韓 柳，王翠竹，董慶海，吳福林，李平亞，昌 盛* (.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 303；.吉林大學(xué)藥學(xué)院天然藥物研究中心，吉林 長春 300)

銀花泌炎靈片由金銀花、半枝蓮、萹蓄、瞿麥、石韋等十味中藥組成，是一種有清熱解毒、利濕通淋的功效的藥物，可以治療急性腎盂腎炎等癥[1]。目前，關(guān)于銀花泌炎靈的研究大多集中在藥理作用、臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)等方面。關(guān)于銀花泌炎靈片的揮發(fā)油化學(xué)成分雖有報(bào)道[2]，但銀花泌炎靈片提取液化學(xué)成分的相關(guān)研究文獻(xiàn)尚少見。藥物化學(xué)成分是其發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，一些常用的鑒定化合物的方法，如高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、超高效液相色譜法(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS)、超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)多需要手動(dòng)提取各個(gè)色譜峰，根據(jù)色譜峰中的分子離子峰、碎片離子及保留時(shí)間，結(jié)合對(duì)照品、數(shù)據(jù)庫和有關(guān)文獻(xiàn)，確定化合物可能的結(jié)構(gòu)[3-4]。但傳統(tǒng)分析方法具有重現(xiàn)性差、效率低等局限性。近來，隨著技術(shù)的發(fā)展，一些新的分析技術(shù)應(yīng)用而生。超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight/mass spectrometr，UPLC-Q-TOF/MS)是一種新的質(zhì)譜技術(shù)[5]，其特點(diǎn)是可以精確測定相對(duì)分子質(zhì)量，靈敏度高、選擇性好、分離準(zhǔn)確且速度快。所以，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對(duì)銀花泌炎靈片提取液的化學(xué)成分進(jìn)行快速、全面地分析與鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

銀花泌炎靈提取液(吉林華康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20180434)；甲酸鈉(美國Fisher公司)；甲醇(天津新通精細(xì)化工有限公司，分析純)； UPLC-MS 級(jí)乙腈(美國Fisher公司)；亮氨酸-腦啡肽(美國Sigma公司)；質(zhì)譜用水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

Xevo G2-XS型Q-TOF四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC型二元泵和樣品管理器、V1.7 UNIFYR科學(xué)信息學(xué)系統(tǒng)(美國Waters公司)；N-A35型氮?dú)獍l(fā)生器(上海金浪科技)；TGL-16aR型飛鴿超離速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器)。

1.2 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，樣品管理器溫度15 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，柱溫30 ℃，流速0.4 mL/min，流動(dòng)相A：0.1%甲酸-水，V/V；流動(dòng)相B：0.1 %甲酸-乙腈，V/V。梯度洗脫條件：0～2 min，10%B；2～26 min，10%～90%B；26～28 min，90% B；28～29 min，90%～10%B；29～30 min，10%B。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化源，MSE continuum模式，正離子及負(fù)離子檢測模式。m/z100～1500為全掃掃描范圍。錐孔電壓為40 V，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，錐孔氣流量為50 L/h，氬氣流量為0.15 mL/min，脫溶劑氮?dú)饬髁繛?00 L/h，脫溶劑氣溫度為300 ℃，源溫為120 ℃。亮氨酸-腦啡肽為Lock Spray校正標(biāo)準(zhǔn)液(100 ng/L)，[M+H]+=556.277 1，[M-H]-=554.262 0，實(shí)時(shí)校正，其校正流速為15 μL/min(正離子模式)，甲酸鈉溶液對(duì)儀器進(jìn)行校正。

1.4 銀花泌炎靈提取液樣本的處理

將銀花泌炎靈片粉碎，過篩。精密量取1.0 g銀花泌炎靈片粉末，75%乙醇82 ℃水浴，提取3次，每次4 h。過濾后，合并，旋干。取1.0 mL 80%甲醇將提取物溶解，0.22 μm濾膜過濾，備用。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用UPLC-Q-TOF/MS模式進(jìn)行采集數(shù)據(jù)， UNIFI軟件對(duì)銀花泌炎靈片提取液化學(xué)成分自動(dòng)識(shí)別。首先，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，建立銀花泌炎靈數(shù)據(jù)庫，并將查找到的化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)保存成.mol格式的文件，并將其導(dǎo)入到分析方法中；接著，通過Waters Compression and Archival Tool v 1.10軟件將原始數(shù)據(jù)壓縮；然后應(yīng)用UNIFI軟件自動(dòng)對(duì)數(shù)據(jù)篩查與鑒定，建立一個(gè)過濾篩選方法，設(shè)定質(zhì)量誤差為±(6×10-6)且響應(yīng)值大于3000；最后，結(jié)合碎片離子理論精確質(zhì)量數(shù)(Exact Mass Number)、相對(duì)保留時(shí)間(Relative Retention Time)和化合物結(jié)構(gòu)匹配軟件MassFragment、分子式匹配軟件Elemental composition、離線及在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(PubMed、Mass Bank、METLIN、Chemspider)以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)分析，對(duì)各主要化學(xué)成分進(jìn)行識(shí)別和鑒定。

2 結(jié) 果

正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜基峰離子流圖見圖1(正離子)和圖2(負(fù)離子)。橫坐標(biāo)為時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度(%)。通過UNIFI處理系統(tǒng)和MassLynx 4.1對(duì)銀花泌炎靈片提取液進(jìn)行定性分析。首先根據(jù)質(zhì)譜得到精確分子質(zhì)量，然后得到可能的元素組成，最后確定可能的分子式。經(jīng)過二級(jí)質(zhì)譜分析，特征碎片離子及相關(guān)的參考文獻(xiàn)，總共鑒定了61個(gè)化學(xué)成分，包括有機(jī)酸類化合物、黃酮類化合物、二萜、三萜及其苷類化合物等。其具體的保留時(shí)間(min)、準(zhǔn)分子離子峰實(shí)測值及理論值、質(zhì)量誤差、分子式、主要碎片離子和來源等相關(guān)信息見表1。

圖 1 銀花泌炎靈提取液正離子模式下的基峰離子流圖

圖 2 銀花泌炎靈提取液負(fù)離子模式下的基峰離子流圖

表 1 銀花泌炎靈全成分鑒定表

續(xù)表 1

鑒定結(jié)果化合物1：維生素B2；2：亞油酸乙酯；3：2′-(3′,4′-二羥基苯基)乙基-(6″-O-木犀欖苷-11-甲酯)-β-D-吡喃葡萄糖苷；4：槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷；5：7-O-β-D-吡喃葡萄糖基-山柰酚；6：(1S,2S,4R)-反式-2-羥基-1,8-桉葉素-β-D-吡喃葡萄糖苷；7：3-O-阿魏?？崴?；8：獐牙菜苷；9：芹糖甘草苷；10：3-蕓香糖槲皮素；11：木犀草素-7-O-β-D-新橙皮糖苷；12：連翹酯苷A；13：(+)-1-羥基松脂酚-4′-4″-二-O-β-D葡萄吡喃糖苷(松脂醇二葡萄糖苷)；14：Conicaoside；15：半枝蓮二萜Ⅰ；16：3,4-二咖啡酰氧基奎寧酸；17：(+)-杜仲樹脂醇-二-吡喃葡萄糖苷；18：木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖苷；19：硬脂酸乙酯；20：(-)-表兒茶素五乙酸酯；21：5,3′-二羥基-6,7,4′,5′-四甲氧基黃酮；22：山奈酚；23：2,7-二羥基-4-甲氧基菲-2,7-O-葡萄糖二苷；24：12-α-羥基檸檬苦素；25：5-去羥山柰酚；26：馬錢酸-6′-O-β-D-葡萄糖苷；27：β-谷甾醇乙酸酯；28：山柰素-3-O-α-L-(4-O-乙?；?-鼠李糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷；29：3β-氧-甲?；?7β,12β-二羥基-4,4,14α-三甲基-5α-膽甾-11,15-二酮-8-烯(E)-24-酸；30：半枝蓮堿A；31：熊去氧膽酸；32：(E,E)-9-Oxooctadeca-10,12-dienoic acid；33：阿魏酸木蠟醇酯；34：Coronaric acid；35：3,3′-二羥基-2-(對(duì)羥芐基)-5-甲氧基聯(lián)芐；36：異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷；37：升麻醇木糖苷；38：5-膽酸甲酯-3-O-β-D-葡萄糖苷；39：3-表齊墩果酸；40：二十一烷酸；41：蛻皮甾酮-3-O-β-D-葡萄糖苷；42：巨大戟萜醇-3-棕櫚酸酯；43：3-O-咖啡酰-3β,11α-二羥基-12-齊墩果烯；44：Platycoside M-1_16；45：毛冬青皂苷甲；46：棕櫚酸；47：連翹苷：48：胡蘿卜醇；49：正二十一烷醛；50：Tuberoside Q；51：正二十三烷酸；52：Trachelosperoside E-1；53：二十五烷酸；54：7β-羥基升麻醇木糖苷；55：棕櫚酸乙酯；56：貫葉金絲桃素；57：齊墩果酸甲酯；58：3-O-D-laminaribiosyl polygalacic acid_45；59：α-羥基-二十四酸；60：β-谷甾醇-3-O-D-葡萄糖苷；61：齊墩果酸3-O-β-D-(6′-O-甲基)-吡喃葡萄糖醛酸苷

3 討 論

本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS結(jié)合UNIFI天然產(chǎn)物分析平臺(tái)對(duì)銀花泌炎靈提取液化學(xué)成分進(jìn)行快速的分析與鑒定。UNIFI分析平臺(tái)具有分析高效、全面的特點(diǎn)，目前數(shù)據(jù)庫中含有6000多種化合物信息，涵蓋600多味中藥材[6]。實(shí)驗(yàn)中向數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充錄入已有文獻(xiàn)報(bào)道的銀花泌炎靈化學(xué)成分信息，包括化學(xué)式、結(jié)構(gòu)、摩爾質(zhì)量等，建立銀花泌炎靈片專屬的數(shù)據(jù)庫。將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI分析平臺(tái)中，通過設(shè)置合適的參數(shù)，來對(duì)原始的數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和識(shí)別，與目標(biāo)數(shù)據(jù)庫自動(dòng)匹配并生成報(bào)告。相比于傳統(tǒng)鑒定方法，UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合UNIFI分析平臺(tái)的方法，具有耗時(shí)短、效率高、分析全面等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被應(yīng)用到快速鑒定傳統(tǒng)中藥乃至于中藥復(fù)方中的化學(xué)成分[7]。

本實(shí)驗(yàn)共鑒定出銀花泌炎靈片提取液中61種化學(xué)成分，所建立的檢測方法為銀花泌炎靈片提取液提供了一種快速鑒定化學(xué)成分的方法，同時(shí)為銀花泌炎靈片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)闡明提供了科學(xué)的依據(jù)。