陳思皓 何淑婭 邵世龍 何姍珊 王東生 楊牧 張石川

鼻咽癌起源于鼻咽黏膜，是上皮腫瘤中較為少見(jiàn)的與Epstein-Barr（EB）病毒感染相關(guān)的惡性腫瘤，東南亞地區(qū)與中國(guó)華南地區(qū)是高發(fā)區(qū)[1]。放療聯(lián)合化療作為目前鼻咽癌的一線治療方案，能有效控制其進(jìn)展，無(wú)轉(zhuǎn)移患者5年生存率可達(dá)80%以上[2]。但初診時(shí)4%～10%、治療隨訪期間10%～15%的鼻咽癌患者發(fā)生遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移[3]，生存時(shí)間僅為9～20個(gè)月[4]。如何對(duì)這部分患者進(jìn)行早期診斷，拓寬治療窗口，從機(jī)制上厘清鼻咽癌演進(jìn)的異質(zhì)性，是目前本領(lǐng)域臨床診療探索所面臨的主要挑戰(zhàn)。

EB病毒感染是鼻咽癌發(fā)生的重要因素之一。通過(guò)與EB病毒感染的正常人群比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BALF2_CCT等病毒亞型不僅具有較高的擴(kuò)散率與致突變率進(jìn)而導(dǎo)致鼻咽癌的發(fā)生[5]，同時(shí)其慢性感染還能改變宿主免疫系統(tǒng)，尤其是T淋巴細(xì)胞亞群與功能，從而導(dǎo)致宿主免疫背景發(fā)生特異性改變[6]。另外，由于鼻咽部存在大量淋巴循環(huán)以及復(fù)雜的次級(jí)免疫結(jié)構(gòu)，鼻咽癌的發(fā)生和進(jìn)展往往伴隨大量的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。而這部分浸潤(rùn)免疫細(xì)胞通過(guò)咽淋巴環(huán)和引流淋巴結(jié)游離至循環(huán)系統(tǒng)，改變外周免疫細(xì)胞亞群數(shù)量以及比例，可能形成特殊的免疫特征。

本研究以初診且接受流式細(xì)胞檢測(cè)的鼻咽癌患者為研究對(duì)象，納入治療前免疫細(xì)胞亞群及計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比例（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）、淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞比例（lymphocyteto-monocyte ratio，LMR）、血小板與淋巴細(xì)胞比例（platelet-to-lymphocyte ratio，PLR）以及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、預(yù)后營(yíng)養(yǎng)指數(shù)（prognostic nutritional index，PNI）、血漿EB病毒載量、臨床分期等既往報(bào)道的預(yù)后因素[7-9]，對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行多維度評(píng)估，嘗試建立以臨床可及檢查手段為基礎(chǔ)的初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，輔助此部分患者早期診斷，為臨床創(chuàng)造提前干預(yù)的窗口。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性收集2019年1月至2021年6月于四川省腫瘤醫(yī)院確診并接受外周血淋巴細(xì)胞亞群分析的初診鼻咽癌患者231例。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審批號(hào)：SCCHEC-02-2019-10）。

1.2 方法

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 1）于本院病理確診且未接受任何治療的鼻咽癌患者，腫瘤細(xì)胞原位雜交EBER（+）；2）KPS評(píng)分≥70分；3）有完整的初始臨床病例資料；4）無(wú)免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病且既往未經(jīng)免疫治療；5）無(wú)活動(dòng)期急慢性傳染性疾??；6）未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。

1.2.2 外周血免疫學(xué)指標(biāo)和臨床特征收集 包括患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史、血漿EBV DNA拷貝數(shù)、血常規(guī)指標(biāo)（中性粒數(shù)目、淋巴細(xì)胞數(shù)目、單核細(xì)胞數(shù)目、血小板數(shù)目）、生化指標(biāo)（LDH、白蛋白）、外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比及絕對(duì)值[CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD（16+56）+NK細(xì)胞]，計(jì)算NLR、LMR、PLR以及PNI指數(shù)。

1.2.3 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移診斷標(biāo)準(zhǔn) 入組患者根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）第8版進(jìn)行重新分期，根據(jù)初診是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組，進(jìn)行臨床和免疫指標(biāo)與轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性分析。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移診斷標(biāo)準(zhǔn)：肝轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)準(zhǔn)為組織活檢證實(shí)，或超聲、CT、MRI任何兩項(xiàng)，或PET/CT一項(xiàng)影像學(xué)提示轉(zhuǎn)移；骨轉(zhuǎn)移為活檢病理證實(shí)，或骨掃描、核磁、CT任意兩項(xiàng)，或PET/CT一項(xiàng)提示轉(zhuǎn)移；肺轉(zhuǎn)移為活檢病理證實(shí)，或PET/CT一項(xiàng)，或胸部CT需由兩位高年資影像醫(yī)師一致考慮為轉(zhuǎn)移。

1.2.4 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分層標(biāo)準(zhǔn) 本研究根據(jù)患者轉(zhuǎn)移負(fù)荷嚴(yán)重程度分為輕度轉(zhuǎn)移和重度轉(zhuǎn)移，分別檢驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的有效性。輕度轉(zhuǎn)移定義為單個(gè)器官轉(zhuǎn)移，且所有轉(zhuǎn)移灶直徑之和<3 cm；重度轉(zhuǎn)移定義為多器官轉(zhuǎn)移或所有病灶直徑之和≥3 cm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素及多因素分析，列線圖模型構(gòu)建及性能檢驗(yàn)使用R 4.1.1軟件和RMS程序包，圖形繪制采用GraphPad Prism 8.0軟件。所有檢驗(yàn)均為雙尾檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）中的曲線下面積及最佳約登指數(shù)確定各連續(xù)變量資料的截?cái)嘀?，以此分為高值組和低值組。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，用χ2 Test或Fisher′s Exact Test進(jìn)行單因素分析。將單因素分析中P<0.05的指標(biāo)進(jìn)一步納入多元Logistic逐步回歸法分析，從而確定初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的獨(dú)立相關(guān)因素。基于多因素分析篩選出的指標(biāo)構(gòu)建可視化列線圖預(yù)測(cè)模型。使用Bootstrap重抽樣法對(duì)列線圖預(yù)測(cè)模型進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，重復(fù)取樣次數(shù)1 000次。采用一致性指數(shù)（C-index）、ROC曲線下面積（AUC）、臨床決策曲線（DCA）以及臨床影響曲線（CIC）進(jìn)一步分析列線圖性能，并使用Calibration校正曲線來(lái)描述列線圖的符合度。根據(jù)模型預(yù)測(cè)概率分為高、中、低危三組，驗(yàn)證各分期患者危險(xiǎn)分組的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床特征

本研究共納入231初診鼻咽癌患者，其中男性163例，女性68例，男女比例為2.4∶1，中位年齡50.5（18～71）歲。血漿EBV DNA拷貝數(shù)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為400拷貝/mL，其中<400拷貝/mL為141例（61.1%），≥400拷貝/mL為90例（38.9%）。根據(jù)治療前各項(xiàng)輔助檢查明確已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者48例，未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者183例。48例轉(zhuǎn)移患者中，骨轉(zhuǎn)移20例，肺轉(zhuǎn)移9例，肝轉(zhuǎn)移6例，骨轉(zhuǎn)移合并肺轉(zhuǎn)移6例，骨轉(zhuǎn)移合并肝轉(zhuǎn)移4例，肝轉(zhuǎn)移合并肺轉(zhuǎn)移3例（表1）。

表1 231初診鼻咽癌患者的臨床特征

2.2 轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的單因素及多因素分析

單因素分析表明，EBV DNA拷貝數(shù)、N分期、CD4/CD8比值、B細(xì)胞百分比、NK細(xì)胞百分比、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)、B細(xì)胞絕對(duì)數(shù)、NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)、LDH、NLR、PNI以及LMR與初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者有關(guān)（均P<0.05，表2）。由于CD4/CD8比值是由CD4與CD8簡(jiǎn)單運(yùn)算得出，存在顯著的共線性，故僅將CD4/CD8比值納入多因素分析。多因素Logistic回歸分析最終篩選出N分期、CD4/CD8比值、NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)、LDH以及PNI是初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的獨(dú)立相關(guān)因素（均P<0.05，表3）。

表2 兩組患者臨床及免疫學(xué)特征比較

表2 兩組患者臨床及免疫學(xué)特征比較 （續(xù)表2）

表3 初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的多因素Logistics分析

表3 初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的多因素Logistics分析 （續(xù)表3）

2.3 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型的建立及評(píng)價(jià)

根據(jù)多因素篩選結(jié)果建立預(yù)測(cè)模型，并以可視化列線圖展示（圖1）。通過(guò)Bootstrap法重抽樣1 000次，對(duì)列線圖進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證得到C-index為0.826。ROC曲線分析表明AUC值為0.826，模型的總體準(zhǔn)確度較高（圖2B）。Calibration校正曲線顯示列線圖預(yù)測(cè)的概率與實(shí)際概率基本一致（圖2A），提示建立的列線圖模型可以以較高的敏感度和準(zhǔn)確度區(qū)分轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組患者。在臨床適用性方面，DCA曲線表明當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)度>20%時(shí)，模型存在顯著的臨床凈獲益度（圖2C）。CIC曲線則進(jìn)一步表明，該模型在風(fēng)險(xiǎn)度>20%后預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移概率與實(shí)際轉(zhuǎn)移概率具有良好的一致性（圖2D）。

圖1 預(yù)測(cè)初診鼻咽癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的列線圖模型

圖2 預(yù)測(cè)模型的多維度驗(yàn)證

2.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型對(duì)輕度轉(zhuǎn)移患者識(shí)別能力的初步驗(yàn)證

根據(jù)Nomogram得分，將患者分為以下組別：低風(fēng)險(xiǎn)組（轉(zhuǎn)移發(fā)生概率<30%，得分<260分）、中風(fēng)險(xiǎn)組（轉(zhuǎn)移發(fā)生概率30%～50%，得分260～307分）以及高風(fēng)險(xiǎn)組（轉(zhuǎn)移發(fā)生概率>50%，得分>307分）。進(jìn)一步分析在早期無(wú)轉(zhuǎn)移患者、中、晚期無(wú)轉(zhuǎn)移患者、輕度轉(zhuǎn)移患者及重度轉(zhuǎn)移患者群體中，以上3種風(fēng)險(xiǎn)患者所占比例。結(jié)果顯示，早期無(wú)轉(zhuǎn)移患者中、高風(fēng)險(xiǎn)比例為0，中、晚期無(wú)轉(zhuǎn)移患者分別為7.7%、4.9%，而轉(zhuǎn)移組中高風(fēng)險(xiǎn)構(gòu)成顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移組。尤為重要的是，輕度轉(zhuǎn)移患者和中、晚期無(wú)轉(zhuǎn)移患者比較，在全身腫瘤負(fù)荷相當(dāng)?shù)那闆r下，中、高風(fēng)險(xiǎn)分別占到總體的50.0%和30.8%，證明模型可以有效地輔助鑒別隱匿性的轉(zhuǎn)移患者（表4）。

表4 各分期患者的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分布情況分析 n（%）

3 討論

鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的精確預(yù)測(cè)能有效地輔助臨床決策，創(chuàng)造早期干預(yù)空間，提高患者生存率和生存質(zhì)量。N分期[8]和EB病毒拷貝數(shù)[9]是目前臨床較為確切的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但后者由于不同臨床中心EBV-DNA定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不同，且鼻咽癌非高發(fā)地區(qū)陽(yáng)性檢出率較低等[10]客觀原因存在一定應(yīng)用局限性。綜合臨床特征、免疫、代謝以及分子病理等因素的綜合評(píng)估體系可能較單一因素更為準(zhǔn)確可靠。本研究回顧性分析大樣本鼻咽癌患者數(shù)據(jù)，嘗試將外周血免疫學(xué)特征納入多因素預(yù)測(cè)模型，最終篩選出以下與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的免疫及臨床獨(dú)立高風(fēng)險(xiǎn)因素：N3期、CD4/CD8比值<1.75、NK細(xì)胞數(shù)目≥257.5個(gè)/μL、LDH≥185.5 U/L以及PNI<52.74。據(jù)此建立的預(yù)測(cè)模型能較好地預(yù)測(cè)初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者，尤為重要的是，對(duì)早期以及隱匿性轉(zhuǎn)移識(shí)別體現(xiàn)了較高的敏感度和特異度，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

隨著近年來(lái)腫瘤免疫相關(guān)研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤患者宿主免疫細(xì)胞亞群變化特征與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后呈顯著相關(guān)。如Thommen等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)慢性病毒感染和腫瘤患者體內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞逐漸耗竭和失能，或是感染未控及腫瘤進(jìn)展的重要因素之一。Nicholson等[13]研究也表明，細(xì)胞因子蛋白質(zhì)抑制劑（SOCS）負(fù)性調(diào)控IL-15，從而抑制了NK細(xì)胞的發(fā)育和激活，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生。此外，有研究表明治療后發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者與未轉(zhuǎn)移患者相比，外周血CD8+T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)顯著下降，且T細(xì)胞受體β鏈（TCRB）的多樣性顯著降低[14]。然而，目前關(guān)于初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者宿主免疫背景的研究仍較為缺乏。本研究創(chuàng)新性地納入外周血免疫細(xì)胞亞群數(shù)量及比例，通過(guò)更為精確的單平臺(tái)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目及比例進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)[15]，有助于從免疫學(xué)角度進(jìn)一步厘清初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生的部分機(jī)制。

本研究的局限性主要在于病例篩選可能存在偏倚。由于為回顧性研究，患者在治療前是否接受外周血免疫細(xì)胞亞群檢測(cè)取決于接診醫(yī)生，同時(shí)轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移患者之間樣本數(shù)量相差較大，兩者均可能導(dǎo)致抽樣誤差，影響結(jié)果的客觀性。此外，所有病例均來(lái)自單中心、非高發(fā)區(qū)，缺乏有廣泛意義的外部驗(yàn)證隊(duì)列；模型評(píng)估為高風(fēng)險(xiǎn)，但尚未遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)的患者需要持續(xù)觀察，對(duì)其預(yù)測(cè)能力可能具有更重要的臨床意義。

綜上所述，本研究揭示了初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者的宿主免疫背景的特征性變化，并利用外周血免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)，結(jié)合其他臨床因素，建立了初診鼻咽癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)模型。模型在臨床分期、影像學(xué)等輔助檢查之外，提供另一種識(shí)別早期轉(zhuǎn)移的工具。研究納入的預(yù)后指標(biāo)除流式檢查以外均為臨床常規(guī)檢查項(xiàng)目，而流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血免疫細(xì)胞亞群已在國(guó)內(nèi)醫(yī)院廣泛開(kāi)展，模型的經(jīng)濟(jì)性和臨床可及性均有利于推廣。該模型的運(yùn)用和進(jìn)一步完善可能有助于各中心提高早期或隱匿性轉(zhuǎn)移患者的檢出率，對(duì)提高此部分患者的生存率有重要意義。