崔杰 李曉歐 幸兵 張明 肖雨 王文澤

垂體腺瘤是一組顯示較高分化的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的15%。而垂體促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）腺瘤是一種罕見的功能性垂體腺瘤，發(fā)病率不足0.01%oo/年，在垂體腺瘤中占比<2%，是導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀腺功能亢進癥的主要原因[1]。臨床特征主要是血清游離甲狀腺激素水平升高、血清TSH水平不被抑制并伴有不同程度甲亢和甲狀腺腫表現(xiàn)，也可因腫瘤占位效應(yīng)而出現(xiàn)視野缺損和頭痛等癥狀。多數(shù)垂體TSH腺瘤為良性，但可表現(xiàn)局部侵襲，術(shù)中見腫瘤多質(zhì)地韌，手術(shù)切除標本肉眼觀察為纖維性質(zhì)地的較韌腫物。手術(shù)是首選治療方式。近年來隨著對該病認識的提高以及激素檢測和影像技術(shù)的普及，垂體TSH腺瘤的診斷率明顯提升[2]。

垂體TSH腺瘤的分子機制尚未明確。生長抑素可以抑制多種器官中內(nèi)分泌和外分泌細胞的分泌和增殖活性，其靶標分子是跨細胞膜的特異性生長抑素受體（somatostatin receptor，SSTR）。SSTR包括5個不同亞型（SSTR1～SSTR5），在不同神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中有不同程度的表達。多項研究表明SSTR的表達與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的藥物治療反應(yīng)相關(guān)。TSH腺瘤表達SSTR，是術(shù)前準備以及術(shù)后未緩解患者進行藥物治療的分子基礎(chǔ)。目前在不同亞型的垂體腺瘤中關(guān)于SSTR表達譜的研究成為一大熱點和焦點[3-5]。但由于該病罕見，關(guān)于TSH腺瘤中各型SSTR表達的研究較少[6-7]，特別是關(guān)于各型SSTR在組織中的原位定位研究更為缺乏。

免疫組織化學(xué)是一種原位顯示組織中特定蛋白表達水平的半定量研究，具有分辨目標蛋白定位（細胞膜、細胞質(zhì)及細胞核）的優(yōu)勢。近年隨著數(shù)字病理和圖像智能化分析等技術(shù)的發(fā)展，基于數(shù)字化圖像的全切片圖像分析技術(shù)蓬勃發(fā)展，特別是在Her2等定位于細胞膜的抗體和Ki-67等定位于細胞核的抗體的免疫組織化學(xué)圖像分析方面獲得顯著進展，成為應(yīng)用在輔助診斷和科研方面的新工具[8-9]。

本研究在垂體TSH腺瘤病例組中利用免疫組織化學(xué)方法研究各型SSTR的表達情況，應(yīng)用全數(shù)字切片自動圖像分析技術(shù)與常規(guī)人工判讀進行對比研究，為后續(xù)利用全數(shù)字切片自動分析技術(shù)對病例進行輔助診斷奠定理論及實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年1月至2019年12月北京協(xié)和醫(yī)院手術(shù)治療且經(jīng)病理確診的垂體TSH腺瘤石蠟包埋組織樣本及相應(yīng)臨床病理資料。入組標準：1）臨床資料完整，符合TSH腺瘤的臨床表現(xiàn)及實驗室檢查指標；2）術(shù)前未行放療等輔助治療；3）由3位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師確認，參照2017版世界衛(wèi)生組織（WHO）內(nèi)分泌腫瘤分類標準，結(jié)合形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)及臨床病史等綜合評估符合TSH垂體腺瘤；4）有足夠的存檔組織用于免疫組織化學(xué)檢測。最終入組37例患者。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 組織標本均經(jīng)常規(guī)中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋后進行4 μm厚切片。一抗分別采用SSTR1（購自德國Antibodies-online，小鼠單抗，ABIN2476549）、SSTR2 （購自英國ABCAM公司，兔單抗，ab134152)、SSTR4（購自德國Antibodies-online公司，小鼠單抗，ABIN2476551)和SSTR5（購自英國ABCAM公司，兔單抗，ab109495)?？乖迯?fù)方法方面SSTR1、SSTR4和SSTR5均采用酶消化法，SSTR2采用高壓熱修復(fù)法?？贵w滴度SSTR1和SSTR2采 用1∶100稀 釋，SSTR4和SSTR5采用1∶200稀釋，常溫濕盒孵育2 h后選用相應(yīng)二抗孵育1 h。最后利用DAB顯色，蘇木素復(fù)染。各步驟間均嚴格采用PBS沖洗。過程中設(shè)置相應(yīng)的陰性和陽性對照。

SSTR3較為特殊，先后分別采用了4種不同抗體，分別為Antibodies-online公司的小鼠單抗（ABIN247 6550）和ABCAM公司的3種兔多克隆抗體（ab28680、ab227601和ab198851)，在6例不同垂體腺瘤及3例胰腺組織中試驗了不同抗原修復(fù)方法（酶消化、微波及高壓熱修復(fù)）、不同的抗體滴度（1∶50至1∶500）以及不同的孵育時間（1～48 h）的不同組合。

1.2.2 人工判讀評分及全數(shù)字切片自動化圖像分析 各型SSTR染色均以細胞膜顯示棕褐色標記為陽性，參照文獻標準[7]，按照著色強度和比例不同區(qū)分為陰性（無著色或<10%細胞膜著色，0分）、弱（≥10%細胞膜的弱而不完整著色，1分）、中（≥10%細胞膜的中等或局部細胞膜完整著色，2分）和強（≥10%細胞膜的強而完整著色，3分），見圖1。全部病例由3位有資質(zhì)的病理醫(yī)師共同評估形成一致意見。

全部免疫組織化學(xué)染色切片由NanoZoomer S360數(shù)字切片掃描設(shè)備（C13220-01，購自日本濱松公司）按照明場、×40、單層、自動對焦掃描成數(shù)字化切片，分別導(dǎo)入 Aperio ImageScope 12.3.2.801 3圖像分析軟件，參照軟件說明及相關(guān)文獻，自動識別待分析組織切片區(qū)域，利用膜抗體Her2 評分參數(shù)、輔以人工微調(diào)校準（按照圖1中各個評分圖定標）后進行全數(shù)字切片自動化圖像分析，評分結(jié)果自動輸出。

圖1 SSTR2免疫組織化學(xué)0～3分染色圖像

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用x2檢驗，比較各型SSTR不同評分分值占比的差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Spearman 等級相關(guān)分析，分析不同SSTR亞型之間的相關(guān)性，以及各型SSTR表達與性別、年齡、腫瘤大小、Ki-67指數(shù)以及侵襲的相關(guān)性。人工判讀與軟件圖像自動分析的一致性評價采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（intraclass correlation coefficient，ICC）評價，ICC>0.6為一致性好。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

入組37例患者，其中男性19例，女性18例；平均年齡43.3歲，中位年齡45歲。腫瘤平均最大徑1.6（0.8～4.9）cm。Ki-67指數(shù)1%為83.8%（31/37），Ki-67指數(shù)2%為5例，Ki-67指數(shù)5%為1例。全部病例中有8例（21.6%）發(fā)現(xiàn)局部侵襲。

2.2 各型SSTR表達分析

SSTR3采用了4種不同抗體、在6例不同垂體腺瘤及3例胰腺組織中嘗試了多種試驗條件組合，均未能成功顯色，所以未進行結(jié)果分析，但在文中后續(xù)部分進行討論。

除SSTR3之外，另外4型SSTR均出現(xiàn)較高程度的細胞膜定位表達（表1，圖1），兩種評價方法均顯示評分多為2分和3分，其中3分占比均超過50.0%（人工評分中3分占比最高，SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5的占比分別為59.5%、78.4%、64.9%和56.8%）。兩種評價方法中占比最低的均是0分組（部分0分病例局部有非特異性的細胞質(zhì)著色），其中全切片自動圖像分析法在各型中0分組占比均為0（圖2）。人工評價相比圖像自動分析顯示在評分兩端（0分組和3分組）占比更高。無論何種評分方法，不同亞型之間是否高表達無顯著性差異（P<0.05）。

圖2 人工判讀和自動圖像分析的SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5結(jié)果

表1 37例TSH腺瘤各型SSTR評分匯總對比

采用Spearman法分析不同SSTR亞型之間的相關(guān)性表明，無論人工判讀還是軟件圖像自動分析評分，SSTR1和SSTR2之間呈顯著相關(guān)性（人工r=0.420，P=0.010；軟件r=0.338，P=0.040），其余相互之間無明顯相關(guān)性。

2.3 各型SSTR表達與性別、年齡、腫瘤大小、Ki-67指數(shù)以及侵襲的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)分析結(jié)果表明，兩種評分方法中僅SSTR1表達與侵襲呈負相關(guān)（人工r=-0.417，P=0.010；軟件r=-0.406，P=0.013），而各型SSTR的表達與性別、年齡、腫瘤大小以及Ki-67指數(shù)均無明顯相關(guān)性。

2.4 人工判讀與自動化圖像分析的一致性評價

除SSTR3之外，各型SSTR人工判讀與圖像自動分析的一致性采用ICC法評價，假定不存在交互效應(yīng)的情況下，ICC值分別為0.891（SSTR1）、0.843（SSTR2）、0.835（SSTR4）和0.925（SSTR5），顯示均具有較好的一致性，其中SSTR5一致性最好。各型SSTR評分結(jié)果匯總及統(tǒng)計對比見表1。

3 討論

近年關(guān)于垂體腺瘤中SSTR表達譜的研究成為一大熱點，多數(shù)是基于RT-PCR和蛋白免疫印跡的方法[3，5，10-11]，采用免疫組織化學(xué)方法在垂體腺瘤組織中原位顯示各型SSTR表達情況的研究較少，TSH腺瘤較罕見，關(guān)于TSH腺瘤中SSTR表達的研究更加缺乏，僅有為數(shù)不多的小規(guī)模病例研究[6-7，12]，已發(fā)表的國內(nèi)外文獻中規(guī)模最大的研究僅納入16例病例。本研究成功納入37例病例，是數(shù)量較多的關(guān)于TSH腺瘤的研究。

本研究結(jié)果證實SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5在TSH腺瘤細胞膜上均有較高程度的表達，兩種評分方法中3分占比均超過50.0%（人工評分中3分占比最高，SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5的占比分別為59.5%、78.4%、64.9%和56.8%）。當(dāng)然，在垂體腺瘤中并非簡單的“SSTR表達越高，使用相關(guān)藥物效果越好”。其中涉及SSTR的復(fù)雜的病理生理作用機制，尚需深入詳盡的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究[3]。相關(guān)性分析表明僅SSTR1的表達與TSH腺瘤的侵襲呈負相關(guān)（人工r=-0.417，P=0.010；軟件r=-0.406，P=0.013），各型SSTR的表達與性別、年齡、腫瘤大小以及Ki-67指數(shù)均無明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果與之前關(guān)于其他類型垂體腺瘤的多數(shù)研究以及僅有的數(shù)篇關(guān)于TSH腺瘤的報道基本相符[1，5-7，12]，提示以上4型SSTR，特別是SSTR1，可能在TSH腺瘤的發(fā)生、侵襲以及藥物治療反應(yīng)中可能起重要作用。本研究中這幾個SSTR亞型均選用新近商品化的單克隆抗體，具有相對更高的特異性。

本研究結(jié)果與之前文獻報道最大的差異在于未能發(fā)現(xiàn)SSTR3的陽性表達，盡管本課題組先后使用了4種不同SSTR3抗體、在6例不同垂體腺瘤中嘗試了多種實驗條件組合，其原因可能是多方面的：1）有報道功能性垂體腺瘤中主要表達SSTR2和SSTR5，而SSTR3主要在垂體無功能腺瘤中表達[13]。因而可能在功能性腺瘤中SSTR3表達水平較低、低于免疫組織化學(xué)方法的檢測下限。功能性垂體腺瘤也各有特點[14]，可能TSH腺瘤具有相對獨特的SSTR表達譜。2）之前關(guān)于TSH腺瘤中SSTR3表達的研究中，Herguido等[10]的研究證實TSH腺瘤中SSTR3 mRNA表達低，雖然該研究中描述使用免疫組織化學(xué)的方法證實6例TSH腺瘤中均有SSTR3表達，但其使用的抗體（ab137026[Abcam]）說明書中明確表示僅適用于流式和免疫印跡法，并不適用于其所采用的的石蠟包埋組織。Korner等[15]的對比研究也證實，目前商品化的SSTR3抗體尚未具備足夠特異性。垂體腺瘤中SSTR3的表達有待于更深入嚴謹?shù)难芯?，特別是多層面（mRNA和蛋白）、多種方法（PCR、WB以及IHC）的系統(tǒng)化確證。

基于數(shù)字化全切片的圖像自動分析技術(shù)是近來依賴于最新的人工智能自動化圖像分析方法發(fā)展的新技術(shù)[8-9]。本研究將其首次應(yīng)用于垂體腺瘤研究，結(jié)果顯示，經(jīng)過微調(diào)參數(shù)后，全數(shù)字切片自動化圖像分析技術(shù)在TSH腺瘤的SSTR免疫組織化學(xué)表達評估中取得了與病理醫(yī)師相當(dāng)?shù)脑u估效果，各型SSTR的ICC值分別為0.891（SSTR1）、0.843（SSTR2）、0.835（SSTR4）和0.925（SSTR5），顯示均與人工評分具有較好的一致性。該技術(shù)的應(yīng)用可提供重復(fù)性更好的免疫組織化學(xué)評估方法，有助于減少病理醫(yī)師簡單重復(fù)的圖像評估工作[8-9]。

本研究尚有局限性：1）使用的是存檔石蠟包埋組織樣本，相對于新鮮組織具有不可逆的、伴隨組織處理過程的繼發(fā)改變。2）能夠應(yīng)用于石蠟包埋組織的穩(wěn)定技術(shù)相對較少，檢測其中mRNA的方法目前均要求短期固定標本，對于多年存檔標本的檢測效果均較差[16]，導(dǎo)致本研究中僅采用了免疫組織化學(xué)的方法。3）圖像自動分析技術(shù)仍在飛速發(fā)展，目前仍有一定局限性[8-9]，如對非特異著色（細胞膜以外的著色）識別稍差，可能是其評分中無0分的原因；另外其對強染色時相鄰不同細胞的細胞膜的區(qū)分度有待提高，這可能也是其高分（3分）組占比較低的潛在原因。上述問題的解決亟需圖像分析算法方面有針對性的加強。

綜上所述，本研究證實垂體TSH腺瘤腫瘤組織中SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5均有較高水平表達，利用基于數(shù)字化全切片的圖像自動分析技術(shù)可獲得與病理醫(yī)師人工判讀相當(dāng)?shù)脑u估效果。SSTR表達譜研究結(jié)果能否應(yīng)用于臨床涉及很多因素，包括表達的SSTR是否有缺陷、相應(yīng)的分子背景以及細胞骨架蛋白和分子通路是否受到影響等，尚需要深入全面的系統(tǒng)研究[17]，特別是詳盡的表達譜研究結(jié)合細化的組織病理分型、藥物反應(yīng)和長期療效的對比研究。