形或多邊形，細(xì)胞核多位于細(xì)胞周邊，與細(xì)胞膜接近，細(xì)胞核被染成紫色，細(xì)胞質(zhì)被染成粉紅色。惡病質(zhì)小鼠腓腸肌肌細(xì)胞排列疏松，肌纖維細(xì)胞縮小，細(xì)胞間隙增大，肌纖維細(xì)胞大小差異較大，說明惡病質(zhì)模型的腓腸肌存在明顯萎縮現(xiàn)象。四君子湯能明顯改善骨骼肌萎縮的癥狀。見圖1。

注：A 正常組；B 模型組；C 地屈孕酮組；D 四君子組。

表3 各組肺癌惡病質(zhì)小鼠腓腸肌質(zhì)量及指數(shù)比較

2.5 四君子湯對(duì)肺癌惡病質(zhì)小鼠血清TNF-α、Activin-A含量的影響

惡病質(zhì)模型組和四君子組小鼠血清中TNF-α含量、Activin-A較正常組明顯升高(P<0.05)，提示接種肺癌細(xì)胞的各組存在血清TNF-α、Activin-A的高表達(dá)(P<0.05)。地屈孕酮組和四君子組Activin-A表達(dá)水平與模型對(duì)照組相比，存在不同程度降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組肺癌惡病質(zhì)小鼠血清TNF-α、Activin-A含量比較

2.6 四君子湯對(duì)肺癌惡病質(zhì)小鼠肌萎縮相關(guān)基因表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組腓腸肌中Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA存在高表達(dá)(P<0.01)。四君子組的Activin-A表達(dá)水平與模型組相比明顯降低(P<0.05)；在Myostatin表達(dá)上，地屈孕酮組和四君子組較模型組顯著降低(P<0.01)；在MuRF1的表達(dá)上，四君子組與模型組相比明顯降低(P<0.05)，而地屈孕酮組與模型組相比顯著降低(P<0.01)。見表5。

表5 各組肺癌惡病質(zhì)小鼠腓腸肌中Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA表達(dá)比較

2.7 四君子湯對(duì)肺癌惡病質(zhì)小鼠肌萎縮相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

模型組小鼠肌萎縮相關(guān)蛋白Activin、Myostatin、MuRF1的表達(dá)顯著升高。與模型組比較，四君子湯顯著降低肌萎縮相關(guān)蛋白Activin-A的表達(dá)，結(jié)果與mRNA表達(dá)結(jié)果一致。說明四君子湯可能通過Myostatin/Actvin-ActRIIB信號(hào)途徑抑制肺癌惡病質(zhì)小鼠骨骼肌萎縮。而Myostatin、MuRF1蛋白表達(dá)結(jié)果與mRNA表達(dá)存在不完全一致的現(xiàn)象，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。見圖2。

注：A 正常組；B 模型組；C 地屈孕酮組；D 四君子組

3 討論

腫瘤惡病質(zhì)是中晚期腫瘤患者的常見臨床表現(xiàn)，以短期內(nèi)體重嚴(yán)重下降、肌肉組織(伴或不伴脂肪組織)進(jìn)行性消耗為顯著特征，同時(shí)伴有厭食、水腫、貧血、多器官功能衰竭等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，縮短患者的生存時(shí)間[4]。研究結(jié)果表明，四君子組的腫瘤平均直徑相較于地屈孕酮組和模型組顯著縮小，同時(shí)四君子組的腓腸肌質(zhì)量相較于模型組與地屈孕酮組有一定的增加，在改善肝腫大現(xiàn)象上優(yōu)于地屈孕酮組，在腓腸肌的電鏡圖上顯示四君子組腓腸肌紋路相對(duì)清晰，骨骼肌細(xì)胞排列相對(duì)緊密，提示四君子湯能夠在改善小鼠腫瘤惡病質(zhì)方面效果優(yōu)于地屈孕酮。

四君子湯改善骨骼肌萎縮癥狀可能通過改善小鼠靜息能量消耗情況從而逆轉(zhuǎn)小鼠體內(nèi)能量負(fù)平衡代謝狀態(tài)，一定程度上相對(duì)地提高骨骼肌質(zhì)量。在能量消耗方面，人體內(nèi)分為兩種消耗方式，包括靜息能量消耗和活動(dòng)能量消耗及飲食生熱。而靜息能量消耗占人體消耗總能量的比值為60%～70%[8]，占人體能量消耗的主要部分。而在靜息能量消耗中，又以肝臟、大腦、心臟占靜息能量消耗的58%[9]，相反，骨骼肌能量消耗僅為22%[10]。肝臟是小鼠質(zhì)量最大的臟器，與小鼠能量代謝和線粒體中解偶聯(lián)蛋白息息相關(guān)[11]。本研究結(jié)果表明，相較于地屈孕酮，四君子組能夠明顯改善肝腫大現(xiàn)象。

四君子湯通過抗炎作用改善腫瘤惡病質(zhì)骨骼肌萎縮狀態(tài)。在惡病質(zhì)肌肉萎縮眾多調(diào)控因素中，炎性反應(yīng)也起著重要的作用[12]。蛋白質(zhì)的分解增加和合成減少引起骨骼肌萎縮，最終形成腫瘤惡病質(zhì)，而Activin A是腫瘤患者生存期縮短的預(yù)期指標(biāo)。在骨骼肌中，Activin A和Myostatin的受體activin receptor ⅡB(ActRⅡB)能夠?qū)е耂mad2/3磷酸化及FOXO基因的去磷酸化，磷酸化的Smad2/3能夠下調(diào)與肌肉分化相關(guān)的基因[13]，還能抑制蛋白合成途徑AKT-mTOR[14]；而另一方面，磷酸化的Smad2/3和去磷酸化FOXO還能誘導(dǎo)MURF1和Atrogin-1基因的激活[15]，這兩種蛋白能夠促進(jìn)骨骼肌中肌原纖維蛋白的降解，從而促進(jìn)了骨骼肌的能量消耗。而TNF-α等炎癥因子水平升高，也與腫瘤相關(guān)性厭食等有關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn)肌萎縮時(shí)確實(shí)存在很多細(xì)胞因子的表達(dá)，其中TNF-α通過其信號(hào)通路可最終導(dǎo)致MuRF-1表達(dá)，并引起肌肉蛋白的降解[17]。TNF-α還可抑制肌肉分化生長(zhǎng)因子mRNA水平，導(dǎo)致骨骼肌的分化中斷，影響受損肌肉組織的修復(fù)，促進(jìn)腫瘤惡病質(zhì)的進(jìn)展[18]。因此，Activin A和TNF-α水平的升高與腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)密切相關(guān)。四君子組小鼠血清中Activin A較模型組和地屈孕酮組明顯降低，說明四君子組在降低Activin A水平方面明顯優(yōu)于地屈孕酮。

四君子湯通過干預(yù)Myostatin/Actvin-ActRIIB信號(hào)途徑調(diào)控骨骼肌肌肉消耗。肌肉組織是人體最主要的蛋白質(zhì)—能量?jī)?chǔ)備庫(kù)，在禁食、饑餓、各種疾病消耗狀態(tài)時(shí)，機(jī)體動(dòng)員蛋白質(zhì)分解以應(yīng)對(duì)能量需求及合成新的蛋白質(zhì)。在這種代謝狀態(tài)下，肌蛋白合成減少而分解增加，使機(jī)體骨骼肌肌肉量丟失，導(dǎo)致骨骼肌消耗。晚期腫瘤患者臨床表現(xiàn)為體質(zhì)量丟失、骨骼肌萎縮、低蛋白血癥、內(nèi)臟蛋白消耗、蛋白質(zhì)合成減少和分解增加、蛋白轉(zhuǎn)化率升高、血漿氨基酸譜異常以及機(jī)體呈現(xiàn)負(fù)氮平衡等，都證實(shí)骨骼肌蛋白質(zhì)分解旺盛是腫瘤惡病質(zhì)的主要代謝特點(diǎn)，骨骼肌消耗是引起腫瘤蛋白質(zhì)—能量消耗性營(yíng)養(yǎng)不良的中心環(huán)節(jié)，是最終引起惡病質(zhì)的決定因素[19]。無論是臨床還是實(shí)驗(yàn)研究，均提示多種復(fù)雜因素參與腫瘤性骨骼肌消耗，近年來比較關(guān)注基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平對(duì)骨骼肌蛋白合成/分解的調(diào)控機(jī)制[20]。Myostatin/Actvin-ActRIIB信號(hào)途徑是肌肉消耗的一條重要通路。MuRF1是肌肉細(xì)胞特異性泛素蛋白連接酶，在骨骼肌細(xì)胞核中特異表達(dá)，是蛋白質(zhì)降解的相關(guān)基因，并涉及肌肉應(yīng)答和收縮調(diào)節(jié)的各個(gè)方面，過度表達(dá)后在骨骼肌M線處與粗肌絲連接蛋白結(jié)合，破壞粗絲聯(lián)接蛋白的亞結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致粗絲聯(lián)接蛋白的降解[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肺癌惡病質(zhì)小鼠肌萎縮相關(guān)基因表達(dá)中，四君子湯能夠明顯降低Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA表達(dá)，其中降低血清Myostatin mRNA的表達(dá)更顯著。四君子湯顯著降低肌萎縮相關(guān)蛋白Activin-A的表達(dá)，結(jié)果與mRNA表達(dá)結(jié)果一致。而Myostatin、MuRF1蛋白表達(dá)結(jié)果與mRNA表達(dá)存在不完全一致的現(xiàn)象，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

如何預(yù)防和逆轉(zhuǎn)腫瘤惡病質(zhì)的發(fā)生發(fā)展，目前臨床上尚缺乏有效手段。針對(duì)骨骼肌消耗性營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)病機(jī)制，采取的治療策略包括降低炎癥因子和氧化應(yīng)激水平，改善胰島素抵抗，阻止caspase-3及Atrogin-1和MuRF-1的激活，降低抑制素或activin水平等。探討腫瘤惡病質(zhì)的發(fā)病機(jī)制及有效干預(yù)措施，具有十分重要的意義。本研究從Myostatin/Actvin-ActRIIB信號(hào)途徑這一前沿領(lǐng)域，證實(shí)了四君子湯對(duì)腫瘤惡病質(zhì)骨骼肌萎縮的干預(yù)作用，并能降低血清中的炎癥因子，明確了四君子湯治療腫瘤惡病質(zhì)骨骼肌萎縮的關(guān)鍵靶點(diǎn)和核心通路，為應(yīng)用中醫(yī)藥改善晚期腫瘤患者生存質(zhì)量提供了生物學(xué)基礎(chǔ)和科學(xué)理論依據(jù)。