馬 暢,彭國(guó)良,李 妍* (.吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫藥理學(xué)重點(diǎn)研究室，吉林 吉林 303;.聯(lián)勤保障部隊(duì)臨潼康復(fù)療養(yǎng)中心，陜西 西安 70699)

全球疾病調(diào)查發(fā)現(xiàn)乳腺癌已經(jīng)成為威脅女性健康的首要疾病。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì),2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例，乳腺癌約占所有女性惡性腫瘤的24.2%，中國(guó)女性發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)均居世界首位[1-2]。乳腺癌的治療多以化療、放療、手術(shù)切除為主?；颊咧委熎陂g痛苦程度較高，且治療后仍有30%左右的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，部分患者在治療期間還會(huì)出現(xiàn)如心臟毒性、腎毒性、骨髓抑制等毒副作用，影響愈后生活。

紫草素是從中草藥紫草根部提取的一種小分子萘醌類的化合物[3]，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗癌、抗血栓形成、免疫調(diào)節(jié)等作用，具有易獲取、價(jià)格低、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)[4-5]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是一個(gè)大家族[6]，其表達(dá)和活性在不同細(xì)胞中受到嚴(yán)密調(diào)控，可以監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生浸潤(rùn)或遷移。紫草素是否影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲尚不明確。本研究以體外培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1為模型，探討紫草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，分析相關(guān)機(jī)制，闡述其在乳腺癌治療中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1保存于吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室。紫草素購(gòu)自百靈威科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)液1640購(gòu)自Gibco公司；MTT、DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗人β-actin、MMP-2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；免疫印跡試劑購(gòu)自索萊寶公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

液氮罐中取出凍存的4T1細(xì)胞，復(fù)蘇、傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。傳代培養(yǎng)使用含10%胎牛血清的1640液，每周傳代2到3次，按照實(shí)驗(yàn)所需鋪板，培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/mL，每孔100 μL接種于96孔板培養(yǎng)12 h，棄去上清每孔加入含紫草素的培養(yǎng)液200 μL，使其終濃度分別為0、12.5、25、50和100 μmol/L，每個(gè)藥物濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。PBS封邊。

1.3 MTT還原法測(cè)細(xì)胞增殖

在給予藥物紫草素后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，移除上清，按照1∶10加入MTT與血清培養(yǎng)基的混合液(MTT保存使用過(guò)程中注意避光)，96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，PBS組為空白組，每孔加入DMSO 200 μL溶解10 min，使用酶標(biāo)儀室溫下490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(inhibition rate,IR)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

消化并收集細(xì)胞，取每組1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色，PBS洗滌兩次，用5 mL 80%冷甲醇溶液固定細(xì)胞。檢測(cè)分析前離心棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞周期測(cè)定使用Triton-100的PI和RNA酶室溫下避光染色30 min；凋亡使用PI避光染色30 min，流式細(xì)胞儀(Epics，美國(guó)貝克曼)上機(jī)檢測(cè)。

1.5 免疫印跡分析相關(guān)蛋白

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞加入紫草素使終濃度為0、12.5、25、50和100 μmol/L處理細(xì)胞24 h，去上清液PBS洗滌細(xì)胞2次，消化收集貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，加裂解液裂解超聲破碎提取蛋白，免疫印跡分析MMP-2蛋白的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析亡

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 紫草素對(duì)4T1細(xì)胞增殖的影響

紫草素以濃度依賴方式抑制乳腺癌細(xì)胞4T1生長(zhǎng)，藥物作用72 h的半數(shù)抑制率(IC50)值約為50 μmol/L(圖1)。

圖 1 不同濃度紫草素對(duì)4T1細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 紫草素對(duì)4T1細(xì)胞周期與凋亡的影響

不同濃度紫草素(0、12.5、25、50和100 μmol/L)處理4T1細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期(表1)。與對(duì)照組比較，紫草素組處理組顯著使細(xì)胞阻滯于G0/G1期細(xì)胞，而S期和G2/M期細(xì)胞百分率不同程度降低。

2.3 紫草素對(duì)4T1細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響

不同濃度紫草素(0、12.5、25、50和100 μmol/L)處理4T1細(xì)胞免疫印跡技術(shù)檢測(cè)MMP-2表達(dá)的結(jié)果見(jiàn)圖2，顯示紫草素對(duì)MMP-2表達(dá)具有抑制作用。

圖 2 紫草素對(duì)4T1細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響

3 討 論

2000-2021年，乳腺癌的發(fā)病率急速增高，但死亡率卻有所降低。乳腺癌早期的治療相較于晚期更容易，生存率也更高，而腫瘤晚期的浸潤(rùn)與遷移會(huì)直接導(dǎo)致患者死亡率增加[1-2]。乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，分為管腔A、管腔B、HER2過(guò)表達(dá)、受體轉(zhuǎn)移性乳腺癌(metastatic breast cancer，MBC)和三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)。TNBC是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子均為陰性的乳腺癌，占所有乳腺癌的10%～17%。TNBC在具有較強(qiáng)的浸潤(rùn)和遷移性，治療上相較于其他類型的乳腺癌更難，且對(duì)于晚期TNBC幾乎無(wú)法治愈，篩選合適的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物是治療的捷徑。

表 1 紫草素對(duì)4T1細(xì)胞周期與凋亡的影響

紫草素有明顯的抗腫瘤作用，它可以抑制胃癌MGC803細(xì)胞、甲狀腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)卵巢癌HO-8910細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)人乳腺癌MCF-7發(fā)生自噬[4-5]。徐洋等研究發(fā)現(xiàn)紫草素可通過(guò)抑制STAT3-MMP2信號(hào)通路抑制人胃癌MGC803遷移[6]。為探究紫草素影響乳腺癌細(xì)胞的藥理學(xué)機(jī)制，采用TNBC細(xì)胞小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1，具備較強(qiáng)遷移能力的腫瘤，有利于研究紫草素的抗腫瘤機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，紫草素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞4T1的增殖，且呈一定程度的濃度依賴性，這與安興晨等的研究結(jié)果一致[7]。為進(jìn)一步探討紫草素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的原因，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了不同濃度紫草素作用后4T1細(xì)胞的細(xì)胞周期與凋亡。結(jié)果顯示細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期的占比增多，處于S期與G2/M期的細(xì)胞呈不同程度的降低，且細(xì)胞凋亡的數(shù)量增多。王瑜等研究紫草素可以通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路上調(diào)p53基因的表達(dá)而誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的發(fā)生[8]。為研究紫草素是否會(huì)影響腫瘤細(xì)胞遷移，實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡的方法測(cè)定了對(duì)照組與不同濃度紫草素給藥后的乳腺癌4T1細(xì)胞的MMP-2與β-actin蛋白。MMP-2是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移的標(biāo)志物[9]，其含量與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有直接的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比較，藥物組MMP-2/β-actin的蛋白含量顯著降低。提示紫草素可能影響小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的遷移與浸潤(rùn)，對(duì)TNBC轉(zhuǎn)移后的治療有幫助，為藥物進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。

綜上所述，紫草素可以通過(guò)濃度依賴的方式抑制4T1細(xì)胞的增殖，通過(guò)MMP-2信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制乳腺癌細(xì)胞4T1的侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，從而為抗乳腺癌藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。