張奧深，雍曉宇，韓巧霞，姚永偉，師煥婷，李鴿子，康國(guó)章

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

小麥作為我國(guó)三大糧食作物之一，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展直接影響到國(guó)家糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定。近年來(lái)，隨著全球氣候變暖，極端低溫災(zāi)害頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響了小麥的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)[1]，其中倒春寒是黃淮麥區(qū)最嚴(yán)重的災(zāi)害，在我國(guó)冬麥主產(chǎn)區(qū)黃淮麥區(qū)，小麥凍害發(fā)生的頻率越來(lái)越高，對(duì)小麥造成的危害也越來(lái)越嚴(yán)重[2]。小麥拔節(jié)期到抽穗前是小麥生長(zhǎng)速度最快，生長(zhǎng)量最大的時(shí)期，葉面積及莖穗的長(zhǎng)度和體積成倍或幾十倍增長(zhǎng)，干物質(zhì)積累也進(jìn)入迅速增長(zhǎng)階段，此時(shí)小麥生長(zhǎng)旺盛，抗寒能力弱[3]，低溫對(duì)小麥造成的不利影響較為嚴(yán)重[4]。

油菜素內(nèi)酯(Brassinolide，BR)又稱蕓薹素內(nèi)酯[5]，是廣泛存在于植物體內(nèi)、參與各種生理活動(dòng)的一種天然化合物，被稱為第六種植物激素[6]。BR是公認(rèn)的高效、廣譜、無(wú)毒的一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。2，4-表油菜素內(nèi)酯(2，4-Epibrassinolide，EBR)是一種人工合成的高活性油菜素內(nèi)酯類似物，外施EBR能夠提高作物的抗逆能力[7]。尚宏芹等[8]研究表明，葉面噴施EBR可通過(guò)提高小麥幼苗的抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量、降低MDA和H2O2含量，減輕重金屬汞對(duì)幼苗的傷害，促進(jìn)小麥幼苗的生長(zhǎng)。孫玉珺等[9]研究表明，外源BR處理可提高幼苗生物量、抗氧化酶活性以及Pro、可溶性糖和可溶性蛋白含量，降低MDA含量，緩解低溫脅迫對(duì)玉米生長(zhǎng)的抑制程度。劉麗杰等[10]研究發(fā)現(xiàn)，利用0.1 mg/L的EBR處理小麥幼苗，可提高小麥的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，可溶性糖和Pro含量顯著提高，降低MDA含量，從而提高小麥的抗凍性。前人從生理層面對(duì)EBR提高作物的耐受性進(jìn)行研究，證實(shí)EBR對(duì)多種逆境脅迫具有緩解作用，但從基因?qū)用鎸?duì)EBR的作用機(jī)制研究較少。

本試驗(yàn)以半冬性品種百農(nóng)207為材料，在小麥拔節(jié)期外源澆施EBR，并利用人工氣候室模擬低溫凍害，研究?jī)龊γ{迫條件下小麥植株生理指標(biāo)、抗逆相關(guān)基因表達(dá)量、幼穗受凍率、籽粒產(chǎn)量、千粒質(zhì)量以及地上部干物質(zhì)質(zhì)量的變化，探究外源EBR緩解小麥低溫凍害的生理機(jī)制，以期為減輕倒春寒對(duì)小麥的危害提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

供試材料為普通半冬性小麥品種百農(nóng)207。試驗(yàn)采用盆栽，2020年秋季種植在河南省鄭州市毛莊河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園試驗(yàn)田中，盆的直徑為30 cm，高為30 cm，三葉期每盆定苗16株。盆栽用土為0～30 cm的耕層土壤，每盆裝過(guò)篩壤土8 kg，并均勻施入尿素2.3 g、磷肥0.8 g和鉀肥3.4 g，之后埋于試驗(yàn)田中，盆的頂部邊緣與地面齊平。

在前期試驗(yàn)篩選EBR濃度的基礎(chǔ)上，待小麥生長(zhǎng)至拔節(jié)期時(shí)澆施濃度為0.1 mg/L的EBR 400 mL，對(duì)照(CK)施用同等體積的水。小麥植株充分吸收24 h后，將盆栽移入人工氣候室內(nèi)-5 ℃低溫連續(xù)處理48 h，在處理0，24，48 h分別剪取主莖最上部全展葉，用于生理指標(biāo)的測(cè)定及基因表達(dá)分析，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2 生理指標(biāo)測(cè)定

在凍害脅迫處理前后利用SPAD-502葉綠素儀測(cè)定小麥最上部全展葉的SPAD值，每盆測(cè)5片葉片取平均值。利用硫代巴比妥酸(TCA-TBA)顯色法測(cè)定葉片MDA含量，采用酸性茚三酮法測(cè)定Pro含量，利用電導(dǎo)率儀測(cè)定葉片相對(duì)電導(dǎo)率[11]。

1.3 基因表達(dá)分析

取小麥葉片0.1 g，利用總RNA提取試劑盒(Vazyme，南京)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme，南京)合成cDNA第一鏈。在前期研究中，小麥高產(chǎn)抗逆分子調(diào)控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)篩選出與凍害脅迫相關(guān)的5個(gè)抗逆基因：SOD[12]、POD[13]、CAT[14]、P5CS[15]和WCS120[16]。本研究以小麥Actin作為內(nèi)參基因，對(duì)5個(gè)抗逆相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。采用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)，由河南尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息Tab.1 qRT-PCR primer information

1.4 小麥幼穗受凍率調(diào)查和籽粒產(chǎn)量、千粒質(zhì)量、干物質(zhì)質(zhì)量測(cè)定

在拔節(jié)期對(duì)盆栽小麥外源施用EBR 24 h后，進(jìn)行凍害脅迫處理(48 h)，自然條件下恢復(fù)生長(zhǎng)，15 d后調(diào)查幼穗受凍后死亡情況，取其平均值計(jì)算幼穗受凍率；于成熟期按盆收獲籽粒計(jì)算籽粒產(chǎn)量；按處理隨機(jī)選取1 000個(gè)籽粒確定千粒質(zhì)量；將收獲后小麥植株地上部放入烘箱，105 ℃殺青30 min后80 ℃烘干，計(jì)算干物質(zhì)質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥拔節(jié)期外施EBR凍害脅迫后植株葉片SPAD值的變化

如圖1所示，凍害脅迫前，外施EBR處理組與對(duì)照的SPAD值無(wú)顯著差異，在凍害脅迫后，葉片的SPAD值隨凍害脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，在同一脅迫時(shí)間處理組的SPAD值始終顯著高于對(duì)照，這表明小麥拔節(jié)期外施EBR可以緩解凍害脅迫下葉片衰老，延長(zhǎng)葉片的功能期。

柱上不同小寫(xiě)字母均表示在5%水平差異顯著。圖2—5同。The different lowercase letters on the columns indicate significant differences at the 5% level.The same as Fig.2—5.

2.2 小麥拔節(jié)期外施EBR凍害脅迫后植株葉片MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率的變化

凍害脅迫處理前外施EBR的小麥植株和對(duì)照植株葉片MDA含量差異不顯著；凍害脅迫24 h對(duì)照組MDA含量顯著升高，而外施EBR處理組小麥植株葉片MDA含量與凍害脅迫前無(wú)顯著變化；而凍害脅迫處理時(shí)間達(dá)到48 h，二者的MDA含量均較處理24 h顯著下降，且處理組MDA含量顯著低于對(duì)照組。結(jié)果表明，拔節(jié)期外施EBR可以降低小麥植株葉片MDA含量，從而減輕其膜脂過(guò)氧化程度(圖2)。

圖2 小麥拔節(jié)期外施EBR凍害脅迫后葉片的MDA含量Fig.2 MDA content in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

在凍害脅迫處理前外施EBR植株葉片的相對(duì)電導(dǎo)率與對(duì)照無(wú)顯著差異，在低溫脅迫24，48 h，外施EBR的植株相對(duì)電導(dǎo)率均顯著低于對(duì)照(P<0.05)，分別降低了8.19，7.03百分點(diǎn)(圖3)。

圖3 小麥拔節(jié)期外施EBR凍害脅迫后葉片的相對(duì)電導(dǎo)率Fig.3 Relative conductivities in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

2.3 小麥拔節(jié)期外施EBR凍害脅迫后植株葉片Pro含量的變化

由圖4可知，對(duì)照組在凍害脅迫下，Pro含量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)；而外施EBR的處理組在脅迫條件下，葉片的Pro含量逐漸上升；在凍害脅迫48 h，處理組小麥葉片的Pro含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖4 小麥拔節(jié)期外施EBR凍害脅迫后葉片Pro含量Fig.4 Proline contents in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

2.4 小麥拔節(jié)期外施EBR凍害脅迫后植株葉片抗逆相關(guān)基因表達(dá)量變化

在凍害脅迫處理前，除P5CS其余4個(gè)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)量處理組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；處理組小麥植株在凍害脅迫24 h，葉片中的SOD、POD和CAT的表達(dá)量較脅迫處理前均顯著降低，而P5CS和WCS120的表達(dá)量均顯著上升；對(duì)照組在凍害脅迫處理24 h，SOD、CAT的表達(dá)量較凍害脅迫處理前無(wú)顯著變化，P5CS和WCS120的表達(dá)量均顯著上升。凍害脅迫處理48 h與24 h相比，處理組的SOD、POD、CAT和WCS120的相對(duì)表達(dá)量均顯著提高；而對(duì)照組的SOD、P5CS和WCS120表達(dá)量無(wú)顯著變化。在凍害脅迫處理48 h，處理組的5個(gè)抗逆相關(guān)基因表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(P<0.05)(圖5)。

圖5 小麥拔節(jié)期外施EBR凍害脅迫后葉片抗逆相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression leaves of stress resistance related genes in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

2.5 小麥拔節(jié)期外施EBR凍害脅迫后植株幼穗受凍率、籽粒產(chǎn)量、千粒質(zhì)量和干物質(zhì)質(zhì)量的變化

外施EBR的處理組小麥植株幼穗受凍率比對(duì)照組降低了20.93百分點(diǎn)；處理組的植株籽粒產(chǎn)量和干物質(zhì)質(zhì)量每盆分別較對(duì)照增加了19.38，54.40 g，處理組千粒質(zhì)量較對(duì)照增加了2.37 g，均顯著高于對(duì)照。說(shuō)明在拔節(jié)期外施EBR能夠提高小麥幼穗的抗凍性和干物質(zhì)積累量，從而提高小麥產(chǎn)量(表2)。

表2 小麥拔節(jié)期外施EBR凍害脅迫后幼穗受凍率、籽粒產(chǎn)量、千粒質(zhì)量和干物質(zhì)質(zhì)量Tab.2 The damage rates of young ears，grain yields，1 000 grains weights and dry matter qualities in wheat under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

3 結(jié)論與討論

油菜素內(nèi)酯是一種多羥基甾類化合物，是調(diào)節(jié)植物逆境脅迫傷害的重要生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，參與不同植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和抵抗外界脅迫等生物學(xué)功能[17-18]。外源EBR對(duì)植物逆境脅迫緩解方面的生理作用日益受到關(guān)注[19-21]。華智銳等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，經(jīng)BR處理的小麥幼苗抗氧化酶活性提高，MDA含量降低，相對(duì)含水量提高，從而提高了小麥幼苗的抗旱性。李淑葉[23]在低溫處理前對(duì)棉花葉面分別噴施不同濃度的EBR和蒸餾水，結(jié)果表明，外源噴施適宜濃度的EBR較噴施蒸餾水可顯著提高葉片Pro含量、凈光合速率、植株的干鮮質(zhì)量，降低MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率。唐秀巧等[24]在小麥灌漿期高溫前通過(guò)葉面噴施磷酸二氫鉀(PDP)和BR均能顯著延緩灌漿期葉片衰老，促進(jìn)干物質(zhì)積累。植物在逆境脅迫下會(huì)產(chǎn)生活性氧，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，阻礙葉綠素合成，降低SPAD值，從而破壞光系統(tǒng)，減少植物干物質(zhì)積累量[25]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在連續(xù)凍害脅迫48 h，外施EBR的處理組小麥MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率顯著降低，而Pro含量顯著提高，SPAD值、籽粒產(chǎn)量、千粒質(zhì)量和地上部干物質(zhì)質(zhì)量均顯著高于對(duì)照，與前人研究結(jié)果一致。

在植物逆境研究中，前人的研究表明，抗氧化酶SOD、POD、CAT 等活性的高低與植物的抗逆能力密切相關(guān)[26]，但植物體內(nèi)其他的水解酶的存在，極易影響抗氧化酶的提取與活性的測(cè)定，而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)則受其他水解酶的影響較小。在前期研究中，本課題組篩選出與凍害脅迫相關(guān)的5個(gè)抗逆基因SOD、POD、CAT、P5CS和WCS120。其中，SOD基因控制超氧化物歧化酶的合成，超氧化物歧化酶作為清除植物體內(nèi)活性氧(ROS)的清除劑，是首個(gè)響應(yīng)逆境脅迫并參與反應(yīng)的酶[12]；POD基因控制過(guò)氧化物酶的合成，過(guò)氧化物酶能分解植物體內(nèi)的H2O2，降低其對(duì)細(xì)胞的危害[13]；CAT基因控制過(guò)氧化氫酶的合成，過(guò)氧化氫酶是一種強(qiáng)抗氧化酶，催化H2O2分解成水和氧，在植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[14]；WCS120基因是一種受低溫特異性誘導(dǎo)的基因，其編碼的蛋白質(zhì)被認(rèn)為在小麥的冷馴化過(guò)程中起著重要的作用，WCS120蛋白的積累量與高抗凍冬小麥組織的耐寒性呈正相關(guān)[16]。吡咯琳-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)是脯氨酸合成中谷氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶[15]，Pro含量和植物的逆境耐受力呈正相關(guān)[27]，植物體內(nèi)的Pro含量與P5CS基因的相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)[28-29]。因此，SOD、POD、CAT、P5CS和WCS120這5個(gè)抗逆相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量可作為小麥抗凍性的參考依據(jù)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在凍害脅迫處理48 h，對(duì)照組SOD基因的相對(duì)表達(dá)量較凍害脅迫處理前無(wú)顯著變化，POD、P5CS和WCS120均顯著升高，而外施EBR的處理組小麥植株，除SOD外POD、CAT、P5CS和WCS120的表達(dá)量較凍害脅迫處理前均顯著提高，在凍害脅迫48 h 5個(gè)抗逆基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照。

在凍害脅迫條件下，抗逆基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果與生理指標(biāo)鑒定結(jié)果一致，表明在凍害脅迫下，外施EBR可提高小麥植株的抗氧化酶活性，增加其清除活性氧的能力，降低膜脂過(guò)氧化程度；同時(shí)P5CS基因的高表達(dá)表明，外施EBR可提高植株體內(nèi)游離脯氨酸含量，增加小麥的抗寒性。SPAD值的顯著提高表明，外施EBR可緩解凍害脅迫下小麥葉片衰老，延長(zhǎng)其功能期，提高小麥植株物質(zhì)積累量；幼穗受凍率的檢測(cè)結(jié)果同樣表明，在小麥拔節(jié)期外施EBR可降低其幼穗受凍率，提高籽粒產(chǎn)量和千粒質(zhì)量。因此，EBR拔節(jié)期外施可起到緩解凍害的效應(yīng)，從而提高小麥的抗凍性。基于此，在春季低溫凍害來(lái)臨之際，可以通過(guò)施用EBR減輕低溫凍害對(duì)冬小麥生產(chǎn)造成的產(chǎn)量損失。