明敬峰 魏紅玉 張永進(jìn) 劉平國(guó) 李曉靜 吳毅杰 李瑞霞 蔡增林

(1南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京 215000；2連云港市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

α-突觸核蛋白(α-synuclein)是一種在神經(jīng)元中表達(dá)豐富由SNCA基因編碼的由140個(gè)氨基酸構(gòu)成小分子蛋白質(zhì)。α-synuclein的降解障礙是帕金森病(PD)的主要病理特征，在遺傳因素、環(huán)境因素、年齡老化、氧化應(yīng)激等多種因素相互作用下，α-synuclein發(fā)生錯(cuò)誤的折疊并在細(xì)胞內(nèi)聚集不能及時(shí)降解進(jìn)而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡〔1〕。正常生理狀況下，神經(jīng)元通過(guò)質(zhì)量控制系統(tǒng)對(duì)α-synuclein的生成與降解整個(gè)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，一旦其結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常神神經(jīng)元就會(huì)對(duì)其進(jìn)行修復(fù)或?qū)⑵淝宄?。自?溶酶體途徑(ALP)是神經(jīng)元修復(fù)和清除異常蛋白的最主要途徑之一〔2〕。神經(jīng)元ALP一旦異常，就會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)有害蛋白的積累，造成神經(jīng)元的損害，最終引起神經(jīng)退行性疾病。微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3，是哺乳動(dòng)物自噬相關(guān)基因(ATG)8蛋白的同源物，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)定位于自噬體膜上的自噬體標(biāo)記蛋白，是自噬體的重要組成部分，其含量的多少與自噬體數(shù)量正相關(guān)〔14〕，目前在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)LC3 有三種亞型，分為 LC3a、LC3b、LC3c，可以通過(guò)它們表達(dá)水平推斷細(xì)胞自噬水平〔3〕。鈣周期素結(jié)合蛋白(CacyBP/SIP)是一個(gè)廣泛參與蛋白質(zhì)的去磷酸化，細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)，基因調(diào)控，細(xì)胞增殖，分化和致癌等代謝過(guò)程的小分子蛋白質(zhì)〔4〕。CacyBP/SIP可能對(duì)于維持微管穩(wěn)態(tài)從而在自噬體形成及自噬體、溶酶體融合過(guò)程中起重要作用和通過(guò)調(diào)節(jié)降解自噬正性調(diào)節(jié)因子 P27 參與自噬的調(diào)節(jié)〔5〕?？傊?，目前關(guān)于PD的發(fā)病機(jī)制目前不是很清楚，也沒(méi)有根治的藥物，找到一種能早期診斷PD的生物學(xué)標(biāo)志物及尋找一個(gè)針對(duì)PD藥物治療的新方向?qū)D診斷與治療具有重要臨床意義。本文旨在探討PD患者外周血漿α-synuclein、LC3、CacyBP/SIP與PD臨床癥狀的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取 2016年7月至2017年11月在連云港第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及門診就診并確診為PD的患者47例為PD組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡55～80歲住院病人；②受試者已了解并簽署知情同意書，同意留取血標(biāo)本及配合相關(guān)評(píng)估；③PD患者符合2015年由國(guó)際運(yùn)動(dòng)障礙協(xié)會(huì)(MDS)制定的帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤、肝炎、腎臟疾病或其他嚴(yán)重疾病者；②繼發(fā)性帕金森綜合征、腦炎、有重大腦血管疾病、顱腦外傷手術(shù)病史者；③存在嚴(yán)重代謝性疾病、藥物中毒或重度抑郁等原因?qū)е抡J(rèn)知功能障礙者；④有PD家族遺傳病史。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。同一時(shí)間段內(nèi)隨機(jī)選取與患者組性別、年齡相匹配的健康體檢者 25例作為對(duì)照組。其中PD組男28例、女19例，平均年齡(68.96±6.90)歲，對(duì)照組男14例、女11例，平均年齡(66.40±4.24)歲；兩組年齡及性別無(wú)顯著差異(P>0.05)。同時(shí)由同一位神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師對(duì)PD患者組按臨床癥狀進(jìn)行Hoehn-Yahr分期(測(cè)評(píng)時(shí)，PD 患者都沒(méi)有使用抗PD藥物)，總共招募到Ⅱ期患者21例，Ⅲ期21例，Ⅳ期5例。

1.2血漿中α-synuclein、LC3、CacyBP/SIP水平檢測(cè) ①血漿樣本采集。分別抽取PD患者和對(duì)照組正常人空腹外周靜脈血2 ml，用檸檬酸鈉抗凝，再以高速離心機(jī)以3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿，下層血清，將上層血漿置于-80℃冰箱冰凍待檢，全部血漿樣本同一批次相同條件下檢測(cè)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。②血漿α-synuclein蛋白水平檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法按人Alpha-synucleinELISA試劑盒(ABCam公司，編號(hào)：ab210973)內(nèi)說(shuō)明書檢測(cè)血漿α-synuclein蛋白水平：按試劑盒試劑說(shuō)明書配制洗脫液、抗體混合物、標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋。標(biāo)準(zhǔn)品按要求配制一系列濃度，分別為0，282，421，632，948，1 422，2 133，3 200 pg/L。在酶標(biāo)板上設(shè)置兩列標(biāo)準(zhǔn)品孔，一列實(shí)驗(yàn)孔一列復(fù)孔，每列包括8個(gè)孔；按照試劑說(shuō)明書向每孔中依次加入50 μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液。分別向每個(gè)孔中加入50 μl抗體混合物，輕輕溫和混勻；用封口膠帶密封酶標(biāo)板，室溫條件下在300 r/min搖床上孵育1 h后，輕輕甩去孔內(nèi)液體，向每孔加入350 μl洗滌液，每次浸潤(rùn)1 min左右，共3次，最后一次洗完后，輕輕甩去孔內(nèi)液體，將酶標(biāo)板倒置，用吸水紙吸去殘留的液體；分別向每孔中加入100 μl底物溶液，室溫條件下在300 r/min搖床上孵育10 min(避光)；待到時(shí)間后，立即向每孔中加入100 μl終止液，終止顏色發(fā)展反應(yīng)；加完終止液后立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各個(gè)孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度運(yùn)用EXCEL2010繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求R>0.99，再根據(jù)公式計(jì)算出各樣本濃度。③血漿LC3A蛋白水平檢測(cè)。按人LC3A ELISA試劑盒試劑(RnD公司，編號(hào)：DY8558-05)說(shuō)明書配制洗滌液、檢測(cè)抗體、HRP綴合物、底物溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液。標(biāo)準(zhǔn)品溶液按要求配制一系列濃度，分別為0.0，15.6，31.3，62.5，125.0，250.0，500.0，1 000.0 pg/L。在酶標(biāo)板上設(shè)置兩列標(biāo)準(zhǔn)品孔，一列實(shí)驗(yàn)孔一列復(fù)孔，每列包括8個(gè)孔；按照試劑說(shuō)明書向每孔中依次加入100 μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，用封口膠帶密封酶標(biāo)板，在室溫條件下孵育2 h。分別向每個(gè)孔中加入100 μl檢測(cè)抗體，輕輕混勻。用封口膠帶密封酶標(biāo)板，在室溫條件下孵育2 h后，按照酶標(biāo)板制備步驟3洗滌每孔；分別向每個(gè)孔中加入100 HRP綴合物溶液，在室溫條件小孵育20 min；時(shí)間到后，立即向每孔中加入50 μl終止液，立即用酶標(biāo)在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各個(gè)孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度運(yùn)用EXCEL2010繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求R>0.99，再根據(jù)公式計(jì)算出各樣本濃度。④血漿CacyBP蛋白水平檢測(cè)。按人CacyBPELISA試劑盒試劑(Lifespa公司，編號(hào)：ls-f23970)說(shuō)明書配制洗滌液、檢測(cè)抗體、HRP綴合物及標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品按要求配制一系列濃度，分別為0.00，78.15，156.30，312.50，625.00，1 250.00，2 500.00，5 000.00 pg/L。在酶標(biāo)板上設(shè)置兩列標(biāo)準(zhǔn)品孔，一列實(shí)驗(yàn)孔一列復(fù)孔，每列包括8個(gè)孔；按照試劑說(shuō)明書向每孔中依次加入50 μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，標(biāo)準(zhǔn)品溶液從低到高濃度依次加入，待測(cè)樣品按照樣本的編號(hào)順序依次加入；分別向每個(gè)孔中加入100 μl抗體混合物，輕輕混勻。用封口膠帶密封酶標(biāo)板，37℃水浴溫箱孵育90 min，輕輕甩去孔內(nèi)液體；分別向每個(gè)孔中加入100 μl檢測(cè)抗體，用封口膠帶密封酶標(biāo)板，37℃水浴溫箱內(nèi)孵育60 min；分別向每孔中加入100 μl HRP綴合物，用封口膠帶密封酶標(biāo)板，37℃水浴溫箱內(nèi)孵育30 min；分別向每孔中加入90 μl底物溶液，用封口膠帶密封酶標(biāo)板，37℃水浴溫箱內(nèi)孵育15 min后，立即向每孔中加入50 μl終止液，立即用酶標(biāo)在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各個(gè)孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度運(yùn)用EXCEL2010繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求R>0.99，再根據(jù)公式計(jì)算出各樣本濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)、方差分析、非參數(shù)檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組血漿中α-synuclein蛋白水平比較 PD組外周血漿中α-synuclein蛋白〔(3 138.27±175.00)pg/ml〕明顯高于對(duì)照組〔(2 899.48±409.34)pg/ml，t=3.459，P<0.05〕。

2.2兩組血漿LC3a蛋白水平比較 PD組外周血漿LC3a蛋白〔(87.14±27.72)pg/ml〕明顯低于對(duì)照組〔(114.87±46.77)pg/ml；t=-3.162，P=0.002〕。

2.3PD患者不同Hoehn-Yahr分級(jí)血漿LC3a蛋白水平比較 不同Hoehn-Yahr分期的PD患者血漿中LC3a蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PDⅡ期患者血漿中LC3a蛋白水平〔(99.02±27.89)pg/ml〕明顯高于PDⅢ期患者〔(82.47±23.65)pg/ml，P<0.05〕；PDⅢ期患者血漿中LC3a蛋白的水平明顯高于PDⅣ期患者〔(56.88±12.22)pg/ml，P<0.05〕。

2.4PD患者血漿中LC3a蛋白水平與不同Hoehn-Yahr分期相關(guān)性 PD患者血清中LC3a蛋白水平與Hoehn-Yahr分期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.457，P=0.001)。

2.5兩組血漿CacyBP/SIP蛋白水平比較 PD組外周血漿CacyBP/SIP蛋白〔(139.74±34.57)pg/ml〕與對(duì)照組〔(144.47±38.44)pg/ml〕差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.532，P=0.596)。

2.6PD患者不同Hoehn-Yahr分級(jí)血漿中CacyBP/ SIP蛋白水平比較 不同Hoehn-Yahr分期的PD患者血漿中CacyBP/SIP蛋白水平比較，均無(wú)明顯差異(P>0.05)。PDⅡ期患者血漿中CacyBP/SIP蛋白的水平〔n=21，(140.86±31.53)pg/ml〕與PDⅢ期患者〔n=21，(136.73±38.29)pg/ml〕比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PDⅢ期患者血漿中CacyBP/SIP蛋白的水平與PDⅣ期患者〔n=5，(147.67±36.13)pg/ml〕比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

PD最早的病理特征主要集中在殘存神經(jīng)元內(nèi)形成的嗜酸性路易小體(LB，其主要成分是α-synuclein)和黑色素的功能上〔6〕。α-synuclein是一種在神經(jīng)元中表達(dá)十分豐富的蛋白質(zhì)，主要由大腦黑質(zhì)、海馬及紋狀體神經(jīng)元表達(dá)。α-synuclein蛋白異常聚集是PD發(fā)生的重要因素之一，α-synuclein異常聚集會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞毒性，引起特定腦區(qū)的細(xì)胞脫失，從而引起包括PD 在內(nèi)的多種突觸核蛋白疾病〔7〕。正常生理情況下，大腦神經(jīng)元內(nèi)的α-synuclein沒(méi)有特定空間結(jié)構(gòu)，當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)，α-synuclein的空間結(jié)構(gòu)就會(huì)隨之發(fā)生改變，形成富含β-折疊的不可溶形式在神經(jīng)元內(nèi)集聚成寡聚體，進(jìn)而形成路易小體損失神經(jīng)元，最終造成多巴胺能神經(jīng)元的死亡〔8〕。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)做了很多對(duì)于血漿中α-synuclein蛋白濃度與PD的相關(guān)性的研究，但是他們研究的結(jié)果并不一致。Lee等〔9〕在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用ELISA對(duì)105例PD患者及51例正常對(duì)照者血漿中α-synuclein蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD患者血漿α-synuclein蛋白含量明顯比正常人高。Duran等〔10〕通過(guò)ELISA檢測(cè)53例未治療過(guò)PD患者、42例治療過(guò)PD患者及60例正常對(duì)照者血漿中α-synuclein蛋白水平時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組及未治療組α-synuclein蛋白的水平比正常人高，治療組及未治療組α-synuclein蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。

對(duì)于當(dāng)前不同的學(xué)者所測(cè)血漿α-synuclein蛋白濃度存在較大差異，考慮與民族遺傳背景及環(huán)境不同有關(guān)，本研究為避免此情況出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)對(duì)象均為漢族，長(zhǎng)期在本地區(qū)居住。本研究結(jié)果和Lee等〔9〕研究結(jié)果相同，顯示出血漿中α-synuclein蛋白可能作為PD生物標(biāo)志物，從而幫助臨床醫(yī)師對(duì)PD的診斷。同時(shí)也說(shuō)明α-synuclein蛋白異常聚集是PD發(fā)生的重要因素之一，在發(fā)病前減少聚集的α-synuclein蛋白，減輕對(duì)神經(jīng)元的損失，可有效地預(yù)防PD的發(fā)生。大量異常的α-synuclein蛋白在多巴胺神經(jīng)元內(nèi)積聚對(duì)其造成損害從而引起死亡被認(rèn)為是造成PD發(fā)生的重要原因〔11〕。因此，未來(lái)我們可以通過(guò)研究藥物抑制α-synuclein蛋白的異常聚集，從而阻止PD的發(fā)生，降低PD的發(fā)病率。總之，本研究結(jié)果為α-synuclein蛋白用于PD的診斷和開(kāi)發(fā)針對(duì)其降解藥物預(yù)防PD的發(fā)生提供了一個(gè)臨床依據(jù)。

LC3是人類在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第1種自噬體膜蛋白，它是自噬體的重要組成部分，其含量的多少與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)〔12〕。Schmid等〔12〕通過(guò)人為干擾SIAH1基因后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC3II的蛋白表達(dá)水平明顯降低，LC3的mRNA水平減低，細(xì)胞自噬活性降低。在人體內(nèi)目前發(fā)現(xiàn)LC3 有三種亞型，LC3a是其中之一，可以通過(guò)檢測(cè)其表達(dá)水平可以推斷出細(xì)胞的自噬水平。

本研究結(jié)果顯示血漿中LC3a蛋白可能作為PD生物標(biāo)志物，從而幫助臨床醫(yī)師對(duì)PD的診斷。同時(shí)也說(shuō)明PD患者自噬水平較正常人下降，自噬參與PD的發(fā)生。血漿中LC3a蛋白參與PD病程的進(jìn)展，可用于監(jiān)測(cè)其病情的進(jìn)展。本研究推測(cè)，PD患者的自噬水平下降，從而導(dǎo)致異常α-synuclein蛋白清除障礙，使其在神經(jīng)元內(nèi)積聚損失神經(jīng)元造成死亡，最終導(dǎo)致PD的發(fā)生。由此來(lái)看，自噬在PD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。通過(guò)藥物增強(qiáng)PD神經(jīng)元的自噬功能，清除神經(jīng)元內(nèi)有害物質(zhì)，可以挽救瀕臨死亡的神經(jīng)元，從而延緩PD病人病情的進(jìn)展，改善其生活質(zhì)量。

CacyBP/SIP是一種參與多領(lǐng)域和有多種功能的蛋白質(zhì)，廣泛參與細(xì)胞新陳代謝過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架重排、去磷酸化、泛素化、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞增殖分化等生化過(guò)程中起重要作用。CacyBP/SIP最初被確定為S100A6(calcyclin)靶標(biāo)，后來(lái)被認(rèn)定為Siah-1相互作用蛋白〔13〕。CacyBP/SIP在哺乳動(dòng)物不同組織類表達(dá)，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)高表達(dá)〔14〕。Filipek等〔15〕在研究CacyBP/SIP在培養(yǎng)的神經(jīng)元和年輕和老齡大鼠的腦神經(jīng)元中的定位實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在幼年大鼠的神經(jīng)元中CacyBP/SIP蛋白主要在神經(jīng)元內(nèi)胞體和突觸內(nèi)表達(dá)中，在老齡大鼠神經(jīng)元中CacyBP/SIP則主要在神經(jīng)元胞體表達(dá)。

目前對(duì)于CacyBP/SIP在神經(jīng)變性退行性疾病研究較少。阿爾茨海默病(AD)患者腦組織中的Tau蛋白常存在過(guò)度磷酸化，是正常功能喪失的重要原因之一。Tau蛋白在微管蛋白系統(tǒng)的含量是最高的，而微管蛋白系統(tǒng)是神經(jīng)元骨架的重要組成成分，對(duì)于維持細(xì)胞正常生理功能具有重要作用，CacyBP/SIP可以使tau蛋白磷酸化參與AD病理過(guò)程中。Wasik等〔16〕在研究AD患者的腦組織和具有AD的特征性AD模型的轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在AD患者和AD模型轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦中，CacyBP/SIP幾乎全部存在于神經(jīng)元胞體中，并檢測(cè)到AD患者腦組織中的Tau蛋白常存在過(guò)度磷酸化，說(shuō)明CacyBP/SIP可能在AD病理中起重要作用。

本研究說(shuō)明血漿中CacyBP/SIP不能用于PD的診斷。對(duì)于PD組患者于對(duì)照組血漿中CacyBP/SIP水平無(wú)差異，考慮其分子量大，不易通過(guò)血腦屏障進(jìn)入血漿，關(guān)于其在PD中的可能作用，尚待更進(jìn)一步的研究來(lái)證明。