陳浩寧，姚 敏，胡建鵬 (.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 2200 2.鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 22002)

膀胱癌是一種常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率較高，約75%的高危膀胱癌患者在術(shù)后10年內(nèi)復(fù)發(fā)、進(jìn)展或死亡[1-2]。在我國，膀胱癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命[3]。膀胱癌分為非肌浸潤性膀胱癌(Ta和T1期)和肌肉浸潤性膀胱癌(T2～T4期)[4]兩類。膀胱癌生物學(xué)行為復(fù)雜，容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，其發(fā)病機(jī)制涉及大量基因異常及多種信號通路的改變。

環(huán)狀RNA(circularRNA，circRNA)是一類沒有5′帽子結(jié)構(gòu)和3′poly(A)結(jié)構(gòu)但具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，主要位于細(xì)胞質(zhì)或儲存于外泌體中，不受RNA外切酶影響，表達(dá)穩(wěn)定且不易降解，廣泛存在于多種真核生物體內(nèi)[5]。近年來，circRNA被發(fā)現(xiàn)與胃癌、肝癌、乳腺癌和膀胱癌等多種疾病相關(guān)，通過多種機(jī)制參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[6-8]。但是目前與膀胱癌相關(guān)的circRNA研究尚不多見。本研究利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)中的膀胱癌circRNA表達(dá)譜芯片，探討膀胱癌差異表達(dá)circRNA及其富集的通路和參與的功能，為膀胱癌的circRNA潛在分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，并有可能作為生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)下載及預(yù)處理

在NCBI GEO (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中使用以下關(guān)鍵詞:(“bladdercancer”)AND(“circRNA”)搜索信息，共發(fā)現(xiàn)8個表達(dá)數(shù)據(jù)芯片，分別為GSE147985、GSE147984、GSE147983、GSE92675、GSE97239、GSE136919、GSE150142、GSE83955，選擇符合條件的膀胱癌circRNA表達(dá)譜芯片GSE92675的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。該芯片包括為4例膀胱癌組織和4例配對的癌旁組織。根據(jù)芯片數(shù)據(jù)的平臺文件將探針矩陣轉(zhuǎn)換為circRNA矩陣；并且對circRNA矩陣進(jìn)行命名統(tǒng)一和轉(zhuǎn)換，統(tǒng)一使用circBank數(shù)據(jù)庫命名規(guī)則。

1.2 基于Limma包的差異表達(dá)circRNA的篩選

在R.4.1.3環(huán)境下，對GSE92675膀胱癌circRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用Limma包[9]做差異表達(dá)分析，過濾條件為校正P<0.05，log2FC絕對值>2，得到107個差異表達(dá)的circRNA。并對差異表達(dá)circRNA進(jìn)行聚類分析熱圖和火山圖的可視化，根據(jù)可視化結(jié)果，挖掘在膀胱癌組織和正常組織中最顯著差異分布的circRNA進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.3 腫瘤組織與正常組織中差異表達(dá)的circRNA調(diào)控基因的GO功能、KEGG通路富集分析

首先，利用circRNA數(shù)據(jù)庫CSCD(http:∥gb.whu.edu.cn/CSCD/)預(yù)測circRNA調(diào)控的miRNA；其次，利用TargetScan數(shù)據(jù)庫進(jìn)行調(diào)控miRNA的靶基因預(yù)測；最后，應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用靶基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，探索circRNA潛在影響的功能和通路。

2 結(jié) 果

2.1 膀胱癌中差異表達(dá)circRNA的篩選

將腫瘤組和正常組的芯片分析數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，從芯片數(shù)據(jù)中篩選出3379個差異表達(dá)的circRNA。首先對校正的P值進(jìn)行篩選，篩選條件為P校正<0.05，log2FC絕對值>2，得到107個circRNA。其中表達(dá)上調(diào)的有79個circRNA，表達(dá)下調(diào)的circRNA有28個。然后對這些差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行聚類分析熱圖和火山圖的可視化分析(圖1)。通過研究上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)的circRNA聚類分析熱圖可發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0040039在腫瘤組織低表達(dá)，在正常組織高表達(dá)，區(qū)分度最佳;hsa_circ_0049547在腫瘤組織高表達(dá)，在正常組織低表達(dá)，區(qū)分度最佳。

圖 1 膀胱癌差異表達(dá)的circRNA聚類分析熱圖(左)和火山圖(右)

2.2 膀胱癌中差異表達(dá)miRNA以及mRNA的篩選

從GEO數(shù)據(jù)庫中選擇GSE40355芯片進(jìn)行膀胱癌相關(guān)的miRNA和mRNA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從芯片數(shù)據(jù)中篩選出31個差異性表達(dá)的miRNA，篩選條件為P校正<0.05，log2FC絕對值>2。其中表達(dá)上調(diào)的miRNA有14個，表達(dá)下調(diào)的miRNA有17個。對這些差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行聚類分析熱圖和火山圖的可視化分析(圖2)。通過研究上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)的miRNA聚類分析熱圖可發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-199a-5p在腫瘤組織低表達(dá)，在正常組織高表達(dá)，區(qū)分度最佳；hsa-miR-21在腫瘤組織高表達(dá)，在正常組織低表達(dá)，區(qū)分度最佳。同樣的方法，在該芯片中分析得到了1519個差異表達(dá)的mRNA。其中975個mRNA在膀胱癌腫瘤組織中低表達(dá)，544個mRNA在腫瘤組織中高表達(dá)。對這些差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行聚類分析熱圖和火山圖的可視化分析(圖3)。通過分析上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)mRNA聚類分析熱圖可發(fā)現(xiàn)，CRH基因在腫瘤組織低表達(dá)，在正常組織高表達(dá)，區(qū)分度最佳；SLC2A4基因在腫瘤組織高表達(dá)，在正常組織低表達(dá)，區(qū)分度最佳。

隨后，在CSCD數(shù)據(jù)庫找到差異值排名前7的circRNA的互做miRNA，并與膀胱癌數(shù)據(jù)庫中的差異miRNA取交集，得到11個在膀胱癌中具有差異且參與調(diào)控circRNA的miRNA。同樣得到1144個膀胱癌中具有差異且參與調(diào)控circRNA的mRNA。

圖 2 膀胱癌差異表達(dá)的miRNA的聚類分析熱圖(左)和火山圖(右)

圖 3 膀胱癌差異表達(dá)的mRNA聚類分析熱圖(左)和火山圖(右)

2.3 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可視化及調(diào)控基因功能富集分析結(jié)果

在腫瘤細(xì)胞的circRNA中隨機(jī)選取了4個高表達(dá)的結(jié)果：hsa_circ_0023642、hsa_circ_0002623、hsa_circ_0032821、hsa_circ_0072088，以及2個低表達(dá)的結(jié)果：hsa_circ_0002435、hsa_circ_0082582，利用Cytoscape.3.8.2軟件對它們的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析(圖4)。把目前可在公共數(shù)據(jù)庫比對到的這些circRNA作為分子海綿間接調(diào)控的基因，采用GO功能分析和KEGG通路富集分析對這些調(diào)控基因進(jìn)行了富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些調(diào)控基因在如下GO功能上存在富集：肌肉系統(tǒng)進(jìn)程、肌肉發(fā)育、肌肉收縮、細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白、肌動蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性等(FDR<0.05，圖5～7)。這與膀胱的組織器官結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。這些調(diào)控基因在KEGG通路富集層面顯示，P13K-AKT信號通路、MAPK信號通路以及Calcium通路中在調(diào)控基因中得到顯著富集(FDR<0.05，圖8)。

圖 4 膀胱癌中差異表達(dá)的circRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

圖 5 膀胱癌中差異表達(dá)的circRNA的GO-BP功能富集結(jié)果(左邊為柱狀圖，右邊為氣泡圖)

圖 6 膀胱癌中差異表達(dá)的circRNA的GO-CC功能富集結(jié)果(左邊為柱狀圖，右邊為氣泡圖)

圖 7 膀胱癌中差異表達(dá)的circRNA的GO-MF功能富集結(jié)果(左邊為柱狀圖，右邊為氣泡圖)

圖 8 胱癌中差異表達(dá)的circRNA的KEGG功能富集結(jié)果(左邊為柱狀圖，右邊為氣泡圖)

3 討 論

隨著社會年齡結(jié)構(gòu)的變化，我國逐漸步入老齡化社會，膀胱癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢。如何預(yù)防膀胱癌的發(fā)生發(fā)展是其治療的關(guān)鍵問題。所以積極探究膀胱癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制并尋找新的治療靶點(diǎn)對治療該病具有十分重要的意義。

CircRNA在各種生物體內(nèi)廣泛存在，且在各個腫瘤組織中具有多種差異性表達(dá)，因此，其可能成為潛在的生物學(xué)標(biāo)志[10]。CircRNA在諸如細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等重要的細(xì)胞生命進(jìn)程中發(fā)揮著不可替代的作用[11]。CircRNA的生物學(xué)功能主要包括：①作為miRNA海綿體分子調(diào)控基因表達(dá)，例如circRNAMYLK可通過海綿吸附作用降低miR-558的活性，通過調(diào)節(jié)VEGFA/VEGFR2信號通路促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展[12]。②與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能，例如circ-HuR可以抑制CCHC型鋅指核酸結(jié)合蛋白介導(dǎo)的HuR的表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌的發(fā)生和發(fā)展，circ-HuR作為一個腫瘤抑制因子可能成為胃癌的潛在治療靶點(diǎn)[13]。③能被翻譯成蛋白質(zhì)，例如circ-ZNF609包含一個開放閱讀框，其可被編碼成蛋白質(zhì)發(fā)揮作用[14]。但是，由于腫瘤調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜、樣本的差異以及研究方法的不同，目前與膀胱癌相關(guān)的circRNA研究較為匱乏，認(rèn)識尚不全面。因此，迫切需要深入地研究和探索膀胱癌的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與膀胱癌密切相關(guān)的circRNA。

本研究主要分析GEO數(shù)據(jù)庫中circRNA在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，對膀胱癌相關(guān)circRNA進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA共31個，其中表達(dá)上調(diào)的有14個，表達(dá)下調(diào)的有17個。提示這些circRNA可能參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。過去的研究發(fā)現(xiàn)circRNA可以通過circRNA-miRNA-mRNA軸促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)展[15]，因此本研究對circRNA可能結(jié)合的miRNAs進(jìn)行了預(yù)測，并進(jìn)一步對這些miRNA可能結(jié)合的mRNA進(jìn)行了篩選，構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖。隨后對這些差異表達(dá)的circRNA間接調(diào)控的靶基因進(jìn)行了GO功能分析和KEGG通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些circRNA可能在肌肉發(fā)育、肌動蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性等GO功能上富集，并且很可能通過P13K-AKT信號通路發(fā)揮作用。接下來可通過實(shí)時熒光定量實(shí)驗對大量樣本進(jìn)行檢測，進(jìn)一步驗證各circRNA在臨床標(biāo)本以及各細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并通過在體外敲除或過表達(dá)相應(yīng)circRNA，來探索膀胱癌細(xì)胞表型及其相應(yīng)的信號通路的變化，使用qPCR、免疫印跡技術(shù)、熒光素酶報告基因?qū)嶒灥确椒ㄟM(jìn)一步驗證各circRNA與相應(yīng)的miRNA之間的海綿吸附關(guān)系，以及miRNA與mRNA的吸附關(guān)系，從而深入探討circRNA與miRNA之間的聯(lián)系以及與下游基因的協(xié)同作用。

綜上所述，本研究構(gòu)建了膀胱癌相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA體系的互作網(wǎng)絡(luò)，為揭示膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子水平機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)，有助于探尋新的膀胱癌候選診斷、治療靶點(diǎn)，并揭示膀胱癌發(fā)生和發(fā)展過程中的生物學(xué)機(jī)制。