劉 健，王佳麗，曹慧丹，孫 潔

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

支氣管哮喘(以下簡(jiǎn)稱哮喘)作為常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病，近年來(lái)其患病率在全球有逐年增加的趨勢(shì)[1]。在我國(guó)，近年來(lái)哮喘的控制現(xiàn)狀雖有進(jìn)步，但仍不夠理想[2]。美國(guó)胸科協(xié)會(huì)在2017年指出，哮喘氣道重塑是引發(fā)肺功能急速下降、不可逆性氣道阻塞以及氣道高反應(yīng)性的主要原因，預(yù)防或延緩氣道重塑的發(fā)生發(fā)展，對(duì)于保護(hù)哮喘患者的肺功能、提高生活質(zhì)量有著重要的意義[3]。而目前針對(duì)氣道重塑的治療卻陷入瓶頸[4-5]。

前期研究證實(shí)，中藥復(fù)方補(bǔ)肺顆粒能夠有效改善哮喘緩解期患者的氣道阻塞并改善小氣道通氣功能，提高哮喘患者的控制水平，減少哮喘癥狀急性發(fā)作[6-7]，而且能夠有效緩解氣道炎癥[8]。但其對(duì)哮喘氣道重塑的作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在研究補(bǔ)肺顆粒對(duì)哮喘氣道血管生成及氣道重塑的影響，從而探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔巴比塞(BALB/C)雌性小鼠80只(SPF 級(jí)、6～8周齡、體重18～22 g)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：中藥復(fù)方補(bǔ)肺顆粒由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑室提供，主要成分為黨參、熟地、山萸肉、赤芍、當(dāng)歸、炙麻黃、陳皮、紫菀、黃芩、桑白皮、甘草，將其制成1 g/ml的水溶液備用。

OVA·Al(OH)3混合液：以10 mg卵清蛋白(OVA)干粉溶于5 ml 0.9%氯化鈉溶液中，搖勻。取其中1 ml加入4 ml 0.9%氯化鈉溶液，再加入等體積(5 ml)氫氧化鋁搖勻。每次使用前需新鮮配制。

1.2.1 哮喘小鼠模型建立：參照文獻(xiàn)[9]，以O(shè)VA·Al(OH)3混合液腹腔注射致敏及霧化吸入OVA激發(fā)的方法制作哮喘小鼠模型，具體制作模型方法如下。小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為四組：正常對(duì)照組、哮喘模型組、補(bǔ)肺顆粒組、地塞米松組，每組各20只，以苦味酸于不同部位標(biāo)記。哮喘模型組：小鼠于0、14 d腹腔注射0.1 ml OVA·Al(OH)3混合液，自21 d起予以0.1% OVA溶液霧化吸入，隔日1次，每次30 min，共霧化18次。每次霧化前予以0.9%氯化鈉溶液0.1 ml/10 g灌胃。補(bǔ)肺顆粒組：0、14 d腹腔注射及OVA霧化吸入同哮喘模型組，每次霧化前半小時(shí)予以補(bǔ)肺顆粒2.84 g/(kg·d)灌胃。地塞米松組：0、14 d腹腔注射及OVA霧化吸入同哮喘模型組，每次霧化前半小時(shí)0.5 mg/kg地塞米松灌胃。正常對(duì)照組：小鼠于0、14 d腹腔注射0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液，自21 d起予以0.9%氯化鈉溶液霧化吸入，隔日1次，每次30 min，共霧化18次。每次霧化前予以0.9%氯化鈉溶液0.1 ml/10 g灌胃。每組小鼠均在末次激發(fā)24 h內(nèi)處死取材。

1.2.2 取材與處理：結(jié)扎小鼠右側(cè)支氣管，用1 ml注射器抽取0.6 ml預(yù)冷無(wú)菌PBS注入左肺腔，輕輕按摩左肺，將5 ml注射器接入灌胃針以保證足夠的負(fù)壓抽吸肺泡灌洗液(BALF)。每次灌洗后反復(fù)緩慢抽吸灌洗液3次，確保每次回收≥80%。收集最后1次灌洗液至細(xì)胞固定液內(nèi)，以ELISA檢查轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、內(nèi)皮抑素(ES)等的濃度。

取小鼠右肺上中葉組織，以4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水、石蠟包埋后行HE染色、Masson染色、AB-PAS染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)等病理改變。取右肺下葉組織，以RT-PCR法檢測(cè)TGF-β1、TNF-α、VEGF、ES等的mRNA表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 基本狀態(tài)：觀測(cè)小鼠的體重、體溫、呼吸、心率及精神狀態(tài)。

1.3.2 TGF-β1、TNF-α、VEGF、ES指標(biāo)：將左側(cè)肺泡灌洗液離心后取上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作，檢測(cè)標(biāo)本TGF-β1、TNF-α、VEGF、ES等指標(biāo)的濃度。

1.3.3 肺組織切片：光鏡下觀察氣道以及肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、氣道肺泡損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。將肺組織連續(xù)切片，厚度約4 μm，隨后進(jìn)行HE染色、Masson染色及AB-PAS染色。在200倍光鏡下每只小鼠切片隨機(jī)選取5個(gè)完整的細(xì)支氣管橫斷面(無(wú)軟骨且平滑肌完整，無(wú)分叉及斷裂)，氣管最小徑/最大徑≥0.5，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定氣管基底膜周徑(Pbm)、氣管壁面積(Wat氣管內(nèi)徑線和外膜間面積)，并在有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師指導(dǎo)下測(cè)量Masson染色陽(yáng)性信號(hào)面積(wcol)。計(jì)算每只氣管Wat/Pbm值，取其平均值代表該只動(dòng)物支氣管壁厚度；計(jì)算每只氣管wcol/Pbm值，取其平均值代表該只動(dòng)物wcol/Pbm。

股份合作制改革是農(nóng)村集體產(chǎn)權(quán)制度改革的關(guān)鍵所在。據(jù)悉，今年農(nóng)村集體產(chǎn)權(quán)制度改革正展開(kāi)第三批試點(diǎn)。此輪試點(diǎn)將原來(lái)的“探索確認(rèn)集體成員身份”調(diào)整為“全面確認(rèn)集體成員身份”。

1.3.4 RT-PCR：使用 Trizol試劑提取肺組織及支氣管中的總RNA后，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，56～58 ℃退火加延伸1 min，45個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析各樣本的Ct值，得出VEGF、ES、TGF-β1、TNF-α等mRNA的表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較行單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況比較 正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)敏捷，未見(jiàn)異常表現(xiàn)。哮喘模型組、補(bǔ)肺顆粒組及地塞米松組在霧化激發(fā)后出現(xiàn)煩躁不安、搔抓身體等表現(xiàn)，部分小鼠出現(xiàn)呼吸急促、站立不穩(wěn)、腹肌抽搐、二便失禁等表現(xiàn)。上述表現(xiàn)隨著激發(fā)次數(shù)的增加而逐步加重。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，補(bǔ)肺顆粒組及地塞米松組的一般狀態(tài)逐漸優(yōu)于哮喘模型組，癥狀相對(duì)較輕且有不同程度的改善。

2.2 各組小鼠氣道病理改變 見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組小鼠支氣管黏膜上皮、肌層以及肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管腔規(guī)則，支氣管黏膜上皮整齊，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯膠原沉積，不見(jiàn)或僅見(jiàn)少量點(diǎn)狀A(yù)B-PAS染色陽(yáng)性信號(hào)區(qū)域。

圖1 各組小鼠氣道在不同染色下的病理改變(×200)

哮喘模型組小鼠支氣管管腔狹窄，氣道壁明顯增厚，氣道平滑肌層明顯增厚，支氣管周圍及黏膜下有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液栓堵塞；Masson染色下氣道上皮下膠原沉積明顯增加，可見(jiàn)較厚的致密層；AB-PAS染色下氣道上皮內(nèi)可見(jiàn)較多陽(yáng)性信號(hào)區(qū)域。

補(bǔ)肺顆粒組及地塞米松組氣管壁及管周炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜增厚都較模型組減輕；膠原沉積較正常對(duì)照組明顯增加，但較哮喘模型組減少；氣道上皮內(nèi)的AB-PAS染色陽(yáng)性信號(hào)區(qū)域較哮喘模型組有所減少。

2.3 各組小鼠支氣管管壁厚度比較 與哮喘模型組相比，補(bǔ)肺顆粒組及地塞米松組的Wat/Pbm值均有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩者組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組小鼠膠原纖維厚度比較 與哮喘模型組相比，地塞米松組wcol/Pbm值有下降趨勢(shì)。補(bǔ)肺顆粒組wcol/Pbm值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 各組小鼠BALF中VEGF、TNF-α、TGF-β1、ES濃度比較 見(jiàn)表2。與哮喘模型組相比，補(bǔ)肺顆粒組VEGF、TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)，地塞米松組TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，兩者組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠BALF中VEGF、TNF-α、TGF-β1、ES濃度比較

2.6 各組小鼠肺組織中VEGF、ES、TGF-β1、TNF-α mRNA水平比較 見(jiàn)表3。與哮喘模型組比較，補(bǔ)肺顆粒組VEGF、ES mRNA水平均明顯下降(P<0.05)，地塞米松組VEGF、ES mRNA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩者組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠肺組織中VEGF、ES、TGF-β1、TNF-α mRNA水平比較

3 討 論

哮喘氣道重塑的主要病理特征包括：上皮下基底膜膠原沉積、上皮損傷、血管新生、黏液腺增生、氣道平滑肌增生肥大等[10]。受損上皮細(xì)胞釋放的生長(zhǎng)因子(如TGF-β1、TNF-α等)參與成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，而這些往往被認(rèn)為是氣道重塑發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞[11-12]。研究表明，TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖[13]，與TNF-α共同促進(jìn)成纖維細(xì)胞向成纖維性和高分泌性肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[14]。因此，干預(yù)TGF-β1/TNF-α作用的成纖維信號(hào)通路對(duì)抑制哮喘氣道重塑有積極意義[15-16]。在本研究中，同哮喘模型組對(duì)比，補(bǔ)肺顆粒組小鼠肺組織中TNF-α、TGF-β1的mRNA水平有下降趨勢(shì)，BALF中的TNF-α、TGF-β1水平均有降低，其中TNF-α差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示補(bǔ)肺顆粒能有效抑制氣道壁纖維增生。

氣道血管生成是哮喘氣道炎癥和組織重塑發(fā)展和延續(xù)中的重要事件，血管數(shù)量和大小的增加可導(dǎo)致氣道壁增厚，進(jìn)而導(dǎo)致支氣管管腔變窄、氣道平滑肌收縮，從而引起氣道高反應(yīng)。血管生成過(guò)程中有兩組具有相反功能的調(diào)節(jié)分子參與，VEGF是最主要的正性調(diào)節(jié)因子[17]，而主要負(fù)性內(nèi)源性因子為ES[18]。因此，調(diào)節(jié)VEGF及ES水平對(duì)于調(diào)節(jié)氣道血管生成有重要意義。在本研究中，同哮喘模型組對(duì)比，補(bǔ)肺顆粒組小鼠肺組織中VEGF、ES的mRNA水平均有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小鼠BALF中VEGF、ES的水平均有降低，其中VEGF差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示補(bǔ)肺顆粒能通過(guò)降低VEGF及ES水平，抑制哮喘氣道血管增生重塑的病理過(guò)程，從而抑制哮喘氣道重塑。

中醫(yī)理論認(rèn)為，哮喘反復(fù)發(fā)作，極易損傷氣津，痰液更加黏稠難出，滯塞肺絡(luò)，瘀積不散，出現(xiàn)頑痰膠固，致使肺管狹窄，使無(wú)形之氣不能宣降，痰瘀互結(jié)，氣道狹窄，更致津血運(yùn)行受礙[19]。這種痰瘀氣阻的病理特征使病情遷延，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì)沉積，氣道平滑肌增生，血管通透性增加，黏膜水腫，炎性分泌物增多，結(jié)果導(dǎo)致氣道狹窄、影響通氣功能的認(rèn)知有相通之處[20]。因此哮喘痰瘀互結(jié)的病機(jī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中哮喘氣道重塑及血管重塑之間存在必然的相關(guān)性。針對(duì)這一病理變化研制的補(bǔ)肺顆粒，旨在起到化痰平喘、通絡(luò)祛瘀之用，能夠改善哮喘緩解期患者的氣道阻塞，提高哮喘患者的控制水平，減少哮喘癥狀急性發(fā)作。

本研究表明，補(bǔ)肺顆粒對(duì)于改善氣道管壁及管周炎細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制黏膜增厚及膠原沉積較都有很好的作用。同時(shí)能夠有效調(diào)節(jié)TNF-α、TGF-β1、VEGF、ES等因子的水平。因此，補(bǔ)肺顆粒能有效抑制哮喘小鼠氣道重塑，其作用機(jī)制可能與干預(yù)TGF-β1/TNF-α作用的成纖維信號(hào)通路以及調(diào)節(jié)氣道血管生成有關(guān)。