韓政宏，段宇軒，徐善斌，王敬國，劉化龍，楊洛淼，賈 琰，辛 威，鄭洪亮，鄒德堂

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

水稻(Oryzasativa)是世界范圍內(nèi)最主要的糧食作物之一，為全球1/2以上的人口提供主要的食物來源[1]。近年來，人們對優(yōu)質(zhì)稻米的需求量逐漸增加，優(yōu)質(zhì)稻米除了有良好的食味品質(zhì)外，還應(yīng)該具有良好的外觀品質(zhì)。水稻粒型是稻米外觀品質(zhì)的重要構(gòu)成因素之一，對稻米的外觀品質(zhì)有直接影響。因此，通過改良粒型提高水稻外觀品質(zhì)，是近年來水稻育種的一個重要目標(biāo)。迄今為止，水稻中已有多個粒型相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)并克隆，如GSA1[2]、GW2[3]、GS2/GL2[4]、TGW2[5]、GS3[6]、OsLG3[7]、GL3.1/qGL3[8]、qLGY3/OsLG3b[9]、TGW3/GL3.3[10]、GL4[11]、qSW5/GW5[12]、GS5[13]、TGW6[14]、GW6a[15]、GL6[16]、GLW7[17]、GL7/GW7[18]、GW8[19]和GS9[20]等。其中，GS3、GL3.1/qGL3、TGW3/GL3.3和TGW6是水稻粒長性狀的主效基因，并對該性狀起負(fù)調(diào)控作用；而OsLG3、qLGY3/OsLG3b和GL4對水稻粒長性狀起正調(diào)控作用。GW2、TGW2和qSW5/GW5是對水稻粒寬性狀起負(fù)調(diào)控作用的主效基因，而GS5、GW6a和GW8對水稻粒寬性狀起正調(diào)控作用。GSA1、GS2、GL6和GLW7對水稻粒長和粒寬性狀都有正向調(diào)控作用。GL7/GW7正向調(diào)控粒長，但對粒寬起負(fù)調(diào)控作用；而GS9負(fù)調(diào)控粒長，但正向調(diào)控粒寬。對于一些負(fù)調(diào)控水稻粒型性狀的QTL，如GS3、GL3.1/qGL3、GW2、TGW2等，可通過弱等位基因或功能缺失等位基因替換的方法，快速、精確改良水稻粒型相關(guān)性狀[21]。這種方法可以靠2種生物技術(shù)來實現(xiàn)，一種是通過分子標(biāo)記輔助育種從供體材料中引入弱等位基因或功能缺失等位基因，另一種是通過CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)對負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行敲除。在水稻中，通過分子標(biāo)記輔助育種構(gòu)建近等基因系和準(zhǔn)確引入多個等位基因需要多年時間。此外，打破基因之間的連鎖也是一大難題[22]，難以廣泛應(yīng)用。然而，利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)，對負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行突變或敲除，可以方便、準(zhǔn)確、高效地實現(xiàn)對水稻粒型相關(guān)性狀的改良，相對于傳統(tǒng)育種還能縮短育種年限，加快優(yōu)良種質(zhì)資源的創(chuàng)制。

CRISPR/Cas9技術(shù)是繼ZFNs[23]技術(shù)和TALENs[24]技術(shù)之后的新型基因編輯技術(shù)[25]，CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種快速且高效的基因編輯工具，通過sgRNA(Single guide RNA)和Cas9(CRISPR associated protein 9)核酸酶對目的基因進(jìn)行定點編輯，sgRNA是一種具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，可以識別PAM(Protospacer adjacent motif)序列并引導(dǎo)Cas9(CRISPR associated protein 9)核酸酶對其進(jìn)行切割，在PAM序列上游的第3或第4個堿基處造成DNA雙鏈斷裂(DSB)[26]。隨后，生物體通過同源重組(Homologous direct recombination，HDR)修復(fù)和非同源末端連接2種方式進(jìn)行修復(fù)(Nonhomologous end joining，NHEJ)，在DNA雙鏈的修復(fù)過程中形成堿基的插入、缺失和替換等突變類型，從而對目的基因進(jìn)行編輯和改造。

CRISPR/Cas9技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種作物的遺傳育種研究中[27-33]，水稻作為單子葉模式作物，可利用CRISPR/Cas9技術(shù)在基因組水平上進(jìn)行定向編輯和改造。Zhang等[34]通過CRISPR/Cas9技術(shù)，在水稻W(wǎng)axy基因引入功能缺失突變，破壞Waxy正常表達(dá)，使稻米支鏈淀粉含量增加，水稻品種由非糯性變?yōu)榕葱?。Zheng等[35]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對水稻己糖激酶基因OsHXK1進(jìn)行敲除，上調(diào)水稻光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，且增加了水稻的光合產(chǎn)物和產(chǎn)量。Zeng等[36]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻基因OsPIN5b、GS3和OsNYB30同時進(jìn)行敲除，得到了高產(chǎn)且高耐寒性的長粒水稻品種。

本研究以圓粒型粳稻品種東富139、龍粳31和長粒型粳稻品種東農(nóng)427為研究材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)同時對水稻粒型基因GS3和GS9進(jìn)行敲除，得到了多個無轉(zhuǎn)基因成分且純合突變的長粒型突變株系，創(chuàng)制了多個長粒型粳稻品種，并且分析GS3和GS9功能缺失突變對粒型及其他性狀的影響，加快了長粒型粳稻品種的選育進(jìn)程，旨在為粳稻品種改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

受體材料：本研究以東富139(DF139)、龍粳31(LJ31)和東農(nóng)427(DN427)3個粳稻品種為試驗材料。其中，東富139和龍粳31粒型為圓粒型，稻谷長寬比1.7，東農(nóng)427粒型為中長粒型，長寬比2.0。

載體：試驗所用載體pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H雙元載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士惠贈。

1.2 敲除靶點設(shè)計及載體構(gòu)建

通過 NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得GS3(Os03g0407400)、GS9(Os09g0448500)的基因序列，利用 CRISPR-GE 在線網(wǎng)站[37](http：//skl.scau.edu.cn/)的“CRISPR Primer Designer”模塊設(shè)計GS3和GS9基因靶序列，在GS3第1外顯子設(shè)計2對靶點及接頭引物，在GS9第1外顯子設(shè)計1對靶點接頭引物，T1-F/R、T2-F/R及T3-F/R(表1)。并利用NCBI網(wǎng)站上Blast程序進(jìn)行篩選，未找到脫靶序列。

參照Ma等[38]的試驗方法分別構(gòu)建GS3敲除載體和GS3、GS9雙基因敲除載體。

表1 本研究中使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.3 質(zhì)粒擴繁及陽性克隆篩選

將構(gòu)建好的載體通過熱激法轉(zhuǎn)入Mach1-T1感受態(tài)大腸桿菌中，涂板培養(yǎng)并挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測，選取陽性菌落搖菌后提取質(zhì)粒，隨后用AscⅠ內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測，將酶切檢測無誤的質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入到EHA105感受態(tài)農(nóng)桿菌中。

1.4 T0植株的獲得

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CRISPR/Cas9表達(dá)載體轉(zhuǎn)入粳稻品種東富139、龍粳31和東農(nóng)427的愈傷組織，用潮霉素篩選出陽性愈傷組織并分化成T0植株。采用CTAB法[39]提取T0植株全基因組DNA，以潮霉素基因特異性引物Hyg-F/R進(jìn)行PCR擴增，檢測陽性植株。并設(shè)計引物GS3-seq-F/R和GS9-seq-F/R(表1)，分別擴增GS3和GS9基因靶點及其附近的序列，對所有轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物送至擎科生物技術(shù)有限公司(北京)進(jìn)行測序，測序結(jié)果使用兼并序列解碼(DSDecode)方法[40]進(jìn)行分析。

1.5 T1純合突變植株及無T-DNA原件植株的篩選

在T1植株分蘗期，取葉片提取全基因組DNA，利用GS3-seq-F/R和GS9-seq-F/R引物進(jìn)行PCR測序，篩選出純合突變的植株，再利用Hyg-F和Hyg-R引物在純合植株中篩選無T-DNA元件插入的植株，并將這些植株自交繁殖至T2。

1.6 T2植株農(nóng)藝性狀考察

種植東富139、龍粳31、東農(nóng)427野生型和T2無T-DNA元件插入的純合突變體植株，成熟后分別測量粒長、粒寬、千粒質(zhì)量、結(jié)實率及穗粒數(shù)。利用SPSS 18.0軟件對農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻GS3和GS9敲除靶點設(shè)計

本研究在GS3的第1外顯子設(shè)計了2對gRNA靶點接頭引物，在GS9第1外顯子處設(shè)計了1對gRNA靶點接頭引物，具體靶點信息見圖1。

圖1 GS3、GS9基因結(jié)構(gòu)及靶點位置Fig.1 Gene structure and target site of GS3，GS9

2.2 GS3和GS3、GS9基因表達(dá)載體的構(gòu)建

利用“金門”克隆法將帶有靶點的gRNA連接到Cas9的載體骨架上，構(gòu)建好的載體即為pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體(圖2)。

圖2 pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體Fig.2 pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA vector and pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA vector

2.3 T0轉(zhuǎn)基因陽性苗的獲得

分別用轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體的農(nóng)桿菌侵染3個粳稻品種的愈傷組織，在T0突變體植株成熟時，提取基因組DNA，用載體特異性引物Hyg-F/R進(jìn)行PCR檢測，篩選陽性植株。結(jié)果表明，共獲得轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體的陽性植株48株，其中東富139、龍粳31和東農(nóng)427分別獲得20，10，18株；轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體的陽性植株100株，其中東富139、龍粳31和東農(nóng)427分別獲得35，32，33株。

2.4 T0突變體GS3和GS9基因靶點突變類型分析

對已篩選的陽性植株，利用引物GS3-seq-F/R和GS9-seq-F/R進(jìn)行PCR擴增并測序分析，篩選得到的148株陽性植株中，檢測到GS3靶點突變植株125株，GS3靶點突變率為84%；對GS9基因進(jìn)行編輯，得到100株陽性植株，其中檢測到GS9靶點突變的植株共28株，GS9靶點的突變率為28%。在轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體的48株陽性植株中獲得45株突變植株，突變率高達(dá)93.75%。在轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體的100株陽性植株中獲得85株陽性突變植株，突變率為85%，其中東富139、龍粳31和東農(nóng)427分別篩選出GS3單基因突變植株19，15，23株，GS9單基因突變植株2，2，1株，GS3、GS9雙基因突變植株7，10，6株(表2)。

表2 轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體的T0植株測序Tab.2 Sequencing results of T0 plants transformed into pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA vector

2.5 T1純合無T-DNA元件植株篩選

為獲得東富139、龍粳31和東農(nóng)427 3個品種的GS3單基因、GS9單基因和GS3、GS9雙基因純合無T-DNA元件突變植株，在T1利用引物GS3-seq-F/R、GS9-seq-F/R和Hyg-F/R進(jìn)行PCR擴增并測序。最終獲得東富139背景下GS3單基因、GS9單基因和GS3、GS9雙基因純合無T-DNA元件突變植株3，2，2株；龍粳31背景下GS3單基因、GS9單基因和GS3、GS9雙基因純合無T-DNA元件突變植株各2株；東農(nóng)427背景下GS3單基因、GS9單基因和GS3、GS9雙基因純合無T-DNA元件突變植株4，2，1株。

在3個品種T1的gs3、gs9和gs3gs9純合無T-DNA元件突變體中各選1株繁殖至T2，并進(jìn)行農(nóng)藝性狀考察。詳細(xì)突變情況見圖3。

紅色堿基為插入；紅色虛線為堿基缺失；PAM序列用下劃線及藍(lán)色標(biāo)注。Base insertion was marked with red letters；Base deletion was marked with red dotted line；PAM sequence was marked with underscore and blue.

2.6 T2植株農(nóng)藝性狀分析

將T2突變株系分別與其對應(yīng)的野生型品種進(jìn)行粒長、粒寬、千粒質(zhì)量、結(jié)實率和穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀的比較分析(圖4)。

在3個粳稻品種中，gs3、gs9和gs3gs9突變體的粒長與野生型相比均顯著增加(圖5)。其中g(shù)s3突變體粒長較野生型增加了8%～17%，gs9突變體粒長較野生型增加了5%～15%，gs3gs9突變體粒長較野生型增加15%～21%，且每種突變體的粒長與其野生型相比都達(dá)到了顯著水平。東富139突變體的粒長較野生型增加16%～21%，龍粳31突變體的粒長較野生型增加11%～19%，東農(nóng)427突變體的粒長較野生型增加5%～15%，其中東富139的gs3gs9突變體粒長增加幅度最大，為21%；而東農(nóng)427的gs9突變體增加幅度最小，為5%。GS3、GS9單基因突變都能顯著增加水稻粒長，而GS3、GS9雙基因突變對水稻粒長的影響，表現(xiàn)為2個基因的加性效應(yīng)。

在粒寬方面，同一品種中，gs3突變體的粒寬與野生型相比，都沒有顯著變化；而gs9和gs3gs9突變體的粒寬都減少，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)，其中g(shù)s9突變體的粒寬較野生型相比減少了7%～13%，gs3gs9突變體粒寬較野生型相比減少了8%～12%(圖6)。不同品種的gs9、gs3gs9突變體的粒寬較野生型粒寬顯著減少。說明GS3單基因突變對粒寬沒有顯著影響，而GS9單基因突變可顯著減少水稻粒寬，在gs3gs9突變體中，粒寬減少主要是GS9的基因突變造成的影響。

圖4 3個粳稻品種野生型及突變體粒型比較Fig.4 Comparison of grain size of wild type and mutant in three japonica rice varieties

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖6—9同。Different small letters show significantly different at 0.05.The same as Fig.6—9.

圖6 3個粳稻品種野生型及突變體粒寬比較Fig.6 Comparison of grain width of wild type and mutant in three japonica rice varieties

在千粒質(zhì)量方面，3個品種的gs9突變體千粒質(zhì)量與野生型相比，沒有顯著差異；而gs3和gs3gs9突變體的千粒質(zhì)量與野生型相比都顯著增加，且增加幅度相近。其中g(shù)s3突變體千粒質(zhì)量較野生型增加8%～15%，gs3gs9突變體較野生型增加10%～13%(圖7)。這一結(jié)果表明，GS9基因突變對千粒質(zhì)量性狀無顯著影響，GS3基因突變可增加水稻千粒質(zhì)量，gs3gs9突變體千粒質(zhì)量增加，主要是GS3單基因的效應(yīng)。在結(jié)實率方面，3個品種突變體的結(jié)實率與野生型植株相比均沒有顯著差異(圖8)。在穗粒數(shù)方面，3個品種的突變體中的穗粒數(shù)都略微減少，但都未達(dá)到顯著水平(圖9)。

圖7 3個粳稻品種野生型及突變體千粒質(zhì)量比較Fig.7 Comparison of 1000-grain weight of wild type and mutant in three japonica rice varieties

圖8 3個粳稻品種野生型及突變體結(jié)實率比較Fig.8 Comparison of seed-setting rate of wild type and mutant in three japonica rice varieties

圖9 3個粳稻品種野生型及突變體穗粒數(shù)比較Fig.9 Comparison of grain number per panicle of wild type and mutant in three japonica rice varieties

3 結(jié)論與討論

將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于作物種質(zhì)資源的改良，不僅具備便捷、高效等優(yōu)點，還能縮短育種年限。因此，這一技術(shù)正被廣泛應(yīng)用于水稻育種中[41-45]。本研究選擇圓粒型粳稻品種東富139、龍粳31和中長粒型粳稻品種東農(nóng)427為受體材料，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對GS3、GS9基因進(jìn)行編輯，在3個品種中都得到了GS3單基因純合突變、GS9單基因純合突變和GS3、GS9雙基因純合突變的突變體材料。

本研究構(gòu)建了pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體，用分別轉(zhuǎn)入這2個載體的農(nóng)桿菌侵染3個品種的水稻愈傷組織，成苗后篩選陽性植株，其中，轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA載體的48株陽性植株中，有45株為突變植株，突變率高達(dá)93.75%；轉(zhuǎn)入pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA載體的100株陽性植株中，有85株為突變植株，突變率為85%，并且這85株突變植株中，有80株在GS3位點都發(fā)生突變。在之前的研究中，Chen等[46]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建GS3、GL3.1雙敲除載體對水稻品種日本晴進(jìn)行基因編輯，得到的所有陽性突變植株均在GS3靶點發(fā)生純合突變。Shen等[47]研究結(jié)果表明，GS3靶點的誘變效率極高，本試驗結(jié)果也證實了這一結(jié)論。總體上看，試驗中所有陽性植株中GS3靶點的突變率為84%，該頻率高于前人的研究結(jié)果；而對GS9基因進(jìn)行編輯的受體材料中，GS9靶點的突變率為28%，顯著低于前人的研究結(jié)果。有研究表明，靶序列的CG含量可能影響突變效率[38]。因此，推測不同靶序列中CG含量的差異，可能是造成基因突變率有顯著差異的因素之一。

GS3是水稻粒型的主效QTL。沈蘭等[48]研究結(jié)果表明，在4個粳稻品種中，gs3突變體的粒長較野生型增加了8%～18%，千粒質(zhì)量較野生型增加2%～21%，結(jié)實率較野生型略微下降，但未達(dá)到顯著水平，而粒寬和穗粒數(shù)較野生型沒有顯著差異。本試驗中，3個粳稻品種的gs3突變體較野生型的粒長增幅(8%～17%)、千粒質(zhì)量增幅(8%～15%)均與前人試驗結(jié)果相近，結(jié)實率、粒寬和穗粒數(shù)的分析結(jié)果，也與前人試驗結(jié)果基本一致。以上結(jié)果表明，GS3單基因突變可顯著增加水稻粒長和千粒質(zhì)量，并且在粒寬、結(jié)實率和穗粒數(shù)等性狀較野生型沒有顯著差異，通過對GS3進(jìn)行基因編輯，理論上可以增加水稻粒長，并通過增加千粒質(zhì)量提高增產(chǎn)潛力。

GS9負(fù)調(diào)控水稻粒長，但對水稻粒寬有正調(diào)控作用[20]。張晨[49]研究結(jié)果表明，NIL(gs9)近等基因系的粒長較野生型增加9%，粒寬減少8%，千粒質(zhì)量、株高、穗長、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀較野生型沒有顯著差異。本試驗中，3個品種的gs9突變體粒長、粒寬的變化幅度，與前人NIL(gs9)近等基因系的粒長、粒寬較野生型的變化幅度大致相近。前人試驗結(jié)果表明，構(gòu)建近等基因系也是精確改良水稻性狀的有效方法。而本試驗利用CRISPR/Cas9技術(shù)得到3個品種的gs9突變株系，相比前人構(gòu)建近等基因系的方法，更加省時省力，并且對3個品種的突變株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀分析的結(jié)果，理論上來說更具說服力。綜合本試驗與前人試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)GS9作為一個控制粒長粒寬的主效QTL，可以在不影響其他農(nóng)藝性狀的基礎(chǔ)上通過增加粒長并減少粒寬改良水稻粒型。

粒型是一個相對復(fù)雜的性狀，受多個QTL影響，而GS3、GS9都是控制粒型的主效QTL，理論上結(jié)合這2個主效QTL，可以在水稻粒型的改良中，達(dá)到更理想的效果。徐善斌等[50]研究結(jié)果表明，通過對GS3和GS9進(jìn)行基因編輯，粒長比野生型增加26.43%～27.01%，增幅大于GS3、GS9單基因突變體，粒寬降低13.4%～24.6%，千粒質(zhì)量增加18.34%～41.36%，并且增產(chǎn)10.82%～12.11%。本試驗中，3個品種的gs3gs9突變體的粒長、粒寬和千粒質(zhì)量較野生型的變化幅度均低于前人研究結(jié)果，但粒長和千粒質(zhì)量增幅明顯大于GS3和GS9單基因突變體，與前人結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，相較于單獨敲除GS3或GS9基因，同時對GS3和GS9這2個主效QTL進(jìn)行基因編輯，可以在改良水稻粒型中取得更好的效果，并且在一定程度上提高水稻的增產(chǎn)潛力。

綜上所述，本試驗以3個粳稻品種東富139、龍粳31和東農(nóng)427為受體材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對GS3、GS9基因進(jìn)行定向敲除，3個品種均獲得了gs3、gs9和gs3gs9且無T-DNA元件的純合突變體，創(chuàng)制了多個粒型改良的粳稻新種質(zhì)，加快了長粒型粳稻新品種的選育進(jìn)程。