袁潔，古麗斯坦·阿不來提，布比阿加爾·哈依拉提，姚軍，程煜鳳*

(1.新疆第二醫(yī)學(xué)院，克拉瑪依 834000；2.新疆醫(yī)科大學(xué) 第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

金雀花(Caragana sinicaRehd.)是蝶形花亞科錦雞兒屬(CaraganaFabr.)植物阿爾泰錦雞兒(Caragana altaicaKom.Pojark)干燥成熟的花，生長于新疆阿勒泰地區(qū)海拔1 000 m以下的灌木叢、山坡、谷地中[1-3]，其作為一種民間藥材，常用于治療勞熱咳嗽、虛損、婦科疾病、高血壓和關(guān)節(jié)炎等[4]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，阿爾泰金雀花中富含黃酮類化合物成分，大鼠試驗顯示其對高血壓有很好的防治作用[5]，但藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此，對阿爾泰金雀花中黃酮類化合物成分的研究具有重要意義。而目前，國內(nèi)外對金雀花中黃酮類化合物成分研究較少，本課題組采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)，鑒定了金雀花乙醇提取物中9種黃酮苷類化合物[6]；文獻[7]根據(jù)化合物的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)，鑒定了金雀花乙醇提取物中6種黃酮類化合物，還有大量的其他黃酮類化合物有待分析。

近年來，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已成為中藥化學(xué)成分分析的主要手段，靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀因分辨率高、掃描快速、靈敏度高等優(yōu)點，可同時準(zhǔn)確采集母離子的質(zhì)荷比(m/z)和碎片離子的質(zhì)量數(shù)，實現(xiàn)單針進樣即可獲取中藥中不同化學(xué)成分的詳細(xì)信息[8-10]，被廣泛應(yīng)用于缺乏對照品的復(fù)雜中藥體系中化學(xué)成分的定性鑒定。鑒于此，本工作采用液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(LC-Orbitrap HRMS)分析阿爾泰金雀花中21 種黃酮類化合物，根據(jù)保留時間、一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜等信息進行結(jié)構(gòu)鑒定，為探討阿爾泰金雀花的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Orbitrap Fusion Lumos型高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；AB135-S型電子分析天平；Milli-Q 型超純水儀；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器；OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純；其余試劑均為分析純；試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Waters C18色譜柱(250 mm×3.0 mm，5μm)；柱溫25 ℃；流動相A 為乙腈，B為0.2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液；流量0.3 mL·min－1；進樣量5μL。梯度洗脫程序：0～25 min時，A 由15%升至50%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子(ESI)源，負(fù)離子模式；掃描范圍m/z100～1 100；干燥氣為氮氣，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流量30 L·min－1；毛細(xì)管電壓30 V；霧化器壓力345 k Pa；碰撞誘導(dǎo)解離能量45 e V。

1.3 試驗方法

按本課題組前期優(yōu)化的工藝條件制備金雀花乙醇精提物[11-12]，即將干燥后的阿爾泰金雀花粉碎后過孔徑為0.425 mm(40目)的篩網(wǎng)，稱取過篩后的樣品20.0 g，按料液比1 g∶50 mL 加入60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，設(shè)定超聲功率為300 W，水浴溫度為60 ℃，超聲提取50 min，經(jīng)抽濾、減壓濃縮、干燥后得粗提物。采用AB-8型大孔吸附樹脂對金雀花粗提物進行純化，將粗提液(1.14 g·L－1[12])按2.8 BV 的柱床體積、2.5 mL·min－1的流量進樣，進行樹脂吸附，再用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液以2.0 BV 的柱床體積、3.0 mL·min－1的流量進行洗脫，收集洗出液，減壓濃縮、干燥后得到金雀花精提物。準(zhǔn)確稱取金雀花精提物5 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾，得到供試品溶液，按照儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

試驗考察了不同流動相體系[乙腈-2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、甲醇-2%甲酸溶液]對21種黃酮類化合物分離效果的影響。結(jié)果顯示：以乙腈-2%甲酸溶液、甲醇-2%甲酸溶液為流動相體系時，色譜峰拖尾嚴(yán)重，分離度較小，分離效果不理想；以乙腈-0.2%甲酸溶液為流動相體系進行梯度洗脫時，各目標(biāo)物分離效果較好。因此，試驗選擇流動相體系為乙腈-0.2%甲酸溶液。

試驗進一步比較了電噴霧離子源正、負(fù)離子(ESI＋、ESI－)模式下，供試品溶液的總離子流色譜圖，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下各目標(biāo)物的色譜峰響應(yīng)值更高。因此，質(zhì)譜分析采用ESI－模式進行掃描，所得總離子流色譜圖見圖1。

圖1 阿爾泰金雀花的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of Altai Caragana sinica

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

按照儀器工作條件對供試品溶液進行分析，根據(jù)一級質(zhì)譜圖確定化合物精確相對分子質(zhì)量，結(jié)合Xcalibur4.2軟件擬合的分子式及MassBank 等數(shù)據(jù)庫，對各色譜峰進行初步推斷；通過分析二級質(zhì)譜信息，比對國內(nèi)外參考文獻，分析推導(dǎo)相關(guān)化合物的裂解規(guī)律，各項數(shù)據(jù)信息之間進行相互驗證，推斷出化合物的結(jié)構(gòu)。共解析出21種黃酮類化合物，結(jié)果見表1。

表1 21種黃酮類化合物鑒定分析Tab.1 Identification analysis of 21 flavonoid compounds

表1(續(xù))

2.3 化合物裂解規(guī)律分析

根據(jù)金雀花精提物的二級質(zhì)譜信息，以化合物1，3，10，11，13，14為例對裂解規(guī)律進行分析，結(jié)果如下。

化合物1(保留時間為2.58 min)和化合物3(保留時間為5.68 min)的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－基本一致，分別為m/z755.200 62和m/z755.199 95，初步推斷苷元為槲皮素，糖為兩分子鼠李糖和一分子葡萄糖或一分子半乳糖；結(jié)合二級質(zhì)譜信息及文獻[13]，推斷兩個化合物為槲皮素-3-O-洋槐糖-7-O-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷；由于葡萄糖苷類化合物的出峰時間比半乳糖苷類化合物的晚，因此推斷化合物1 為槲皮素-3-O-洋槐糖-7-O-鼠李糖苷，化合物3為槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷。以化合物3為例進行質(zhì)譜解析，碎片離子m/z609.144 65為7-O苷鍵裂解后失去一分子鼠李糖基的槲皮素-3-O-鼠李糖(1→6)半乳糖苷片段，碎片離子m/z446.084 35為3-O苷鍵裂解后失去一分子蕓香糖基的槲皮素-7-O-鼠李糖苷片段；當(dāng)失去所有糖基時，可形成m/z299.019 41的槲皮素苷元離子?；衔?的裂解途徑見圖2。

圖2 槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷的裂解途徑Fig.2 Fragment pathway of quercetin-3-O-rutinoside-7-O-rhamnoside

化合物10(保留時間為11.54 min)和化合物11(保留時間為11.69 min)的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－基本一致，分別為m/z463.086 12 和m/z463.086 15，初步推斷苷元為槲皮素，糖為一分子半乳糖或一分子葡萄糖；結(jié)合二級質(zhì)譜信息及文獻[16]，推斷兩個化合物為金絲桃苷和異槲皮苷；由于半乳糖苷類化合物比葡萄糖苷類化合物出峰時間早[23]，推斷化合物10為金絲桃苷，化合物11為異槲皮苷。

以化合物11為例進行質(zhì)譜解析，碎片離子m/z300.027 34為3-O苷鍵裂解后丟失了一分子中性葡萄糖的槲皮素苷元部分；槲皮素苷元部分丟失HCO 后形成m/z271.024 87的碎片離子，亦可丟失一分子CO 和一分子OH 后形成m/z255.029 79的碎片離子，還可丟失 C7H5O2形成m/z178.998 40的碎片離子，繼續(xù)丟失CO 形成m/z151.003 39的碎片離子?；衔?1的裂解途徑見圖3。

圖3 異槲皮苷的裂解途徑Fig.3 Fragment pathway of isoquercitrin

化合物13(保留時間為13.05 min)和化合物14(保留時間為13.34 min)的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－基本一致，分別為m/z477.101 62 和m/z477.101 84，初步推斷苷元為異鼠李素，糖為一分子半乳糖或一分子葡萄糖；結(jié)合二級質(zhì)譜信息及文獻[11]，推斷化合物13為異鼠李素-3-O-半乳糖苷，化合物14為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

以化合物14為例進行質(zhì)譜解析，碎片離子m/z357.061 37為母離子m/z477.101 84中葡萄糖裂解丟失C4H8O4后形成的部分，母離子m/z477.101 84亦在3-O苷鍵裂解后丟失了一分子中性葡萄糖，從而形成碎片離子m/z314.042 85，該碎片離子進一步丟失中性分子CH3或中性分子CO，形成碎片離子m/z299.019 68或m/z286.048 25，亦可同時丟失CH3和CO，形成碎片離子m/z271.024 78?；衔?4的裂解途徑見圖4。

圖4 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷的裂解途徑Fig.4 Fragment pathway of isorhamnetin-3-O-glucoside

2.4 化合物結(jié)構(gòu)驗證

以化合物12，15，21為例，驗證試驗結(jié)果的可靠性?；衔?2 的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z623.158 81，碎片離子包括m/z477.102 08、m/z315.050 38、m/z300.027 62、m/z271.024 99、m/z243.029 59、m/z151.003 27；已報道的水仙苷對照品的[M-H]－為m/z623.156 6，主要碎片離子包括m/z315.050 8、m/z300.028 2、m/z271.027 2、m/z243.033 3、m/z151.007 6[17]，兩者的信息基本一致，因此確定化合物12為水仙苷?；衔?5的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z253.049 87，碎片離子包括m/z225.055 15、m/z209.060 21、m/z135.008 12、m/z117.033 93；已報道的7，4′-二羥基黃酮對照品的[M-H]－為m/z253.05，主要碎片離子包括m/z135.01、m/z117.04[18]，兩者的主要質(zhì)譜數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物15為7，4′-二羥基黃酮?；衔?1的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z315.049 93，碎片離子包括m/z300.027 16、m/z272.032 75、m/z151.003 00、m/z107.013 85；已 報道的異鼠李素對照品的[M-H]－為m/z315.1，主要碎片離子包括m/z300.1、m/z151.0[22]，兩者的關(guān)鍵質(zhì)譜信息基本一致，因此確定化合物21為異鼠李素。

本工作采用LC-Orbitrap HRMS 對阿爾泰金雀花中的黃酮類化合物進行分析，共鑒定出21種黃酮類化合物。該研究為金雀花中黃酮類化學(xué)成分的定性鑒定提供了一種準(zhǔn)確、快速、高效的分析方法，同時為進一步明確阿爾泰金雀花的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了試驗依據(jù)。

本工作中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖譜由中國科學(xué)院北京化學(xué)研究所劉健安工程師測試、提供，在此表示衷心感謝。