王娟，石大川，陳皓寧,3，吳麗青，閆彩霞，陳靜，趙小波，孫全喜，苑翠玲，牟藝菲，單世華*，李春娟

（1.山東省花生研究所，山東 青島， 266100；2.山東省青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 青島， 266100；3.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島， 266000；4.山東省菏澤市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 青島， 274000）

氮素在植物體內(nèi)參與了蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的合成，對(duì)其產(chǎn)量和品質(zhì)的影響較大[1]。同時(shí)，提高氮素利用效率（NUE，nitrogen use efficiency）也是發(fā)展綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的熱點(diǎn)問題。近年來，為了穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)，過量施用氮肥導(dǎo)致花生（Arachis hypogaeaL.）自身固氮能力下降，還造成一系列的環(huán)境污染問題，如土壤酸化、板結(jié)、水體污染、溫室氣體排放等[2]。因此，從生理與分子角度揭示相關(guān)基因功能及其分子作用機(jī)制，通過遺傳改良提高花生氮素利用效率，在增加花生產(chǎn)量的同時(shí)減少施肥對(duì)環(huán)境造成的壓力，對(duì)綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的實(shí)現(xiàn)具有重要的理論及生產(chǎn)意義。

土壤中，植物所利用的氮素形式分為銨態(tài)氮（NH4+）和硝態(tài)氮（NO3-）。多種旱地作物（煙草、小麥、大豆、油菜、木薯、白菜等）氮吸收的相關(guān)研究表明，硝態(tài)氮（NO3-）是旱地作物吸收利用的主要氮源。植物從土壤中吸收硝態(tài)氮的能量主要來源于質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)梯度：NO3-濃度高于1 mmol/L時(shí)，其吸收主要依靠低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（the low-affinity transport system，LATS）完成；NO3-濃度低于1 mmol/L 時(shí)，其吸收主要依靠高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（the high-affinity transport system，HATS）完成，分別由硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NRT）的NPF（NRT1/PTR）和NRT2兩大轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族負(fù)責(zé)執(zhí)行。NPF 家族除了轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸、多肽、硫配糖體、生長(zhǎng)素以及脫落酸等[3]，而NRT2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是位于原生質(zhì)膜上的膜蛋白，具有典型的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)[4,5]。所有的NRT2 均為高親和性的轉(zhuǎn)運(yùn)體，且只把硝酸鹽作為特異性底物[6]。

目前，就植物高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NRT2）基因家族鑒定方面，在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)NRT2 基因家族成員[7～9]。作物中，水稻（Oryza sativa）挖掘到5 個(gè)NRT2 成員[10]；大麥（Hordeum vulgare）通過基因克隆到4 個(gè)NRT2成員[11]；谷子（Setaria italica）中發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)NRT2 成員；高粱（Sorghum bicolor）中檢測(cè)到4個(gè)NRT2 成員；玉米（Zea mays）中找到了3 個(gè)NRT2 成員。豆科植物中，蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)NRT2 成員[12,13]；大豆（Glycine max）中發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)NRT2 成員。但是，花生NRT2家族基因相關(guān)研究尚未見報(bào)道[14]。

栽培種花生除了根瘤菌固氮，通過根系吸收土壤中的硝酸氮也是氮素利用的重要方式。栽培種花生全基因組以及轉(zhuǎn)錄組等數(shù)據(jù)的釋放為重要性狀基因的鑒定和發(fā)掘提供有利條件[15～18]。本研究前期通過全基因組水平的關(guān)聯(lián)分析（nenome wide association study，GWAS）與QTL 定位（QTL mapping）的聯(lián)合分析對(duì)花生產(chǎn)量性狀相關(guān)基因進(jìn)行錨定。在參考水稻、大豆等作物產(chǎn)量性狀基因驗(yàn)證結(jié)果的基礎(chǔ)上，從數(shù)目龐大的候選基因中篩選出花生高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?yàn)楫a(chǎn)量性狀相關(guān)候選基因[19]。在此，以高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NRT2）基因家族為研究對(duì)象，通過生物信息學(xué)揭示NRT2 基因家族特征及表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究花生NRT2 基因家族成員的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以栽培種花生（Arachis hypogaeaL.）為研究對(duì)象，NRT2基因序列信息來源于花生基因組數(shù)據(jù)庫Peanutbase（https://peanutbase. org/）及NCBI 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 方法

1.2.1 NRT2 蛋白基因家族的查詢和確認(rèn) 在花生基因組數(shù)據(jù)庫以“Nitrate transporter 2”為關(guān)鍵詞，搜索得到花生NRT2 基因家族在A.duranensis、A.ipaensis及栽培種花生（A. hypogaeaL.）的所有候選成員序列，將其在花生基因數(shù)據(jù)庫Peanutbase（https://www. peanutbase. org/）和NCBI 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi. nlm. nih. gov/）中進(jìn)行Blastp 檢索（e 值≤10-15）。然后在NCBI（https://www.ncbi. nlm. nih. gov/）以擬南芥NRT2 基因家族7 個(gè)成員序列對(duì)比以上花生NRT2基因進(jìn)行序列同源性對(duì)比[7，8]，去除冗余成員后，作為基因家族候選成員。

通過Pfam 在線軟件（http://pfam.janelia.org/）的sequence search 功能[20]與SMART 在線軟件的normal model P 模塊（http://smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行NRT2基因家族蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)[21]。該家族屬于MFS（major facilitator superfamily）超家族成員之一，由此對(duì)獲得的蛋白序列進(jìn)一步確認(rèn)，篩除不具有典型結(jié)構(gòu)域（PLN00028 super family）的基因，得到了花生NRT2的基因家族成員。

1.2.2 基因特性分析及染色體定位分析 通過Peanutbase 數(shù)據(jù)庫里花生基因組的gff3 文件中提取NRT2 基因家族的染色體起始、結(jié)束位置以及基因長(zhǎng)度；利用NCBI 在線Blast 工具搜索獲得擬南芥NRT2 蛋白的同源信息。利用ExPASy-ProtParam（http://web. expasy. org/protparam/）線 上 分 析 花 生NRT2基因家族成員的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。利用MapInspect 在線軟件（http://www. plantbreeding. wur. nl/UK/soft-ware_mapinspect. htm）進(jìn)行染色體物理分布圖的繪制，獲得NRT2 基因家族成員的染色體物理位置信息。

1.2.3 基因進(jìn)化分析 利用花生NRT2 基因家族成員與大豆、苜蓿、水稻及擬南芥等物種NRT2 基因家族成員的蛋白序列，在MEGA v7.0 上對(duì)NRT2基因家族進(jìn)行序列比對(duì)，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用Bootstraping 法對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行評(píng)估與分組得到花生與各物種間親緣關(guān)系。校驗(yàn)參數(shù):no of different，重復(fù)5000次。

1.2.4 基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析 Peanutbase 數(shù)據(jù)庫可獲得花生NRT2基因的核苷酸全長(zhǎng)及CDS 區(qū)域在基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。通過可視化工具Gene Structure Display Server 2.0（http://gsds. cbi. pku. edu.cn/），利用Sequence（FASTA）格式繪制基因結(jié)構(gòu)圖。利用在線軟件MEME Suite 5.1.0（http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）根據(jù)基因家族成員的氨基酸序列預(yù)測(cè)花生NRT2 基因家族保守基序，參數(shù)設(shè)定為classic mode，motif數(shù)目為10。

1.2.5 不同組織的基因表達(dá)量分析 在花生全生育期22 個(gè)不同發(fā)育時(shí)間不同組織中基因表達(dá)情況轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上[22]，提取的花生NRT2基因的FPKM（fragments per kilobase of exon model pre million mapped reads）數(shù)值通過Excel進(jìn)行l(wèi)og2的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，利用熱圖制作軟件HemI 進(jìn)行Hierarchical clustering（HCL）聚類繪制熱圖來展示花生NRT2基因表達(dá)量情況。根據(jù)花生NRT2基因在不同組織不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)量，預(yù)測(cè)不同NRT2基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生NRT2基因家族成員的鑒定和染色體分布

通過對(duì)NRT2基因典型結(jié)構(gòu)域篩選，人工去除不完整序列或較短序列的基因，最終確定了10個(gè)花生NRT2基因。與二倍體野生種花生相比，A. dura?nensis中發(fā)現(xiàn)有5 個(gè)NRT2基因，A. ipaensis含有12個(gè)NRT2基因。為了更加直觀地了解NRT2基因家族在染色體上的位置信息，我們繪制了栽培種花生及二倍野生花生的染色體分布圖（圖1），顯示該基因家族成員分布不均勻。A. ipaensis基因組上分布有12 個(gè)NRT2基因，其家族成員分布密度最高。四倍體栽培種花生A 基因組與A. duranensis基因組相比，有三對(duì)基因（Chr01:AhNRT2.6c/AdNRT2.4d;Chr03:AhNRT2.5c/AdNRT2.4a; Chr06:AhNRT2.7b/AdNRT2.2a）存在同源關(guān)系；四倍體栽培種花生B 基因組與A. ipaensis有五對(duì)基因（Chr11:AhNRT2.6a/Chr01:AiNRT2.2b; Chr12:AhNRT2.6b/ Chr02:Ai?NRT2.6b; Chr13:AhNRT2.5b/ Chr03:AiNRT2.4d;Chr16:AhNRT2.7a/ Chr06:AiNRT2.2a; Chr20:AhNRT2.5a/ Chr10:AiNRT2.4f）存在同源關(guān)系。栽培種花生全基因組上，3 號(hào)（AhNRT2.5c）和13 號(hào)（AhNRT2.5b）染色體，6 號(hào)（AhNRT2.7b）和16 號(hào)（AhNRT2.7a）染色體上的基因存在同源關(guān)系。

圖1 栽培種花生NRT2基因在染色體上的分布Fig.1 Distribution of NRT2 genes on chromosomes in peanut

2.2 花生NRT2 基因家族蛋白序列進(jìn)化關(guān)系及理化性質(zhì)分析

利用MEGA v7.0 將栽培種花生的10 個(gè)NRT2蛋白序列與7 個(gè)擬南芥（At）NRT2 蛋白序列，3 個(gè)大豆（Gm）NRT2 蛋白序列，4 個(gè)水稻（Os）NRT2 蛋白序列以及3 個(gè)苜蓿（Mt）NRT2 蛋白序列等進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。以與其它物種NRT2 序列的相似性高低與基礎(chǔ)，將這些NRT2 分為5 支，分別命名Clade 1,2,3,4,5（圖2）。除Clade 4 外，花生NRT2 蛋白序列并未因物種差異而單獨(dú)聚類。Clade 1，栽培種花生AhNRT2.4 與大豆GmNRT2.4親緣關(guān)系較近；Clade 2，栽培種花生AhNRT2.5b，AhNRT2.5c 與苜蓿MtNRT2.7c 聚為一小支；Clade 3，栽培種花生AhNRT2.7a 和AhNRT2.7b 與擬南芥AtNRT2.7 及水稻OsNRT2.4 聚為一支; 最后以AhNRT2.6c單獨(dú)為一支。

根據(jù)基因注釋與ProtParam 進(jìn)一步分析，我們發(fā)現(xiàn)這10 個(gè)NRT2 編碼蛋白中，大部分成員編碼的蛋白氨基酸長(zhǎng)度在69～553 aa之間。其中，AhNRT2.5a基因的轉(zhuǎn)錄本2 編碼最短，僅為69 個(gè)氨基酸，其分子量為7.8 kD，序列不完整；AhNRT2.5b 編碼最長(zhǎng)，氨基酸長(zhǎng)度為553，分子量為55.24 kD。具有10～12個(gè)跨膜區(qū)的家族成員有5 個(gè)，分別是AhNRT2.4，AhNRT2.5b，AhNRT2.5c，AhNRT2.7a 和AhNRT2.7 b。除AhNRT2.6c 外，各成員等電點(diǎn)在8.52～9.85之間，變化幅度較小?；ㄉ鶱RT2 蛋白基因家族的理化性質(zhì)與其他物種NRT2 蛋白家族的理化性質(zhì)基本一致。

2.3 花生NRT2基因家族保守結(jié)構(gòu)域及其基序分析

基于花生NRT2基因家族10 個(gè)氨基酸序列及CDS 序列文件，利用MEGA 7.0、GSDS 2.0 與MEME在線軟件構(gòu)建了花生NRT2 基因家族進(jìn)化樹、保守結(jié)構(gòu)域與保守基序結(jié)構(gòu)圖（圖3）。在GSDS 在線軟件上通過CDS 序列與基因序列比對(duì)可得到CDS 序列中各外顯子在基因上的定位信息。結(jié)果表明花生各個(gè)NRT2 基因家族成員之間結(jié)構(gòu)相似，大致可以分成五類。不同類型間保守基序分布順序不同，保守基序也各有不同。在線軟件MEME Suite 5. 1. 0 可以預(yù)測(cè)基因保守基序，對(duì)花生NRT2 基因家族10 個(gè)成員保守基序分析結(jié)果顯示共存在10 種保守基序?；ㄉ鶱RT2基因家族分為4個(gè)亞組，基序分析結(jié)果顯示，組內(nèi)具有相似或相同的基序類型和排序順序。Group A 和Group C 的組內(nèi)基因家族成員的各保守基序分布順利和類型完全一致，但內(nèi)含子長(zhǎng)度有所差異；Group B 的基序分布類型相似，但基序數(shù)目有差異，分布有2～5 個(gè)基序；Group D 僅包含1個(gè)成員，有3個(gè)保守基序。

圖3 栽培種花生NRT2基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析Fig.3 Genic structure and conserved motifs analysis of NRT2 genes in peanut

2.4 NRT2基因表達(dá)模式分析

表1 花生NRT2基因家族成員信息Table 1 Identification of NRT2 gene family in peanut

以栽培種花生22 個(gè)組織中基因表達(dá)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)[22]，提取NRT2基因相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行組織表達(dá)模式分析，利用HemI 軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和可視化處理。熱圖表明：在不同組織中和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)具有明顯的組織特異性（圖4）。AhNRT2.5a基因在花生22個(gè)組織中整體表達(dá)量偏高；而AhNRT2.6b和AhNRT2.2整體表達(dá)量偏低。AhNRT2.6a僅在主莖葉片和根中有少量表達(dá)，同樣，AhNRT2.6c在葉、莖、花、種子等組織某些部位不產(chǎn)生表達(dá)。其它基因表達(dá)量因組織、發(fā)育時(shí)期表達(dá)量有差異，相比之下基因表達(dá)量居中。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與氮轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的有四個(gè)基因AhNRT2.4、AhNRT2.5a、AhNRT2.5b和AhNRT2.5c，在組織根中表達(dá)量相對(duì)較高，表明它們?cè)诟牡罩邪l(fā)揮重要作用。

圖4 花生NRT2基因組織特異性表達(dá)分析Fig.4 Tissue-specific expression of NRT2 in peanut

3 討論與結(jié)論

氮素利用效率影響著花生的產(chǎn)量。同時(shí)，提高氮素利用效率也有助于推動(dòng)綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有NPF（NRT1/PTR）和NRT2 兩大轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，分別在低親和以及高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)硝酸鹽的吸收。錢瑜等[14]通過對(duì)8 種經(jīng)過全基因組測(cè)序的物種（大白菜、大豆、楊樹、葡萄、玉米、水稻、高粱、二穗短柄草）NRT2 的同源基因分析，表明大白菜NRT2 家族經(jīng)歷了基因組三倍化及基因片段丟失事件?；ㄉ陨蟽纱蠡蚣易宓南嚓P(guān)研究，僅檢索到孔偉偉等[23]從花生基因組中找出37 個(gè)NRT1（NPF）基因，不同組織中的表達(dá)具有明顯的組織特異性，而NRT2 基因家族的研究未見報(bào)道。

本研究利用花生基因組數(shù)據(jù)庫Peanutbase 及NCBI 數(shù)據(jù)庫搜索，鑒定到10 個(gè)栽培種花生NRT2基因，分別位于9個(gè)染色體上。與野生二倍體NRT2基因家族成員的分布比對(duì)指出，3 號(hào)和13 號(hào)染色體，6號(hào)和16 號(hào)染色體上的NRT2基因分別存在同源關(guān)系。所構(gòu)建的花生NRT2 基因家族進(jìn)化樹可分為五個(gè)分支，各分支包含NRT2 家族成員，這說明該家族成員并未因物種差異而單獨(dú)聚類。各分支的內(nèi)含子數(shù)量及基因結(jié)構(gòu)相似，保守基序的排序和類型保持高度的一致性，這與水稻[10]、大豆[24]、苜蓿[13,14]等作物NRT2 基因家族的結(jié)構(gòu)和特征相似?；ㄉ鶱RT2基因在各個(gè)組織不同時(shí)期表達(dá)量存在較大差異。其 中，AhNRT2.4，AhNRT2.5a，AhNRT2.5b和AhNRT2.5c四個(gè)基因在根中有較高表達(dá)量，推測(cè)這些NRT2基因在根系的硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。值得注意的是，AhNRT2.5a還在根瘤、葉、繁殖性莖尖、果柄形態(tài)、果殼形態(tài)、種子形態(tài)各組織中某個(gè)時(shí)期表達(dá)量水平均高，這說明它在花生多個(gè)生物學(xué)過程起著重要的基礎(chǔ)作用。另外，預(yù)測(cè)到AhNRT2.4、AhNRT2.5b和AhNRT2.5c的 跨 膜 區(qū) 有10～12 個(gè)，屬于典型的跨膜蛋白，這是參與氮轉(zhuǎn)運(yùn)的前提，可作為后續(xù)功能研究的重點(diǎn)對(duì)象。

目前，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的功能研究?jī)H在擬南芥、水稻、煙草等模式植物中有較為深入的研究[25,26]。例如，F(xiàn)an 等[27]水稻pH 值依賴的高親和硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsNRT2.3過表達(dá)時(shí)，能夠提高氮固定效率，增加水稻產(chǎn)量。Tang[28]通過結(jié)合三年產(chǎn)量表型數(shù)據(jù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析，經(jīng)過表達(dá)和基因敲除等功能驗(yàn)證，克隆了雙親和硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)子OsNPF6.1，發(fā)現(xiàn)OsNPF6.1 的優(yōu)異單倍型增強(qiáng)氮素吸收和提高氮素利用效率從而提高水稻在低硝酸鹽濃度下的產(chǎn)量?；ㄉδ芑虻难芯?，相對(duì)于水稻、大豆、油菜等作物研究較為滯后。隨著栽培種花生全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)釋放和共享，花生重要性狀相關(guān)候選基因陸續(xù)被發(fā)掘和驗(yàn)證[16,17]。例如，Zhao 等利用3 個(gè)粉紅種皮與深紫色種皮花生雜交的分離群體，通過全基因組重測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)深紫色種皮性狀是由單基因AhTc1控制的，該基因?qū)儆赗2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，在煙草中過量表達(dá)該基因能夠增加轉(zhuǎn)基因煙草花青素的積累[29]。同時(shí)，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段的不斷創(chuàng)新，花生遺傳轉(zhuǎn)化體系和基因編輯技術(shù)也有了進(jìn)展?；ㄉ鶱PF/NRT2 基因家族作為氮轉(zhuǎn)運(yùn)重要基因，其功能研究還有待于在此基礎(chǔ)上深入，本研究為后續(xù)研究提供了一定的參考依據(jù)。