趙 娜,劉艷成,劉艷龍,謝家鑫，吳玘瑤，智 宇

（1.興安盟農(nóng)牧局綜合保障中心,內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400；2.興安盟動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

相關(guān)研究表明，引起豬病毒性腹瀉的病原主要有豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒 （Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和 豬 輪 狀 病 毒 （Porcine rotavirus，RV）[1]。 自 2013 年以來，伴隨豬偽狂犬病病毒新毒株的流行，豬偽狂犬病的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，特別是在南方省區(qū)流行更為嚴(yán)重[2]。豬只感染上述4種病毒后均會出現(xiàn)不同程度的腹瀉，僅從流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化上很難進(jìn)行區(qū)分[3]。因此，構(gòu)建一種可同時檢測多種目標(biāo)病毒的診斷方法成為防治該類疾病的重要前提。

本試驗根據(jù)4種病毒的基因結(jié)構(gòu)，分別設(shè)計并合成特異性引物，在單項PCR的基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，建立起用于同時檢測上述4種疫病的多重PCR方法，意在為臨床進(jìn)行豬腹瀉病流行病學(xué)調(diào)查和快速診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒來源

豬偽狂犬病毒、豬輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒均購自中國普通病毒保藏中心；豬呼吸與繁殖障礙綜合征弱毒疫苗、豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、豬瘟活疫苗和豬細(xì)小病滅活疫苗，均購自疫苗生產(chǎn)廠家。

1.2 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank收錄的PRV的gB基因序列(AF257079.1)、RV的VP6基因序列（JN605419.1）、TGEV的N基因序列(GQ374559.1)和PEDV的M基因序列（JX435317.1）設(shè)計特異性引物[4]（表1）。 引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列及擴(kuò)增長度

1.3 核酸的提取與反轉(zhuǎn)錄

采用病毒核酸（DNA/RNA）提取試劑盒提取病毒DNA和RNA。在冰浴的離心管中加入Random 6 mers(50 μM)1.0 μL，dNTP Mixture(10 μM)1.0 μL，模板RNA 8.0 μL。65℃保溫5 min后迅速冰上冷卻。簡短離心后，加入 4 μL的 5×PrimeScript II Buffer，0.5 μL 的 Rnase Inhibitor(40 U/μL)，1.0 μL 的PrimeScript II RTase，輕輕混勻，簡短離心收集反應(yīng)液。30℃溫浴10 min，42℃溫浴60 min，70℃加熱15 min，將所得產(chǎn)物直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增或-20℃保存。

1.4 優(yōu)化單項PCR的反應(yīng)條件

以上述4種病毒的cDNA為模板，利用4對引物進(jìn)行單項 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系（25 μL）為：Premix Taq TM 12.5 μL，cDNA 模板 2.5 μL， 上下游引物各 1.0μL，ddH2O補(bǔ)平至25 μL。 擴(kuò)增程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，51～57 ℃設(shè)置梯度退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，吸取產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢查。

1.4.1 確定單項PCR最佳退火溫度。依據(jù)4對引物的Tm值，將退火溫度設(shè)定為51.0℃，51.4℃，52.1 ℃，53.1℃，54.6℃，55.8℃，56.5℃和57.0℃8個梯度。

1.4.2 確定引物最佳濃度和靈敏度。上下游引物各取1.5 μL，1.0 μL，0.5 μL，0.25 μL， 分別采用 104、103、102、101、100稀釋度的 cDNA 模板進(jìn)行滴定，測定 4種病毒的最佳濃度。

1.4.3 特異性鑒定。根據(jù)4種病毒的最佳退火溫度和引物用量，進(jìn)行PEDV，TGEV，RV和PRV 4種引物的特異性檢查。

1.5 優(yōu)化多重PCR的反應(yīng)條件

1.5.1 優(yōu)化多重PCR退火溫度。參考單項PCR的退火溫度， 設(shè)定51.0℃，51.4℃，52.1℃，53.1 ℃，54.6 ℃，55.8℃，56.5℃和57.0℃ 8個溫度梯度。

1.5.2 優(yōu)化多重PCR引物濃度。根據(jù)確定的最佳引物濃度，篩選出多重PCR反應(yīng)的引物添加量。

1.5.3 多重PCR特異性試驗。分別對PRV，RV，PEDV和TGEV混合模板，PPV，PRV，PCV的DNA模板，以及PRRSV，HCV的cDNA模板進(jìn)行多重PCR特異性檢驗。

1.5.4 多重PCR敏感性試驗。倍比稀釋（101～106）4種病毒的核酸模板，測定出最低模板濃度。

1.6 構(gòu)建多重PCR反應(yīng)體系

根據(jù)所確定的各對引物的最佳濃度、最佳退火溫度構(gòu)建多重PCR反應(yīng)體系。

1.7 多重PCR與單項PCR的對比

利用建立的多重PCR法和單項PCR法檢測60份臨床腹瀉樣品，對兩種檢測方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 確定單項PCR的最佳退火溫度

如圖1所示，PEDV，TGEV，RV和PRV的退火溫度范圍均較廣，各個溫度梯度條帶都較為明顯，且沒有非特異性條帶。

圖1 PEDV，TGEV，RV，PRV單項PCR退火溫度

2.2 單項PCR的引物濃度及敏感性

由圖2可知，PEDV的最佳引物添加量為0.25～1.0 μL（引物終濃度為 0.1～0.4 μM），最低可檢測 103稀釋倍數(shù)的cDNA （32.40 ng/uL）；TGEV的最佳引物添加量為 1.0 μL（引物終濃度為 0.4 μM），最低可檢測 104稀釋倍數(shù)的 cDNA（23.31 ng/μL）；RV 的最佳引物添加量為 1.0 μL （終濃度為 0.4 μM），最低可檢測 103稀釋倍數(shù)的 cDNA （29.50 ng/μL）；PRV的最佳引物添加量為0.25～0.5 μL（終濃度為0.1～0.2 μM）， 最低可檢測 104稀釋倍數(shù)的 cDNA（19.87 ng/μL）。

圖2 PEDV，TGEV，RV，PRV引物濃度及敏感性的確定

2.3 單項PCR的特異性鑒定結(jié)果

PEDV，TGEV，RV和 PRV的 cDNA模板均擴(kuò)增出與目的片段大小符合的條帶,而其他幾種病毒均無條帶。

圖3 單項PCR的特異性

2.4 多重PCR的退火溫度

試驗結(jié)果表明，多重PCR反應(yīng)的退火溫度在51.0～57.0℃的范圍內(nèi)均可擴(kuò)增出特異性條帶，而溫度在53.1～57.0℃時擴(kuò)增效果最好（圖4）。

圖4 PEDV，TGEV，RV，PRV多重PCR退火溫度

2.5 多重PCR的引物濃度

確定引物最佳添加量為：PEDV 0.5 μL（引物最佳濃度為 0.2 μM），TGEV 0.5 μL （引物最佳濃度為0.2 uM），RV 1.0 μL（引物最佳濃度為 0.4 μM），PRV 1.5 μL（引物最佳濃度為 0.6 uM）。

圖5 多重PCR的引物濃度優(yōu)化

2.6 多重PCR的特異性

采用建立的多重PCR方法對4種病毒的混合模板進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得大小分別為610 bp，238 bp，1 356 bp，497 bp的4條清晰的目的條帶，但PRRSV，HCV，PPV和PCV均未能擴(kuò)增出任何條帶（圖6），證明多重PCR仍具有良好的特異性。

圖6 多重PCR的特異性

2.7 多重PCR的敏感性

敏感性試驗結(jié)果表明，最大稀釋倍數(shù)為104，酶標(biāo)儀檢測4種病毒的混合cDNA模板及104倍稀釋模板的濃度分別為 5.25 μg/μL 和 35.50 ng/μL（見圖7）。

圖7 多重PCR的敏感性

2.8 多重PCR的反應(yīng)體系

表2 多重PCR的反應(yīng)體系

擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，57 ℃/53.1 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 60 s，38個循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃保存。

2.9 多重PCR與單項PCR的臨床應(yīng)用

多重PCR與單項PCR兩種檢測方法的整體符合率為95%，其中PEDV，TGEV，RV，PRV的符合率分別為96.3%、100%、93.00%和100%，表明建立的多重PCR方法能夠用于臨床鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

表3 多重PCR與單項PCR的檢測結(jié)果比較

3 討論

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測技術(shù)在疫病臨床診斷上的廣泛應(yīng)用，多重PCR方法實現(xiàn)了對多種疾病的快速診斷，其顯著降低了檢測成本和反應(yīng)時間，為動物疫病的快速控制贏得了寶貴時間。本試驗針對引起豬群腹瀉的4種主要病毒的保守基因序列，設(shè)計了4對特異性引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為610 bp，238 bp，1 356 bp和497 bp，各目的片段之間的長度差異顯著。電泳檢測結(jié)果表明，4對引物均可擴(kuò)增出各自的特異片段，且無非特異性擴(kuò)增。臨床應(yīng)用結(jié)果顯示，多重PCR檢測方法與常規(guī)PCR方法的符合率達(dá)95.0%，保持了高度一致。特異性試驗及靈敏性試驗結(jié)果均表明，多重PCR檢測方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點，可應(yīng)用于臨床鑒別診斷。