王 欣 王 琪 孫涵穎，2 裴凱麗

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.長(zhǎng)崎大學(xué)水產(chǎn)環(huán)境科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)崎 852-8131)

0 引言

孕酮(Progesterone,P4)是由黃體分泌的一種類固醇激素，在哺乳動(dòng)物的妊娠、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用[1]。P4廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生保健[2]。但孕酮也是一種重要的內(nèi)分泌干擾物，當(dāng)其水平超過(guò)正常范圍時(shí)，則會(huì)對(duì)人體內(nèi)分泌功能如代謝、生物合成等產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3-4]，影響男性的激素分泌[5]，導(dǎo)致乳腺癌和肺癌的發(fā)生[6]。在現(xiàn)代牛奶生產(chǎn)中，一方面奶牛在妊娠后期，血清中的雌激素水平顯著提高[7]，另一方面為了提高出奶率使用孕酮等激素誘導(dǎo)奶牛泌乳，從而導(dǎo)致牛奶孕酮含量較高。據(jù)估計(jì)大約75%的市售牛奶來(lái)源于妊娠奶牛[8-9]。牛奶和奶制品是食品體系中類固醇激素和生長(zhǎng)因子的來(lái)源之一,因此，有必要對(duì)牛奶中的P4殘留水平進(jìn)行檢測(cè)。

目前，P4的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要是色譜法[10-12]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)成為激素殘留檢測(cè)的首選方法。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法更以高效、快速、靈敏等特點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用[13]。但此類檢測(cè)方法的前處理步驟耗時(shí)長(zhǎng)且儀器價(jià)格昂貴。另一類是酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[14]、電化學(xué)分析法[15]等新型檢測(cè)方法。ELISA應(yīng)用于大量樣品的篩查,但涉及多個(gè)洗滌步驟，耗時(shí)長(zhǎng)且假陽(yáng)性概率高。而電化學(xué)傳感器的靈敏度和特異性不但受介質(zhì)條件的影響，且穩(wěn)定性較差[16]。因此，開(kāi)發(fā)新型的快速、操作簡(jiǎn)單的P4檢測(cè)方法很有必要。

基于磁性納米粒子(Magnetic nanoparticles，MNPs)的磁弛豫開(kāi)關(guān)傳感器(Magnetic relaxation switch sensor,MRS)是一種新型的生物傳感檢測(cè)技術(shù)[17]，與傳統(tǒng)依賴于光學(xué)的檢測(cè)方法相比，MRS的響應(yīng)機(jī)理依賴于磁信號(hào)而不是光信號(hào)，因此,該方法的背景值受樣品基質(zhì)的影響較小，且該方法樣品前處理簡(jiǎn)單，可用于渾濁、復(fù)雜體系中目標(biāo)物的檢測(cè)[18]。與單組分材料相比，Au@Fe3O4復(fù)合納米粒子具有更強(qiáng)的光學(xué)、催化性能及化學(xué)和熱穩(wěn)定性[19]，是一種新穎的復(fù)合納米粒子。當(dāng)前，已有研究基于Au@Fe3O4進(jìn)行了三聚氰胺[20]、農(nóng)藥福美雙[21]、神經(jīng)遞質(zhì)[22]等目標(biāo)物的生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用于癌細(xì)胞的光熱消除和多模態(tài)癌癥成像[23]。但目前尚未有報(bào)道利用磁弛豫開(kāi)關(guān)傳感器進(jìn)行孕酮檢測(cè)的研究。

因此，本文以建立簡(jiǎn)單、靈敏的孕酮磁弛豫傳感快速分析技術(shù)為目標(biāo)，在合成Au@Fe3O4磁納米粒子并使用孕酮的特異性核酸適配體(Aptamer，Apt)進(jìn)行功能化修飾的基礎(chǔ)上構(gòu)建磁弛豫開(kāi)關(guān)傳感器，對(duì)各實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)方法的特異性、穩(wěn)定性及靈敏度加以驗(yàn)證，分析方法對(duì)牛奶中孕酮檢測(cè)的可行性，從而為動(dòng)物食品樣品中P4的快速檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日立公司，日本)；108AUTO型真空濺射儀(Cressington公司，英國(guó))；UV-9100 D型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；JEOL2100F型透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)；Brookhaven 173plus型動(dòng)態(tài)光散射儀(Brook公司，美國(guó))；PWC254型分析天平(武漢艾德姆衡器有限公司)；SynergyH4型多功能酶標(biāo)儀(Biotek公司，美國(guó))；JJ-1型電動(dòng)機(jī)械攪拌器(常州市蘇越實(shí)驗(yàn)儀器廠)；85-2A型恒溫磁力攪拌器(金壇市科析儀器有限公司)；高斯3000型磁分離用永磁體(上海正國(guó)磁業(yè)有限公司)；KQ-50DE型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；XW-60A型渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；Agilent 720型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)儀(北京安捷倫有限公司)；MiniPQ 001-20-015V型低場(chǎng)核磁共振造影劑弛豫分析儀(蘇州紐邁分析儀器股份有限公司)。

孕酮適配體[24](5′-GCATCACACACCGATAC TCACCCGCCTGATTAACATTAGCCCACCGCCCACCC CCGCTGC-3′)(60 mer)通過(guò)HPLC方法純化,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。四水合硫酸亞鐵(FeSO4·4H2O)、六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、氨水(NH3·H2O)，上述試劑均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸(99.5%)、氯金酸(48%～50%)、二水合檸檬酸鈉等(99%)、雌二醇(98%)、雙酚A(>99%)、甲基睪酮(98%)、己烯雌酚(99%)、孕酮(99%)、甲醇(99.8%)，購(gòu)自麥克林試劑有限公司(上海)；牛奶樣品購(gòu)于本地超市；去離子水，自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Fe3O4及Au@Fe3O4納米粒子合成

在文獻(xiàn)[25]方法的基礎(chǔ)上以共沉淀法制備Fe3O4納米粒子，將400 mg FeCl3·6H2O和200 mg FeSO4·4H2O溶于20 mL去離子水中，保鮮膜封口。50℃油浴下電動(dòng)機(jī)械攪拌至完全溶解。在不斷攪拌的狀態(tài)下逐滴加入1 mL 28%的氨水溶液，直至體系的pH值為10。10 min內(nèi)將體系溫度升高至75℃，持續(xù)攪拌反應(yīng)，再逐滴加入1 mL濃度1 mol/L的檸檬酸溶液75℃熟化50 min后冷卻至室溫(20℃)。磁吸分離并用去離子水洗滌產(chǎn)物以除去表面雜質(zhì)，將得到的產(chǎn)物重新分散于200 mL去離子水中，反復(fù)洗滌3次，最后經(jīng)磁分離獲得的Fe3O4納米顆粒分散于15 mL去離子水，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)而以文獻(xiàn)[26]的方法為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)，在持續(xù)加熱并攪拌的條件下，向100 mL加熱至沸騰的去離子水中準(zhǔn)確逐滴加入1.2 mL的納米Fe3O4溶液(0.1 mol/L)、1.4 mL的氯金酸溶液(20 mmol/L)及1.2 mL的二水合檸檬酸鈉溶液(100 mmol/L)，反應(yīng)15 min。磁分離收集得到Au@Fe3O4，重新分散于10 mL去離子水中，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2反應(yīng)條件優(yōu)化

(1)適配體濃度

向10 μL的Au@Fe3O4溶液準(zhǔn)確移加不同體積的適配體溶液(100 μmol/L)，使體系中適配體與Au@Fe3O4納米粒子的體積比分別為0.5、1、2、3、4、5,室溫孵育并渦旋振蕩1.5 h后磁分離得到Apt-Au@Fe3O4，重新分散于10 μL去離子水中。用酶標(biāo)儀測(cè)量上清液、相應(yīng)濃度適配體原始溶液及Apt-Au@Fe3O4在200～800 nm的吸收光譜。比較其在260 nm處的吸光度并計(jì)算ΔA260(相同濃度下的適配體原始溶液與Apt-Au@Fe3O4在260 nm處的吸光度差值)，以此反映與納米粒子結(jié)合的適配體的量。同時(shí)，計(jì)算體系的A650/A530(A650、A530分別表示650、530 nm處的吸光度)，以此反映Fe3O4@Au納米粒子的聚集程度。

(2)適配體與Au@Fe3O4孵育時(shí)間

使體系中適配體與Au@Fe3O4納米粒子體積比為3∶1，室溫孵育并渦旋振蕩0.5～2.5 h后，磁分離后將Apt-Au@Fe3O4重新分散于10 μL去離子水中。用酶標(biāo)儀測(cè)量上清液、相應(yīng)濃度適配體原始溶液及Apt-Au@Fe3O4在200～800 nm的吸收光譜，比較其在260 nm處的吸光度,計(jì)算ΔA260及A650/A530。

(3)NaCl濃度

使體系中NaCl的濃度為0.02～0.05 mol/L，渦旋振蕩15 s后孵育5 min，測(cè)量其在200～800 nm的吸收光譜，比較其在260 nm處的吸光度，并計(jì)算A650/A530。以不含有NaCl的Apt-Au@Fe3O4體系為對(duì)照。

1.2.3檢測(cè)條件優(yōu)化

孕酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.32 g孕酮，加入5 mL甲醇中，25℃水浴超聲30 min使其充分溶解后，定容至10 mL，即得0.1 mol/L的P4標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

(1)Apt-Au@Fe3O4稀釋倍數(shù)

分別取Apt-Au@Fe3O4分散液(3～15 μL)于色譜瓶中，加入去離子水將體系稀釋100、200、300、400、500倍，超聲分散30 s，加入150 μL NaCl (0.2 mol/L)35℃水浴孵育5 min。再加入150 μL 的P4溶液(100 nmol/L)，使體系中P4的濃度為10 nmol/L，將色譜瓶置于低場(chǎng)核磁專用試管中(內(nèi)徑為15 mm)，35℃孵育15 min后在以下參數(shù)條件下進(jìn)行LF-NMR(低場(chǎng)核磁共振)檢測(cè)：Carr-Purcell-Meiboom-Grill序列，采樣頻率125 kHz，重復(fù)采樣等待時(shí)間3 000 ms，回波個(gè)數(shù)15 000,回波時(shí)間0.5 ms，重復(fù)采樣次數(shù)4。分析體系單組分橫向弛豫時(shí)間的變化ΔT2w。以不含有P4的150 μL標(biāo)準(zhǔn)液為空白對(duì)照組，ΔT2w計(jì)算公式為

ΔT2w=T2w(sample)-T2w(blank)

(1)

式中T2w(sample)——不同濃度孕酮的實(shí)驗(yàn)組單組分橫向弛豫時(shí)間

T2w(blank)——不含有P4的標(biāo)準(zhǔn)液?jiǎn)谓M分橫向弛豫時(shí)間

(2)Apt-Au@Fe3O4與孕酮孵育時(shí)間

在優(yōu)化的Apt-Au@Fe3O4稀釋倍數(shù)下，將納米粒子與10 nmol/L的P4在35℃水浴分別孵育5、10、15、20、25 min后進(jìn)行LF-NMR檢測(cè)，分析體系單組分橫向弛豫時(shí)間T2w的變化。

1.2.4檢測(cè)方法性能分析

(1)工作曲線建立

準(zhǔn)確量取3.75 μL Apt-Au@Fe3O4溶液于色譜瓶中，使用去離子水稀釋400倍，超聲分散30 s，加入150 μL NaCl (0.2 mol/L)后放置于35℃水浴鍋中孵育5 min。加入150 μL P4濃度分別為10～400 nmol/L的溶液，使體系中P4的濃度分別為1～40 nmol/L，將色譜瓶置于15 mm LF-NMR專用試管中，35℃水浴孵育15 min后進(jìn)行LF-NMR檢測(cè)，分析體系單組分橫向弛豫時(shí)間T2w的變化。

(2)方法靈敏度評(píng)估

在確定檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，向檢測(cè)體系中加入150 μL去離子水作為空白樣品進(jìn)行分析，分別測(cè)定11個(gè)空白樣品的單組分橫向弛豫時(shí)間T2w，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限(Limitation of detection，LOD)。

(3)方法特異性評(píng)估

用建立的方法分別對(duì)濃度均為10 nmol/L的甲基睪酮(Methyltestosterone，MT)、己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)、雙酚A(Bisphenol A，BPA)、雌二醇(17β-estradiol，E2)體系進(jìn)行LF-NMR檢測(cè)，分析體系單組分橫向弛豫時(shí)間T2w的變化，并與P4的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.5實(shí)際樣品檢測(cè)

以牛奶為實(shí)際檢測(cè)樣品，參照文獻(xiàn)[27]的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。向購(gòu)買的牛奶中加入P4使其濃度為20～100 nmol/L。向4 mL 牛奶樣品中加入 2 mL三氯乙酸(10%)和2 mL氯仿，渦旋振蕩1 min，超聲15 min后，以13 000 r/min離心10 min，再取上清以10 000 r/min離心3 min，取上清液進(jìn)行LF-NMR檢測(cè)，分析體系單組分橫向弛豫時(shí)間T2w的變化，計(jì)算ΔT2w，繪制工作曲線，計(jì)算LOD。

加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)：使牛奶體系中P4的濃度分別為40、60、80 nmol/L，每個(gè)添加水平平行檢測(cè)3次，計(jì)算加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,加標(biāo)回收率[28]計(jì)算公式為

Q=(C2-C1)/C0×100%

(2)

式中Q——孕酮加標(biāo)回收率

C1——未加標(biāo)試樣即空白樣濃度

C2——孕酮加標(biāo)試樣濃度

C0——加標(biāo)濃度

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

基于核酸適配體功能化Au@Fe3O4納米粒子的磁弛豫開(kāi)關(guān)傳感器檢測(cè)孕酮的原理如圖1所示。通過(guò)核酸堿基上N和O與金殼間的范德華力及疏水作用[29]，孕酮特異性核酸適配體可吸附于Au@Fe3O4納米粒子的表面形成Apt-Au@Fe3O4體系。當(dāng)體系中無(wú)孕酮存在時(shí)，核酸適配體可以保護(hù)Au@Fe3O4納米粒子，避免其在NaCl作用下發(fā)生聚集，使Au@Fe3O4粒子在一定鹽濃度下仍均勻分散于體系中，且在磁場(chǎng)作用下粒子周圍產(chǎn)生磁場(chǎng)的不均勻性，使周圍水分子中的氫質(zhì)子有效失相，加快體系的整體衰減，表現(xiàn)為較小的T2w[30-31]。當(dāng)體系中存在孕酮時(shí)，由于目標(biāo)物與核酸適配體之間具有更強(qiáng)的親和力，故核酸適配體從Au@Fe3O4粒子表面脫落而與孕酮結(jié)合，失去適配體保護(hù)的Au@Fe3O4粒子則在NaCl的作用下發(fā)生聚集。當(dāng)聚集的納米粒子團(tuán)簇粒徑在100～1 000 nm時(shí)，體系中均勻分散的納米粒子數(shù)量相對(duì)減少，由其導(dǎo)致的磁場(chǎng)的不均勻性減小，故表現(xiàn)為較大的T2w[32-33]。T2w變化的程度又取決于靶標(biāo)(孕酮)的濃度。因此，可通過(guò)分析體系T2w的變化與目標(biāo)物濃度的變化規(guī)律，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)體系中目標(biāo)物(孕酮)的檢測(cè)。

圖1 基于核酸適配體功能化Au@Fe3O4納米粒子的磁弛豫開(kāi)關(guān)傳感器檢測(cè)孕酮的原理圖Fig.1 Schematic illustration of proposed magnetic relaxation switch sensor for detection of progesterone with Apt-Au@Fe3O4 as indicator

2.2 Fe3O4@Au粒子制備與表征

制備得到的Fe3O4和Au@Fe3O4納米粒子的表征結(jié)果如圖2所示。

圖2 Fe3O4及Au@Fe3O4納米粒子的表征Fig.2 Characterization of Fe3O4 and Au@Fe3O4 NPs

如圖2a所示，F(xiàn)e3O4的平均水合粒徑為179.11 nm，而分散系數(shù)(Polydispersity index,PDI)為0.01，說(shuō)明Fe3O4在溶液中呈單分散狀態(tài)。雖然Au@Fe3O4的平均水合粒徑及PDI相對(duì)增大，分別為260.65 nm及0.21，但其粒徑分布較均勻，且分散良好。

圖2b表明，與Au NPs的紫外可見(jiàn)吸收光譜相似，Au@Fe3O4也在波長(zhǎng)530 nm左右出現(xiàn)了金的特征吸收峰，表明已成功在Fe3O4表面包覆了金殼[34]。而電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)分析表明，Au@Fe3O4復(fù)合納米粒子的Fe離子與Au離子的濃度分別為6 mmol/L和1.2 mmol/L。

圖2c中，由于重原子效應(yīng)[35]，故圖中Au@Fe3O4納米粒子顏色相對(duì)加深。Au@Fe3O4納米粒子的直徑約為20 nm，呈均一的橢球狀，分散性良好。而由圖2d可知，當(dāng)體系中含有目標(biāo)物時(shí)，Au@Fe3O4粒子在鹽的作用下聚集，粒子直徑增大且形狀變得不規(guī)則。

橫向弛豫率r2是影響磁弛豫開(kāi)關(guān)傳感器靈敏度的重要因素之一[33]，其可由1/T2w與Fe濃度的函數(shù)的斜率計(jì)算所得[36]。如圖2e所示，與Fe3O4的橫向弛豫率(249.23 mmol/(L·s))相比，由于金殼的包覆減少了納米粒子周圍水質(zhì)子的體積，從而降低了r2[37]，故Au@Fe3O4NPs的橫向弛豫率為87.90 mmol/(L·s)。然而，該橫向弛豫率仍遠(yuǎn)高文獻(xiàn)[38]等制備的金氧化鐵復(fù)合納米粒子的橫向弛豫率(20.46 mmol/(L·s))，這表明制備的Au@Fe3O4具有良好的磁特性，可用于磁弛豫傳感器的構(gòu)建。

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1適配體濃度

Au@Fe3O4納米粒子與核酸適配體的比例對(duì)于識(shí)別靶標(biāo)、提高方法的靈敏度及穩(wěn)定性十分重要。不同適配體比例下，反應(yīng)體系孵育前后(磁分離后的上清液)的紫外可見(jiàn)吸收光譜如圖3a所示。由圖3a可知，反應(yīng)體系的紫外可見(jiàn)吸收曲線在孵育前后均在260～290 nm處出現(xiàn)了核酸適配體的特征吸收峰，且孵育并經(jīng)磁分離后的上清液的吸收峰相對(duì)降低。例如，當(dāng)適配體與Au@Fe3O4納米粒子體積比為3時(shí)，孵育前反應(yīng)體系的A260為2.73，而孵育后的上清液的A260顯著降低為1.08，這說(shuō)明體系中的適配體已成功吸附于Au@Fe3O4納米粒子表面[39]。

圖3 不同適配體與Au@Fe3O4體積比下體系的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖和ΔA260 Fig.3 UV-visible absorption spectra and ΔA260 of system with different ratios of aptamers to Au@Fe3O4

ΔA260可以反映與納米粒子結(jié)合的適配體的量。如圖3b(圖中不同字母表示差異顯著，下同)所示，隨著適配體與Au@Fe3O4體積比從0.5增大至3，體系的ΔA260從0.11逐漸增至1.11，說(shuō)明當(dāng)Au@Fe3O4納米粒子相對(duì)豐富，而適配體數(shù)量相對(duì)較少時(shí)，此時(shí)，隨著適配體比例的增加，通過(guò)靜電作用吸附在Au@Fe3O4表面的適配體數(shù)量隨之增加。而當(dāng)Au@Fe3O4表面吸附的適配體數(shù)量已達(dá)飽和后，再增大適配體的比例則ΔA260的變化不顯著。例如，繼續(xù)增大至5倍時(shí)，ΔA260僅為1.07?？傮w而言，當(dāng)適配體與Au@Fe3O4體積比為3時(shí)，已可使Au@Fe3O4表面吸附足量的適配體，滿足對(duì)靶標(biāo)識(shí)別和檢測(cè)的需要。

此外，體系的A650/A530可以反映適配體的添加所引起的Au@Fe3O4納米粒子的聚集程度[40]，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)適配體與Au@Fe3O4體積比由0.5增加至3時(shí)，體系的A650/A530在0.91～0.92之間，變化不顯著，說(shuō)明在此范圍內(nèi)，Apt-Au@Fe3O4粒子分散良好。綜合考慮，適配體與Au@Fe3O4體積比為3較為適當(dāng)。

圖4 不同適配體與Au@Fe3O4體積比下體系的A650/A530Fig.4 A650/A530 of system with different ratios of aptamers to Au@Fe3O4

2.3.2Au@Fe3O4與適配體孵育時(shí)間

孵育時(shí)間會(huì)影響適配體與Au@Fe3O4納米粒子的吸附過(guò)程。在適配體與Au@Fe3O4體積比為3的條件下，孵育時(shí)間對(duì)Au@Fe3O4吸附適配體的影響如圖5所示。

圖5 不同孵育時(shí)間下適配體與Au@Fe3O4體系的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖及ΔA260Fig.5 UV-visible absorption spectra and ΔA260 of system with different incubation time of aptamers and Au@Fe3O4

由圖5a可知，與孵育前體系的A260(2.21)相比，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，孵育并經(jīng)磁分離后的上清液的A260逐漸降低，說(shuō)明隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附在Au@Fe3O4粒子表面的適配體數(shù)量相對(duì)增加。其中，當(dāng)孵育1.5 h時(shí)，上清液的A260最低，僅為0.92。圖5b也表明，隨孵育時(shí)間從0.5 h逐漸延長(zhǎng)至1.5 h，ΔA260從0.35顯著增加至1.23，但繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間對(duì)ΔA260的影響不明顯。說(shuō)明孵育1.5 h足以保證適配體充分吸附于Au@Fe3O4納米粒子上。此外，由圖6可知，當(dāng)孵育時(shí)間在2 h內(nèi)，體系的A650/A530無(wú)顯著改變，說(shuō)明Apt-Au@Fe3O4粒子分散良好；但當(dāng)孵育2.5 h時(shí)，體系的A650/A530顯著增大至0.93，說(shuō)明此時(shí)納米粒子發(fā)生了一定程度的聚集，不利于后續(xù)檢測(cè)的進(jìn)行。

圖6 不同孵育時(shí)間下適配體與Au@Fe3O4體系的A650/A530Fig.6 A650/A530 of system with different incubation time of aptamers and Au@Fe3O4

2.3.3NaCl濃度

對(duì)本研究中所設(shè)計(jì)的磁弛豫傳感器而言，在孕酮和Au@Fe3O4對(duì)適配體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合后，磁納米的聚集與NaCl濃度密切相關(guān)，但NaCl濃度過(guò)高則可能導(dǎo)致Apt-Au@Fe3O4的聚集[41]。NaCl濃度對(duì)Apt-Au@Fe3O4體系的A650/A530的影響如圖7所示。

圖7 NaCl濃度對(duì)體系A(chǔ)650/A530的影響Fig.7 A650/A530 of system under different NaCl concentrations with reaction time of 10 min and 25 min

圖7表明，整體而言，孵育10 min時(shí)，體系的A650/A530無(wú)顯著性變化，說(shuō)明Apt-Au@Fe3O4復(fù)合納米粒子體系呈良好的分散狀態(tài)。但孵育25 min時(shí)，體系的A650/A530變化有所不同。當(dāng)NaCl濃度低于0.02 mol/L時(shí)，體系的A650/A530與對(duì)照組的差異不顯著，但當(dāng)NaCl濃度大于0.02 mol/L后，體系的A650/A530顯著增加(P<0.05)。例如，當(dāng)NaCl濃度為0.03 mol/L時(shí)，體系的A650/A530已增大至0.96，說(shuō)明Apt-Au@Fe3O4納米粒子發(fā)生了一定程度的聚集。因此，為了避免因NaCl濃度過(guò)高而引起納米粒子的聚集，應(yīng)使反應(yīng)體系的NaCl濃度不超過(guò)0.02 mol/L，體系的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制在25 min內(nèi)。

2.4 檢測(cè)體系優(yōu)化

2.4.1Apt-Au@Fe3O4的稀釋倍數(shù)

在孕酮濃度為10 nmol/L時(shí)，不同Apt-Au@Fe3O4濃度下體系的T2w及ΔT2w的變化如圖8所示。

圖8 Apt-Au@Fe3O4濃度對(duì)體系T2w及ΔT2w的影響Fig.8 Effect of concentration of Apt-Au@Fe3O4 solutions on T2w and ΔT2w

由圖8a可知，隨著Apt-Au@Fe3O4納米粒子稀釋倍數(shù)的增大，實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的T2w均相對(duì)增大，且實(shí)驗(yàn)組的T2w均大于對(duì)照組，例如，當(dāng)從稀釋100倍增大到500倍時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的T2w從179.94 ms增大至635.95 ms，，而對(duì)照組的T2w則從151.38 ms增加至605.97 ms。由圖8b可知，隨Apt-Au@Fe3O4稀釋倍數(shù)的增加，體系的ΔT2w有所不同。相比之下，當(dāng)稀釋100倍時(shí)，體系的ΔT2w最小，僅為28.56 ms；而當(dāng)稀釋400倍時(shí)，體系的ΔT2w顯著增大，為94.95 ms，這有利于對(duì)孕酮的靈敏檢測(cè)，故應(yīng)將制得的Apt-Au@Fe3O4稀釋400倍后用于后續(xù)的檢測(cè)。

均勻分散于體系中的Apt-Au@Fe3O4納米顆粒在磁場(chǎng)作用下會(huì)產(chǎn)生磁場(chǎng)的不均勻性，使周圍水分子中的氫質(zhì)子有效失相，加速水分子的自擴(kuò)散，表現(xiàn)為體系的衰減加快及較小的T2w[42]。隨稀釋倍數(shù)的增加，體系中分散的納米粒子數(shù)目相對(duì)減少，故其對(duì)水分子自擴(kuò)散的影響相對(duì)減弱，表現(xiàn)為體系的衰減過(guò)程相對(duì)延長(zhǎng)，而T2w相對(duì)增大。加入目標(biāo)物后，適配體因與目標(biāo)物特異性結(jié)合而從Au@Fe3O4表面脫落，游離的Au@Fe3O4則在NaCl的作用下發(fā)生聚集并沉降，這也使體系中均勻分散的Apt-Au@Fe3O4相對(duì)減少，故對(duì)周圍水質(zhì)子的影響相對(duì)減小，使體系的整體衰減過(guò)程相對(duì)延長(zhǎng)，T2w相對(duì)增大。

2.4.2Apt-Au@Fe3O4與孕酮的孵育時(shí)間

Apt-Au@Fe3O4與孕酮的孵育時(shí)間對(duì)體系的磁弛豫響應(yīng)的影響如圖9所示。

圖9 孵育時(shí)間對(duì)體系T2w及ΔT2w的影響Fig.9 Effect of incubation time of Apt-Au@Fe3O4 and progesterone on T2w and ΔT2w

圖9a表明，在孵育過(guò)程中，空白組的T2w的變化相對(duì)較小，介于457.87～481.48 ms之間。隨著孵育時(shí)間從5 min延長(zhǎng)至20 min，實(shí)驗(yàn)組的T2w由540.68 ms相對(duì)增加至569.93 ms，說(shuō)明Apt-Au@Fe3O4與孕酮的反應(yīng)趨于充分，但當(dāng)孵育時(shí)間延長(zhǎng)至25 min時(shí)，T2w則相對(duì)下降。圖9b中ΔT2w的變化也表明，Apt-Au@Fe3O4與孕酮的孵育時(shí)間對(duì)體系的ΔT2w有明顯的影響。孵育5 min時(shí)，由于P4與Apt-Au@Fe3O4還未充分反應(yīng)，因此磁弛豫信號(hào)變化相對(duì)較小，ΔT2w僅為59.19 ms；隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，Apt-Au@Fe3O4與P4反應(yīng)趨于充分，ΔT2w相對(duì)增大，尤其是在孵育15 min時(shí)，體系的ΔT2w已顯著增大至94.95 ms，繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至25 min時(shí)，ΔT2w則出現(xiàn)了顯著的下降(59.96 ms)。導(dǎo)致ΔT2w下降的原因可能是NaCl的長(zhǎng)時(shí)間作用，導(dǎo)致部分納米粒子產(chǎn)生聚集，溶液中分散的納米粒子減少，加入目標(biāo)物前后納米粒子聚集的凈變化量減少。因此，選擇Apt-Au@Fe3O4與P4孵育時(shí)間為15 min。

2.5 靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線

為評(píng)價(jià)該磁弛豫傳感器對(duì)目標(biāo)物(孕酮)的響應(yīng)度，在以上確定的檢測(cè)條件下，分析P4濃度為1～40 nmol/L時(shí)體系ΔT2w的變化，結(jié)果如圖10所示。

圖10 水體系中孕酮濃度與ΔT2w的線性關(guān)系Fig.10 Effect of progesterone concentration on ΔT2w

由圖10可知，隨著P4濃度的增加，檢測(cè)得到的ΔT2w從77.64 ms逐漸增大至162.44 ms，且ΔT2w與P4濃度在1～40 nmol/L范圍內(nèi)呈良好線性相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果說(shuō)明可基于ΔT2w對(duì)體系中的P4濃度進(jìn)行定量分析，計(jì)算得到該方法的最低檢測(cè)限(LOD)為4.97 nmol/L (1.56 μg/kg)。

表1列出了目前部分孕酮的檢測(cè)方法的檢出限、檢測(cè)線性范圍、檢測(cè)對(duì)象、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等信息。本磁弛豫傳感器的檢出限為4.97 nmol/L，優(yōu)于熒光檢測(cè)方法和HPLC-MS/MS的LOD。而與更為靈敏的LC-MS/MS及電化學(xué)分析方法相比，磁弛豫傳感器則顯示出了更好的回收率。低于10%的標(biāo)準(zhǔn)偏差也顯示了此傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

表1 孕酮檢測(cè)方法的對(duì)比Tab.1 Comparison of detection methods for progesterone

2.6 方法特異性

以所建立的磁弛豫分析法對(duì)孕酮及4種內(nèi)分泌干擾物(甲基睪酮、己烯雌酚、雙酚A、雌二醇)進(jìn)行分析，以評(píng)價(jià)該方法的特異性，結(jié)果如圖11所示。

圖11 磁弛豫開(kāi)關(guān)傳感器檢測(cè)孕酮的特異性分析Fig.11 Selectivity of magnetic relaxation sensor for progesterone detection

圖11表明，當(dāng)檢測(cè)濃度為10 nmol/L時(shí)，孕酮體系的ΔT2w(94.95 ms)顯著高于其他4種內(nèi)分泌干擾物體系的ΔT2w(p<0.05)，即使是具有與孕酮類似的環(huán)戊烷及多氫菲環(huán)結(jié)構(gòu)的甲基睪酮和雌二醇，其ΔT2w分別為70.32 ms和63.59 ms，均與孕酮體系有明顯區(qū)分。這說(shuō)明本方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)孕酮的特異性識(shí)別和檢測(cè)。

2.7 實(shí)際加標(biāo)樣品檢測(cè)

以本方法對(duì)牛奶加標(biāo)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖12所示。

圖12 牛奶體系中孕酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.12 Calibration curve for progesterone in milk

圖12表明，當(dāng)牛奶體系中的孕酮濃度為 20～100 nmol/L時(shí)，體系的ΔT2w與孕酮濃度間呈良好的線性關(guān)系。

計(jì)算可得方法的檢出限(LOD)為13.60 nmol/L (4.28 μg/kg)。我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 2069—2011)[47]規(guī)定的牛奶中孕酮含量的檢測(cè)方法為高效液相色譜-質(zhì)譜法，其LOD為1 μg/kg，雖然該方法比本研究具有更低的LOD，靈敏度較高，但相對(duì)而言，該方法檢測(cè)不僅需要較為昂貴的設(shè)備，而且過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而本方法的檢測(cè)過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，單次檢測(cè)時(shí)間僅為15 min，且對(duì)孕酮具有很好的檢測(cè)特異性，可作為牛奶樣品中孕酮的初篩快檢方法。

此外，也進(jìn)行了牛奶體系中孕酮的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。表2表明，該方法對(duì)牛奶體系中孕酮檢測(cè)時(shí)的加標(biāo)回收率為99.21%～103.45%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于9.02%，表明本文方法的檢測(cè)精密度較高，準(zhǔn)確性較好，可用于實(shí)際牛奶樣品中孕酮的快速檢測(cè)。

表2 牛奶樣品中孕酮的加標(biāo)回收結(jié)果Tab.2 Recoveries of progesterone in milk samples

3 結(jié)論

(1)對(duì)適配體功能化的Au@Fe3O4納米探針的構(gòu)建及磁弛豫開(kāi)關(guān)傳感器的檢測(cè)過(guò)程的多個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果如下：適配體與Au@Fe3O4體積比為3，適配體與Au@Fe3O4的孵育時(shí)間為1.5 h，NaCl濃度為0.02 mol/L，Apt-Au@Fe3O4納米粒子稀釋倍數(shù)為400，目標(biāo)物反應(yīng)時(shí)間為15 min。

(2)水體系中ΔT2w與孕酮濃度間呈良好的線性關(guān)系，線性區(qū)間為1～40 nmol/L，檢測(cè)限為4.97 nmol/L，且具有良好的特異性和靈敏度。

(3)以牛奶體系為對(duì)象，分析了該方法的實(shí)際應(yīng)用可行性。牛奶中孕酮的線性檢測(cè)區(qū)間為20～100 nmol/L，檢測(cè)限為13.60 nmol/L，加標(biāo)回收率為99.21%～103.45%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于9.02%。