潘 婷 吳力強(qiáng) 錢(qián)純亙 聶立波

1.湖南工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院 湖南 株洲 412007

2.深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司 平臺(tái)預(yù)研部 廣東 深圳 518100

1 研究背景

呼吸道病毒是指一大類(lèi)以呼吸道為侵入門(mén)戶(hù)，引起呼吸道或呼吸道以外器官病變的病毒。急性呼吸道感染（acute respiratory infection，ARI）是世界范圍內(nèi)，引發(fā)急性病和致死性疾病的主要病因之一[1]。全球每年大約有400萬(wàn)人因感染呼吸道病毒而死亡[2]。5歲以下兒童中，全球每年僅流感和呼吸道合胞病毒感染，導(dǎo)致的總死亡人數(shù)達(dá)30萬(wàn)人以上[3]。

2019年末至2020年初，一種新型冠狀病毒2019-nCoV（即SARS-CoV-2）的人際傳播，導(dǎo)致了疫情爆發(fā)。世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，截至2021年9月，全球累計(jì)確診病例超過(guò)2.3億，累計(jì)死亡人數(shù)達(dá)470多萬(wàn)。

急性呼吸道感染中，90%以上由病毒引起[4]。常見(jiàn)的引發(fā)急性呼吸道感染的病原體有：冠狀病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒和鼻病毒等[5]。大多數(shù)呼吸道病毒具有感染力強(qiáng)、傳播快、潛伏期短、發(fā)病急等特點(diǎn)[6]。呼吸道病毒種類(lèi)繁多，且感染后癥狀較為相似，因此診斷區(qū)分十分困難[7-9]?？焖贉?zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)阻斷疾病傳播起著至關(guān)重要作用[10-15]。

呼吸道病毒臨床檢測(cè)方法主要包括快速抗原檢測(cè)和核酸擴(kuò)增檢測(cè)[16]。目前，新型冠狀病毒肺炎的檢測(cè)通常要用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分析儀，在專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，同時(shí)需要專(zhuān)業(yè)人員操作，這限制了醫(yī)療條件簡(jiǎn)陋的偏遠(yuǎn)地區(qū)及護(hù)理點(diǎn)檢測(cè)的可行性[17-21]。微流控技術(shù)的快速發(fā)展，為開(kāi)發(fā)成本低、用戶(hù)友好的呼吸道病毒監(jiān)測(cè)平臺(tái)提供了新的策略。微流控芯片在微小尺度上實(shí)現(xiàn)流體的操控，構(gòu)建出芯片實(shí)驗(yàn)室模型，從而將多種化學(xué)和生物學(xué)的過(guò)程集成到微全分析系統(tǒng)中[22-24]。微流控芯片能實(shí)現(xiàn)操作過(guò)程的自動(dòng)化、檢測(cè)目標(biāo)的高通量和試劑的低消耗，還能與其他技術(shù)設(shè)備集成和兼容[25]。微流控芯片因具有試劑用量少、反應(yīng)過(guò)程短、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、物理、醫(yī)學(xué)等自然科學(xué)領(lǐng)域[26-30]。

金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）因其獨(dú)特的物理和光學(xué)性質(zhì)，已廣泛用于病毒以及其他病原體和疾病的檢測(cè)[31]。金納米粒子具有可視化顯色特性，在基于微流控技術(shù)的診斷設(shè)備開(kāi)發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用前景[32]。側(cè)向流動(dòng)法是最常用的基于AuNPs的體外診斷護(hù)理點(diǎn)檢測(cè)方式，其操作簡(jiǎn)便且無(wú)需昂貴設(shè)備[33]。

Xia Y. Q. 等[34]開(kāi)發(fā)了一種用于禽流感病毒檢測(cè)的微流控傳感器，該傳感器以人字形聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）芯片為載體，在氧化鋅納米棒三維結(jié)構(gòu)上包覆HA特異性抗體。捕獲的病毒進(jìn)一步用抗體包被的Au-Ag核殼納米粒子標(biāo)記。肉眼目測(cè)的檢出限為2.7×104EID50/mL，比常規(guī)基于熒光的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 （enzyme-liked immuno sorbent assay，ELISA）法低一個(gè)數(shù)量級(jí)。用智能手機(jī)成像系統(tǒng)進(jìn)行比色檢測(cè)，其檢出限可低至8×103EID50/mL，病毒捕獲和檢測(cè)過(guò)程可在1.5 h內(nèi)完成。

基于上述背景，本研究開(kāi)發(fā)了一種壓力驅(qū)動(dòng)的微流控芯片，以實(shí)現(xiàn)快速、直觀地檢測(cè)甲型流感病毒（influenza A virus，F(xiàn)luA）、乙型流感病毒（influenza B virus，F(xiàn)luB）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1）實(shí)驗(yàn)材料

H1N1流感抗原（病毒培養(yǎng)物總蛋白質(zhì)量濃度1.88 mg/mL）、B流感抗原（病毒培養(yǎng)物總蛋白質(zhì)量濃度3.56 mg/mL）、FluA抗體、FluB抗體、RSV抗體、GAM-IgG、SARS-CoV-2抗體，廣東菲鵬生物股份有限公司；SARS-CoV-2抗原，深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司；RSV 抗體，Hytest公司；氯化金(III)水合物、trizma?base,美國(guó)Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白，新西蘭Proliant公司；氯化鈉、檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、碳酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸纖維素膜，德國(guó)Merck公司；聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）板材，成都世化亞克力科技有限公司；醫(yī)療雙面膠，美國(guó)3M公司。

2）儀器設(shè)備

激光雕刻機(jī)，VLS3.50型，美國(guó)Universal Laser Systems公司；真空熱壓機(jī)，TBS-200型，浙江揚(yáng)清芯片技術(shù)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，DHG-9140(A)型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀，Synergy LX型，美國(guó)BioTek公司；微量注射泵，Pump 11 Elite型，美國(guó)Harvard Apparatus公司；場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡，JEM-F200型，日本電子株式會(huì)社；激光共聚焦顯微鏡，DCM8型，德國(guó)Leica公司；渦旋混合儀，VX-200型，美國(guó)Labnet公司；數(shù)控定時(shí)超聲波清洗機(jī)，040S型，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)，5804R型，德國(guó)Eppendorf公司；磁力攪拌器，PC-620D型，美國(guó)Corning公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 檢測(cè)原理

基于微流控技術(shù)的可視化呼吸道病毒免疫檢測(cè)原理如圖1所示。

圖1 基于微流控技術(shù)的可視化呼吸道病毒免疫檢測(cè)原理圖Fig. 1 Schematic diagram of visual immunoassay of respiratory virus based on microfluidic technology

待檢測(cè)抗原經(jīng)加樣口注入芯片，首先與包被溶解區(qū)的膠體金標(biāo)記抗體反應(yīng)，在混合區(qū)進(jìn)一步充分混合形成抗原抗體復(fù)合物后，流經(jīng)檢測(cè)區(qū)，捕獲抗體與抗原進(jìn)行特異性識(shí)別，形成抗體-抗原-抗體夾心結(jié)構(gòu)，并在檢測(cè)區(qū)聚集。膠體金為顏色型標(biāo)記材料，聚集后產(chǎn)生明顯的顯色反應(yīng)，通過(guò)微流控芯片檢測(cè)區(qū)檢測(cè)線(xiàn)顏色的有無(wú)，進(jìn)行樣本中檢測(cè)目標(biāo)物的判定。

2.2.2 膠體金的制備

膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法。具體制備過(guò)程如下：將250 mL去離子水放入潔凈的玻璃器皿中，并置于可加熱磁力攪拌器上加熱至沸騰，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的檸檬酸三鈉溶液2.25 mL；當(dāng)溶液再次沸騰后，迅速加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸溶液2.5 mL，溶液顏色變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)加熱煮沸5 min；冷卻至室溫后用去離子水補(bǔ)足至原體積；將制備好的膠體金溶液室溫避光保存。

2.2.3 膠體金標(biāo)記抗體最佳pH條件優(yōu)化

向盛有1 mL膠體金的各試管中分別加入0, 3,6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 μL濃度為0.2 mol/L的K2CO3溶液，混勻，得到一系列不同pH梯度的膠體金溶液。待pH值穩(wěn)定后，向每管中分別加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL的相應(yīng)抗體10 μL，并顛倒混勻。4 ℃下靜置過(guò)夜觀察膠體金狀態(tài)，并進(jìn)行紫外可見(jiàn)光譜（UV-Vis）檢測(cè)，不穩(wěn)定的膠體金呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象。將使膠體金穩(wěn)定的0.2 mol/L K2CO3溶液最低用量作為對(duì)應(yīng)的膠體金標(biāo)記抗體最佳條件，測(cè)出該條件下溶液的pH值，即為最佳標(biāo)記pH值。

2.2.4 標(biāo)記最佳抗體用量?jī)?yōu)化

在膠體金與抗體偶聯(lián)過(guò)程中，適當(dāng)?shù)目贵w用量是保證檢測(cè)靈敏度及控制抗體用量成本的關(guān)鍵。因此對(duì)膠體金標(biāo)記抗體的最佳用量進(jìn)行優(yōu)化。

取10 mL制備好的粒徑均一的膠體金，滴加0.2 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至最佳標(biāo)記pH值。然后將此膠體金溶液分裝入1.5 mL的離心管中，每管1 mL，各管中分別加入FluA、FluB、RSV抗體的量均依次為0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 μg，SARS-CoV-2抗體加入量依次為0, 3, 6, 9, 12, 15, 18,21 μg，振蕩混勻后，室溫孵育l0 min。最后，每管取出200 μL并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaCl溶液20 μL，混合均勻后室溫孵育2 h，觀察離心管中膠體金溶液的顏色變化情況，并進(jìn)行UV-Vis檢測(cè)，從而確定最佳抗體用量。

2.2.5 膠體金標(biāo)記抗體表征

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得出的膠體金標(biāo)記抗體最佳條件，分別對(duì)本研究中呼吸道病毒檢測(cè)項(xiàng)目的抗體進(jìn)行標(biāo)記。為了評(píng)估標(biāo)記效果，用紫外可見(jiàn)光譜和透射電子顯微鏡，對(duì)經(jīng)標(biāo)記及純化后的膠體金標(biāo)記抗體進(jìn)行檢測(cè)和表征。

2.2.6 芯片的設(shè)計(jì)與制作

采用AutoCAD軟件進(jìn)行芯片設(shè)計(jì)。單通道微流控芯片由底板、廢液腔層、通道層和蓋片組成，如圖2所示。通道層由進(jìn)樣口、包被溶解區(qū)、混合區(qū)、檢測(cè)區(qū)構(gòu)成。蓋片為一矩形光板，其上開(kāi)有兩個(gè)孔，分別為注液孔和排氣孔。底板、廢液腔層、通道層和蓋片鍵合形成了密閉微通道，構(gòu)成芯片的功能區(qū)域。

圖2 微流控芯片的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)Fig. 2 Design structure of the microfluidic chip

選用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）為基材，根據(jù)設(shè)計(jì)圖（見(jiàn)圖2b），用激光雕刻機(jī)加工。其中通道層、廢液腔層、底板厚度均為0.3 mm，蓋片厚度為0.1 mm。芯片組裝工序如下：先將通道層上下底面貼雙面膠，廢液腔層下底面貼雙面膠，接著將芯片的底板與廢液腔層貼合，用真空熱壓機(jī)進(jìn)行熱壓鍵合，并對(duì)其上表面進(jìn)行親水處理。在處理好的芯片上表面粘貼通道層，將玻纖切割后嵌入包被溶解區(qū)，以其作為載體，滴加膠體金標(biāo)記抗體。在檢測(cè)區(qū)嵌入經(jīng)激光切割好的硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC膜），膜上包被有兩條捕獲抗體線(xiàn)，質(zhì)控線(xiàn)為GAMIgG（C線(xiàn)），檢測(cè)線(xiàn)為對(duì)應(yīng)呼吸道病毒的包被抗體（T線(xiàn)）。膠體金標(biāo)記抗體進(jìn)行干化處理后，再將蓋片貼至上層，真空熱壓鍵合，制得完整的測(cè)試芯片。

2.2.7 呼吸道病毒檢測(cè)

采用自制微流控芯片，分別對(duì)甲型流感H1N1滅活病毒、乙型流感滅活病毒、呼吸道合胞病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原、新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行檢測(cè)。將配置好的80 μL抗原檢測(cè)樣本用注射泵通過(guò)加樣口注入芯片，流速為8 μL/min，反應(yīng)10 min，直至結(jié)果穩(wěn)定，進(jìn)行結(jié)果讀取。

2.2.8 信號(hào)采集與處理

信號(hào)可通過(guò)肉眼可視化檢測(cè)。但是，為了科學(xué)評(píng)估微流控免疫芯片的檢測(cè)性能，本研究先利用智能手機(jī)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行拍照，再用Image J軟件提取圖像光密度值，最后用Origin 2019b軟件處理數(shù)據(jù)，得到擬合曲線(xiàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 膠體金的表征

用多功能酶標(biāo)儀對(duì)所制備的膠體金進(jìn)行UV-Vis檢測(cè)，并用透射電子顯微鏡對(duì)其形貌及分散性進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3 所示。由圖3可知，膠體金的最大吸收峰位于520 nm處，其粒徑大小為（19.73±1.20）nm，且分散均一性良好。

圖3 膠體金的表征Fig. 3 Characterization of AuNPs

3.2 膠體金標(biāo)記抗體最佳pH條件

采用檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金表面帶有大量負(fù)電荷，膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附主要取決于pH值。當(dāng)膠體金懸濁液PH值接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)或稍偏堿性時(shí)，二者容易形成牢固的結(jié)合物。本研究對(duì)膠體金標(biāo)記抗體的最適pH值進(jìn)行了條件優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 膠體金標(biāo)記不同抗體的pH條件優(yōu)化Fig. 4 Optimization of pH values of different antibodies labeled with AuNPs

由圖4可知，隨著K2CO3溶液加入量的增加，即pH的升高，膠體金顏色由紫變紅并趨于穩(wěn)定。將使1 mL膠體金穩(wěn)定的最低K2CO3溶液加入量作為最佳標(biāo)記條件，結(jié)果是FluA、FluB、RSV和SARSCoV-2抗體標(biāo)記的最佳K2CO3溶液加入量分別為9,12, 12, 6 μL，對(duì)應(yīng)的pH值分別為7.7, 8.1, 8.2, 7.2。

3.3 標(biāo)記抗體最佳用量

蛋白質(zhì)用量影響膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性。為達(dá)到理想標(biāo)記效果，本研究對(duì)膠體金標(biāo)記抗體的最適用量進(jìn)行了條件優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，隨著抗體用量的增加，膠體金由藍(lán)變紅并趨于穩(wěn)定。選取能使膠體金穩(wěn)定的最低抗體用量為標(biāo)記最佳抗體用量，結(jié)果是每1 mL膠體金中FluA、FluB、RSV和SARS-CoV-2抗體的最佳用量分別為4,4, 4, 15 μg。實(shí)際應(yīng)用中為達(dá)到更好的結(jié)合效率，在此基礎(chǔ)上增加5%～10%的抗體用量。

圖5 不同病毒標(biāo)記抗體的用量?jī)?yōu)化Fig. 5 Optimization of antibody amounts of different viruses

彩圖

3.4 膠體金標(biāo)記抗體結(jié)果表征

根據(jù)最佳標(biāo)記pH及標(biāo)記抗體最佳用量，進(jìn)行了抗體小樣標(biāo)記，并對(duì)標(biāo)記后的膠體金與抗體偶合物進(jìn)行了UV-Vis檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 膠體金標(biāo)記抗體的UV-Vis光譜圖Fig. 6 UV-Vis spectra of AuNPs -labeled antibodies

由圖6可知，膠體金的最大吸收峰波長(zhǎng)為520 nm，膠體金標(biāo)記抗體的最大吸收峰波長(zhǎng)為524 nm，表明抗體與膠體金成功偶聯(lián)。

對(duì)標(biāo)記后的偶合物進(jìn)行透射電鏡表征，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，標(biāo)記后粒徑為（21.31±1.50）nm，比裸膠體金的粒徑略有增加，粒徑均一，且分散性好。

圖7 膠體金標(biāo)記抗體的表征Fig. 7 Characterization of AuNPs-labeled antibody

3.5 檢測(cè)靈敏度

采用本研究制作的芯片分別對(duì)FluA、FluB、RSV、SARS-CoV-2 4種呼吸道病毒進(jìn)行抗原濃度梯度檢測(cè)，每個(gè)濃度進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)試，采用Image J軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行光密度值提取，并計(jì)算出平均光密度值，結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同病毒抗原濃度的檢測(cè)結(jié)果Fig. 8 Detection results of different antigen concentrations of viruses

彩圖

由圖8可知，肉眼可見(jiàn)膠體金的顏色隨著抗原質(zhì)量濃度的降低而變淺， 陰性則無(wú)反應(yīng)現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組的平均光密度明顯高于陰性對(duì)照組的，說(shuō)明芯片可實(shí)現(xiàn)對(duì)4種病毒的檢出。當(dāng)FluA抗原質(zhì)量濃度為37.6 ng/mL時(shí)，可檢出信號(hào)，而當(dāng)質(zhì)量濃度為18.8 ng/mL時(shí)，無(wú)檢測(cè)信號(hào)，即檢出限為37.6 ng/mL。同樣可得，芯片對(duì)FluB檢出限為17.8 μg/mL，對(duì)RSV標(biāo)準(zhǔn)抗原和SARS-CoV-2標(biāo)準(zhǔn)抗原檢出限分別112.5 ng/mL和0.05 ng/mL。此外，本檢測(cè)從進(jìn)樣到顯色，直至顯色結(jié)果穩(wěn)定，總檢出時(shí)間為10 min。

3.6 檢測(cè)特異性

為了驗(yàn)證微流控芯片的檢測(cè)特異性，配制不同濃度抗原，每個(gè)濃度進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)試，結(jié)果如圖9所示。FluA滅活病毒、FluB滅活病毒、RSV標(biāo)準(zhǔn)抗原、SARS-CoV-2標(biāo)準(zhǔn)抗原的質(zhì)量濃度分別為9.4 μg/mL, 178.0 μg/mL, 900.0 ng/mL, 2.5 ng/mL。

圖9 不同病毒的檢測(cè)特異性Fig. 9 Detection specificity of different respiratory viruses

彩圖

由圖9可知，病毒特異性檢測(cè)以其他3種病毒作為干擾物，每種病毒的檢測(cè)線(xiàn)只有相應(yīng)病毒出現(xiàn)信號(hào)，其他3種干擾病毒無(wú)信號(hào)，說(shuō)明不同檢測(cè)項(xiàng)目之間無(wú)相互干擾，特異性良好。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究以微流控芯片為載體，實(shí)現(xiàn)了呼吸道病毒可視化免疫檢測(cè)。通過(guò)芯片設(shè)計(jì)將進(jìn)樣區(qū)、包被溶解區(qū)、混合區(qū)、檢測(cè)區(qū)集成在微流控芯片上。芯片結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)中引入蛇形混合區(qū)，通過(guò)對(duì)流體流速的控制使目標(biāo)物與包被抗體能更加充分地反應(yīng)，提高檢測(cè)的靈敏度。以注射泵作為流體驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)精準(zhǔn)的流體控制實(shí)現(xiàn)了甲型流感H1N1、乙型流感滅活病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原的可視化檢出，總檢出時(shí)間為10 min，單次所消耗樣本量為80 μL。所研制的免疫微流控芯片具有特異性高、樣品量少、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、無(wú)交叉反應(yīng)等特點(diǎn)。

相較于傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測(cè)試紙，本研究中微流控芯片的制備步驟相對(duì)較多，但這僅限于實(shí)驗(yàn)室制備，工業(yè)生產(chǎn)時(shí)可采用注塑成型法替代，以便于快速大批量制備，降低成本。對(duì)于傳染性病原體的檢測(cè)，集成式的芯片提供相對(duì)封閉的檢測(cè)環(huán)境，可有效防止疾病的擴(kuò)散。在后續(xù)研究中，可通過(guò)微流控芯片結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)目的聯(lián)合檢測(cè)，提高篩查效率；還可開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)易的自動(dòng)化集成設(shè)備，用于醫(yī)療資源相對(duì)缺乏地區(qū)疾病篩查及床旁快速檢測(cè)。