米 蘭，王佳堃

（浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058）

消化道微生物與其宿主的健康及生產(chǎn)性能密切相關(guān)。高通量組學(xué)技術(shù)有利地揭秘了特定生境下的微生物組成和潛在的群落功能。但受測(cè)序深度和測(cè)序讀長(zhǎng)的限制，組學(xué)技術(shù)難以追蹤低豐度的微生物，難以在種水平上比較菌群間的差異；且組學(xué)獲得的功能信息未能在菌株水平上加以驗(yàn)證，仍停留在基因或相關(guān)分析水平。因此，結(jié)合傳統(tǒng)純培養(yǎng)和高通量組學(xué)技術(shù)的培養(yǎng)組學(xué)，分離、培養(yǎng)基于組學(xué)技術(shù)獲得的“尚未被培養(yǎng)”的微生物，驗(yàn)證其形態(tài)特征、生理功能、生長(zhǎng)特性、代謝功能、酶促反應(yīng)等，已成為近年來(lái)微生物研究的熱點(diǎn)和突破口。

培養(yǎng)組學(xué)利用微生物基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得目標(biāo)微生物的最佳生存環(huán)境，大大提高了目標(biāo)微生物的可培養(yǎng)性，成功分離、培養(yǎng)和鑒定了生境中大量新的菌株。為人們研究微生物功能及其與宿主間的互作關(guān)系提供了菌株資源，使微生物功能研究進(jìn)入個(gè)性化時(shí)代。本文主要綜述了影響微生物培養(yǎng)的因素、培養(yǎng)組學(xué)的分選和鑒定技術(shù)、培養(yǎng)組學(xué)在動(dòng)物消化道研究中的應(yīng)用，為進(jìn)一步研究動(dòng)物腸道微生物提供參考依據(jù)。

1 影響微生物培養(yǎng)的因素

微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜，其生長(zhǎng)依賴于非常嚴(yán)格的環(huán)境條件，任何偏差都可能導(dǎo)致微生物無(wú)法被成功分離和培養(yǎng)。影響微生物人工培養(yǎng)的因素除微生物生長(zhǎng)環(huán)境條件和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，主要有微生物間的生態(tài)關(guān)系和“群體感應(yīng)（Quorum-Sensing）”、休眠微生物的誘導(dǎo)復(fù)蘇及低豐度微生物的競(jìng)爭(zhēng)性。

1.1 微生物間的生態(tài)關(guān)系和“群體感應(yīng)”自然環(huán)境中微生物間的生態(tài)關(guān)系復(fù)雜多樣，主要包括互利共生、互養(yǎng)共棲、共代謝、協(xié)同作用、拮抗作用、寄生等。人工培養(yǎng)微生物時(shí)，往往忽視或破壞了自然環(huán)境中微生物間的生態(tài)關(guān)系。具有共生或者互養(yǎng)關(guān)系的微生物可在共培養(yǎng)條件下穩(wěn)定生長(zhǎng)，但在相同人工培養(yǎng)條件下單獨(dú)分離培養(yǎng)時(shí)，卻無(wú)法正常生長(zhǎng)和存活。產(chǎn)氫細(xì)菌（H-Producing Bacteria）和氫利用產(chǎn)甲烷菌（H-Consuming Methanogens）是自然環(huán)境中典型的互養(yǎng)共生微生物。Guzman 等使用電化學(xué)生物反應(yīng)器模擬產(chǎn)甲烷菌的共生作用，可成功富集，但完全去除產(chǎn)甲烷菌卻無(wú)法獲得。微生物間的相互接觸是保證共生或互養(yǎng)微生物正常生長(zhǎng)的重要條件，使用透析膜分隔培養(yǎng)具有共生或互養(yǎng)關(guān)系的微生物，其生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)低于共培養(yǎng)。另外，微生物具有“群體感應(yīng)”功能，可以依據(jù)特定的信號(hào)分子（如環(huán)磷酸腺苷和?；呓z氨酸內(nèi)酯等）濃度，判斷環(huán)境中其他微生物數(shù)量的變化，通過(guò)誘導(dǎo)菌體中相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)環(huán)境。當(dāng)微生物從自然環(huán)境被轉(zhuǎn)移到人工培養(yǎng)條件下時(shí)，“群體感應(yīng)”系統(tǒng)可通過(guò)一系列協(xié)調(diào)應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)適應(yīng)性強(qiáng)的微生物快速生長(zhǎng)，但適應(yīng)性較弱或生長(zhǎng)速度較慢的微生物或因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足而受到抑制。

1.2 休眠微生物的誘導(dǎo)復(fù)蘇 休眠是一種低代謝活動(dòng)的可逆狀態(tài)，很多與人類健康密切相關(guān)的微生物（如能夠引起炭疽、結(jié)核病和霍亂的細(xì)菌）遇到有壓力的環(huán)境就會(huì)進(jìn)入此狀態(tài)。不少種類微生物還會(huì)產(chǎn)生特殊的休眠構(gòu)造。由于休眠微生物特殊的休眠結(jié)構(gòu)和代謝機(jī)制，休眠的微生物需要在特定條件下進(jìn)行誘導(dǎo)復(fù)蘇，但這一過(guò)程具有隨機(jī)性，加大了人工分離培養(yǎng)的難度。Dworkin等研究證明，一些信號(hào)分子以及微生物間的互作等都有可能影響休眠微生物的復(fù)蘇。因此，深入探究休眠微生物的形成機(jī)制，開(kāi)發(fā)誘導(dǎo)復(fù)蘇休眠體的方法，對(duì)人工分離培養(yǎng)這類微生物至關(guān)重要。

1.3 低豐度微生物的競(jìng)爭(zhēng)性 低豐度微生物在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和物質(zhì)循環(huán)中同樣發(fā)揮著重要的作用。為了提高低豐度微生物人工分離培養(yǎng)的成功率，人們通常借助已公開(kāi)發(fā)表的16S rRNA 基因測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得目標(biāo)微生物生存的最佳環(huán)境（即相對(duì)豐度最高的環(huán)境），從最佳環(huán)境中對(duì)其進(jìn)行富集分離。但是，當(dāng)對(duì)已分離的目標(biāo)微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，環(huán)境中有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的共培養(yǎng)微生物往往可以利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速生長(zhǎng)，迅速成為高豐度微生物，代替目標(biāo)微生物占據(jù)主導(dǎo)地位，從而導(dǎo)致目標(biāo)微生物難以被成功培養(yǎng)。從環(huán)境中分離單細(xì)胞作為接種體（Inocula）進(jìn)行培養(yǎng)，是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的分離培養(yǎng)低豐度微生物較為有效的方法。另外，對(duì)于寡營(yíng)養(yǎng)的低豐度微生物，使用營(yíng)養(yǎng)成分較低的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在一定程度上可以抑制生長(zhǎng)速度較快的共培養(yǎng)微生物生長(zhǎng)。

模擬自然環(huán)境條件，使微生物生長(zhǎng)在適宜濃度的環(huán)境因子中，是成功分離、培養(yǎng)目標(biāo)微生物的關(guān)鍵因素。但由于傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)技術(shù)的局限性以及目前對(duì)微生物生長(zhǎng)特性掌握的片面性，使人工培養(yǎng)條件無(wú)法完全還原微生物生長(zhǎng)的自然環(huán)境，無(wú)法完全提供微生物生長(zhǎng)所需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。針對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)缺陷問(wèn)題，近年來(lái)，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)出一系列微生物培養(yǎng)的新技術(shù)，使越來(lái)越多自然環(huán)境中的新菌株可被分離、培養(yǎng)和鑒定。

2 培養(yǎng)組學(xué)的分選和鑒定技術(shù)

培養(yǎng)組學(xué)（Culturomics）通常指基于已有的微生物基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得目標(biāo)微生物的最佳生存環(huán)境，從最佳環(huán)境中富集目標(biāo)菌株/菌群細(xì)胞，通過(guò)多重培養(yǎng)方法對(duì)已富集的菌株/菌群進(jìn)行分離培養(yǎng)，以獲取培養(yǎng)物，并結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）和16S rRNA 基因測(cè)序等新生檢測(cè)技術(shù)，對(duì)培養(yǎng)物加以鑒定，是新興的微生物培養(yǎng)方法學(xué)（圖1）。

圖1 微生物培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)的工作流程[3]

2.1 培養(yǎng)組學(xué)的技術(shù) 分離是獲得微生物純培養(yǎng)物的關(guān)鍵步驟。為了實(shí)現(xiàn)高通量分離培養(yǎng)單一菌株或分離培養(yǎng)具有特定生物功能的菌群，培養(yǎng)組學(xué)主要采用的分離方法有膜擴(kuò)散型培養(yǎng)技術(shù)、微流控型培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞分選培養(yǎng)技術(shù)（表1）。

表1 培養(yǎng)組學(xué)的分選技術(shù)及其特點(diǎn)

2.1.1 膜擴(kuò)散型培養(yǎng)技術(shù) 膜擴(kuò)散型培養(yǎng)技術(shù)使用特定孔徑的濾器或隔膜裝置，將微生物細(xì)胞與原生環(huán)境進(jìn)行物理分隔，原生環(huán)境中的生長(zhǎng)因子可通過(guò)孔徑進(jìn)入裝置，為微生物細(xì)胞生長(zhǎng)提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

土壤基質(zhì)膜系統(tǒng)（Soil Substrate Membrane System，SSMS）是一種利用膜擴(kuò)散型培養(yǎng)技術(shù)分離培養(yǎng)土壤中功能微生物的裝置。該裝置將土壤懸浮液中分離的微生物細(xì)胞接種在基質(zhì)膜上，覆蓋在可為微生物提供生長(zhǎng)因子的土壤上層，進(jìn)行培養(yǎng)并獲得目標(biāo)微生物的菌落。Sipkema 等利用與SSMS 類似的原理，使用漂浮過(guò)濾培養(yǎng)法（Floating Filter Cultures），成功從海水樣本中分離培養(yǎng)出海綿體（）sp.。

中空纖維膜室裝置（Hollow-Fiber Membrane Chamber，HFMS）是一種將大量中空纖維管與細(xì)胞隔離室連接的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，纖維管可通過(guò)連續(xù)稀釋環(huán)境中的細(xì)胞懸浮液來(lái)獲得單細(xì)胞個(gè)體，并使其在原生液體環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。

分離芯片（isolation Chip，iChip）以及一些衍生裝置通常由許多小孔室組成，是一種可以實(shí)現(xiàn)從環(huán)境中高通量分離培養(yǎng)多種微生物細(xì)胞的裝置。人們將瓊脂稀釋的單一或幾種混合微生物分別加入到iChip 小孔室中，置于自然環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，iChip 兩側(cè)的半滲透樹(shù)脂膜可以使?fàn)I養(yǎng)因子和其他物質(zhì)從周圍環(huán)境中進(jìn)入到小孔室內(nèi)，并阻止環(huán)境中其他微生物進(jìn)入，為微生物細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。Ling 等通過(guò)使用iChip 從土壤中分離、培養(yǎng)出許多新的菌株，并發(fā)現(xiàn)一種新型抗生素——滴蟲肌動(dòng)蛋白（Teixobactin）。

膜擴(kuò)散生物反應(yīng)器（Diffusion Bioreactor）是一種適用于微生物大體積培養(yǎng)的裝置，由內(nèi)外兩層腔室組成，內(nèi)層是微生物細(xì)胞培養(yǎng)室，外層可為內(nèi)層微生物細(xì)胞生長(zhǎng)提供環(huán)境因子。利用膜擴(kuò)散生物反應(yīng)器，自然環(huán)境中的微生物細(xì)胞可以快速生長(zhǎng)、增殖，為后續(xù)菌株單細(xì)胞分離提供試驗(yàn)材料。

膜擴(kuò)散型培養(yǎng)技術(shù)可以為微生物生長(zhǎng)提供最適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，克服了傳統(tǒng)微生物人工培養(yǎng)無(wú)法完全提供微生物生長(zhǎng)所需全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等局限。利用膜擴(kuò)散培養(yǎng)技術(shù)，微生物細(xì)胞不僅可以進(jìn)行原位培養(yǎng)，也可以與共生或互養(yǎng)關(guān)系的微生物進(jìn)行共培養(yǎng)。另外，微生物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的潛在抑制生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，可以透過(guò)孔徑擴(kuò)散到環(huán)境中，避免了由于聚集而產(chǎn)生的毒害作用。

2.1.2 微流控型培養(yǎng)技術(shù) 微流控芯片技術(shù)可以在芯片大小的區(qū)域內(nèi)實(shí)現(xiàn)多數(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本功能，被喻為“芯片實(shí)驗(yàn)室”。因其具有微型化、自動(dòng)化、多樣化、高通量、可擴(kuò)展、低消耗、所需樣本體積小、反應(yīng)速率快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。利用微流控型技術(shù)進(jìn)行微生物細(xì)胞培養(yǎng)，不僅可以對(duì)微生物生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間等進(jìn)行精確調(diào)控，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微生物的形態(tài)變化，還可以實(shí)現(xiàn)在不同生長(zhǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)因子下，同時(shí)對(duì)微生物單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。另外，一些微流控芯片可以通過(guò)控制芯片中氧氣的含量，對(duì)厭氧微生物進(jìn)行培養(yǎng)。

滑移芯片（SlipChip）一般由兩塊含通道和小孔的微流控芯片緊密連接構(gòu)成。其核心特征在于通過(guò)兩塊芯片的相對(duì)滑動(dòng)，改變不同的通道結(jié)構(gòu)，來(lái)實(shí)現(xiàn)通道和小孔不同的連接狀態(tài)，從而執(zhí)行不同的處理和操作。當(dāng)兩塊芯片緊密接觸時(shí)，微生物單細(xì)胞可以在裝有不同營(yíng)養(yǎng)因子的滑移芯片小孔中進(jìn)行高通量培養(yǎng)；當(dāng)滑動(dòng)分離時(shí)，兩塊芯片可以成為獨(dú)立的單塊單層微流控芯片，一塊可用于觀察微生物生長(zhǎng)或分類鑒定等，另一塊可繼續(xù)進(jìn)行微生物高通量培養(yǎng)。Ma 等利用該技術(shù)，首次成功從人體消化道中分離出瘤胃球菌屬（）。

納米微孔微生物孵化器（Nanoporous Microscale Microbial Incubator，NMMI）是由多個(gè)具有膜擴(kuò)散功能小孔組成的微流控芯片系統(tǒng)。微生物單細(xì)胞可以在小孔中單獨(dú)生長(zhǎng)，周圍環(huán)境因子及共生微生物的代謝產(chǎn)物可以通過(guò)隔膜進(jìn)入小孔為微生物生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。NMMI 將微流控型培養(yǎng)技術(shù)和膜擴(kuò)散型培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，克服了微流控技術(shù)無(wú)法為目標(biāo)微生物生長(zhǎng)提供原生環(huán)境和共生伙伴的局限性。

液滴微流控培養(yǎng)（Droplet Cultivation）技術(shù)是一種操作微小液體體積的技術(shù)，可以通過(guò)無(wú)限稀釋法（Dilution-To-Extinction）將單個(gè)微生物分散到微液滴中，每個(gè)微液滴單元可以作為獨(dú)立微反應(yīng)器進(jìn)行微生物培養(yǎng)。液滴微流控培養(yǎng)技術(shù)具有高效的微生物分散能力，可以高通量、高效率、低成本的構(gòu)建大規(guī)模單菌株培養(yǎng)陣列，從而實(shí)現(xiàn)目的微生物的選擇性擴(kuò)增。

2.1.3 細(xì)胞分選培養(yǎng)技術(shù) 微生物細(xì)胞分選技術(shù)主要包括傳統(tǒng)涂布法（Spreading）、光學(xué)鑷子（Optical Tweezers），以及微體積、高通量的液滴法（Droplet-Based）、微流控法（Microfluidic-Based）和流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）等。

熒光激活細(xì)胞分選（Fluorescence-Activated Cell sorting，F(xiàn)ACS）技術(shù)是一種利用組織自身熒光信號(hào)或通過(guò)與熒光染料結(jié)合，對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行定量分析和分選的技術(shù)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于微生物細(xì)胞的分選和檢測(cè)。

熒光原位雜交（FISH）技術(shù)可以通過(guò)熒光標(biāo)記，快速識(shí)別、定量特異的微生物細(xì)胞。被FISH 技術(shù)標(biāo)記的微生物細(xì)胞可以通過(guò)FACS 技術(shù)進(jìn)行分離培養(yǎng)，并用于后續(xù)高通量測(cè)序分析。但是化學(xué)固定以及熒光染料和標(biāo)記探針等都會(huì)影響微生物的活性和細(xì)胞通透性。Batani 等通過(guò)改進(jìn)傳統(tǒng)FISH 技術(shù)，省略化學(xué)固定等操作步驟，成功將標(biāo)記探針導(dǎo)入到活的微生物細(xì)胞中，并通過(guò)FACS 技術(shù)，從海水樣本中分離出活的-變形桿菌（），但是其細(xì)胞成活率仍然處于較低水平（1.24%～2.82%）。

反向基因組學(xué)（Reverse Genomics）可以對(duì)新的目標(biāo)微生物細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并維持其細(xì)胞活性。首先，對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行單細(xì)胞基因測(cè)序，鑒定出編碼胞外膜蛋白的基因，篩選胞外膜蛋白上的特定表位，合成靶蛋白結(jié)構(gòu)域抗原，然后將抗原接種到受體體內(nèi)進(jìn)行免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，純化抗體并使用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，接著將熒光標(biāo)記的抗體加入到環(huán)境樣本中，使其對(duì)目標(biāo)微生物細(xì)胞進(jìn)行染色，最后利用FACS 技術(shù)對(duì)目標(biāo)微生物細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)。Cross 等通過(guò)使用反向基因組學(xué)技術(shù)，從人體口腔中成功分離培養(yǎng)了3 株歸類于候選門級(jí)輻射類群（Candidate Phyla Radiation，CPR）細(xì)菌的（TM7）菌株。

另外，拉曼活細(xì)胞分選（Raman-Activated Cell Sorting，RACS）技術(shù)可以利用特定的拉曼譜帶作為生物標(biāo)記物對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，并結(jié)合微流控法或光學(xué)鑷子對(duì)拉曼光譜標(biāo)記的微生物細(xì)胞進(jìn)行分選。RACS 能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行無(wú)損預(yù)處理，保證其分選后的細(xì)胞具有活性，可被純培養(yǎng)。

上述這些微生物分離、培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，使人們從人體和自然環(huán)境中獲得了大量新的微生物。但精簡(jiǎn)微生物分離、培養(yǎng)的操作步驟是培養(yǎng)組學(xué)進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵。

2.2 培養(yǎng)組學(xué)的鑒定方法 通過(guò)上述培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)分離獲得的高通量克隆或微生物細(xì)胞，需要同樣高通量的鑒定技術(shù)對(duì)其分類學(xué)地位進(jìn)行快速鑒定，準(zhǔn)確篩選出具有生長(zhǎng)活性的目標(biāo)微生物細(xì)胞，才能提高目標(biāo)微生物的培養(yǎng)效率，為后續(xù)功能研究等奠定良好的基礎(chǔ)。為此，培養(yǎng)組學(xué)對(duì)應(yīng)的高通量的鑒定技術(shù)有基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）鑒定、16S rRNA 基因擴(kuò)增測(cè)序鑒定和拉曼光譜鑒定。

2.2.1 MALDI-TOF-MS 鑒定 MALDI-TOF-MS 可以通過(guò)檢測(cè)微生物多肽或蛋白質(zhì)，形成微生物特有的蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的微生物“多肽指紋圖譜”進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物分類學(xué)地位的快速鑒定。因其具有成本低、操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微生物的高通量篩選和快速鑒定中。但是，MALDI-TOF-MS 無(wú)法同時(shí)對(duì)混合的微生物進(jìn)行鑒定，且參考數(shù)據(jù)庫(kù)更新較慢。

2.2.2 16S rRNA 基因擴(kuò)增測(cè)序鑒定 16S rRNA 基因存在于全部細(xì)菌和古菌基因組中，其可變區(qū)序列具有高度異質(zhì)性，可作為判斷物種間差異的依據(jù)。通過(guò)對(duì)目標(biāo)微生物的16S rRNA 基因全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，并通過(guò)與16S rRNA 基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，可以推斷目標(biāo)微生物物種的多樣性和相對(duì)豐度。16S rRNA 基因擴(kuò)增測(cè)序被廣泛應(yīng)用于鑒定混合微生物培養(yǎng)物或檢測(cè)連續(xù)富集培養(yǎng)的微生物群落，但其測(cè)序結(jié)果往往受測(cè)序深度和引物選擇等影響，且不同可變區(qū)16S rRNA 基因比對(duì)的準(zhǔn)確性不同。

2.2.3 拉曼光譜鑒定 拉曼光譜鑒定是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型微生物鑒定方法，可以通過(guò)微生物自身生成的“拉曼光譜指紋圖譜”，對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、無(wú)損傷的鑒定。與其他兩種鑒定方法相比，拉曼光譜鑒定對(duì)微生物樣品需要量更少，對(duì)菌體無(wú)損傷，并且可以對(duì)混合的微生物進(jìn)行鑒定。但是，利用拉曼光譜鑒定微生物仍處于初步發(fā)展階段，其數(shù)據(jù)庫(kù)和技術(shù)等仍需科學(xué)家們不斷完善和改進(jìn)。

3 培養(yǎng)組學(xué)在動(dòng)物消化道研究中的應(yīng)用及局限性

微生物培養(yǎng)組學(xué)使動(dòng)物消化道中大量未知或“尚未被培養(yǎng)”的微生物的功能得到了深入研究，促進(jìn)了動(dòng)物消化道微生物資源的開(kāi)發(fā)和利用。

小鼠是研究消化道微生物種類和功能最常見(jiàn)的模式動(dòng)物之一，但是大部分小鼠消化道微生物仍未被培養(yǎng)和鑒定。Liu 等對(duì)12 只小鼠和12 只C57BL/6J小鼠盲腸中的微生物進(jìn)行大規(guī)模分離、培養(yǎng)和鑒定，通過(guò)設(shè)計(jì)不同種類的固體和液體培養(yǎng)基，設(shè)置厭氧和需氧等多種培養(yǎng)條件以及一系列標(biāo)準(zhǔn)化的微生物分離、培養(yǎng)流程，從小鼠盲腸中先后分離獲得1 831 個(gè)純培養(yǎng)物，通過(guò)對(duì)這些純培養(yǎng)物進(jìn)行16S rRNA 基因測(cè)序鑒定，最終對(duì)來(lái)自126 種微生物的1 437 個(gè)菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和菌種保藏，其中，來(lái)自43 個(gè)屬水平的77 個(gè)菌株是首次被分離、培養(yǎng)的潛在新微生物。該研究中建立的小鼠消化道微生物資源庫(kù)（mGMB）覆蓋了超過(guò)52% 的小鼠消化道微生物宏基因組非冗余基因集；使可分離、培養(yǎng)的小鼠消化道微生物在屬水平上從48 種擴(kuò)大到110 種，在種水平上從76 種擴(kuò)大到180 種；使小鼠消化道16S rRNA 基因數(shù)據(jù)庫(kù)在reads 水平上的覆蓋度從18.37%增加到42.20%。

Zhou 等利用微流控高通量單細(xì)胞培養(yǎng)（Micro fludic Streak Plate，MSP）技術(shù)，從白蟻消化道中共成功分離獲得99 個(gè)OTU 分類單元，其中18 個(gè)OTU 分類單元是首次在白蟻消化道中被報(bào)道；分離培養(yǎng)出396 個(gè)微生物，主要是來(lái)自于屬、屬和屬的新菌株。

Medveck 等利用添加了30%瘤胃液的Wilkins-Chalgren 厭氧菌肉湯培養(yǎng)基，在厭氧條件下，對(duì)雞盲腸中的微生物進(jìn)行分離、培養(yǎng)，共獲得204 個(gè)純培養(yǎng)物，通過(guò)對(duì)這些純培養(yǎng)物進(jìn)行全基因組測(cè)序分析和鑒定，最終獲得來(lái)自7 個(gè)門的133 個(gè)厭氧菌株，其中84 個(gè)屬于厚壁菌門、29 個(gè)屬于擬桿菌門、15 個(gè)屬于放線菌門、2 個(gè)屬于變形菌門、1 個(gè)屬于疣微菌門、1 個(gè)屬于Elusimicrobia 門、1 個(gè)屬于Synergistetes 門。該研究建立的菌株資源庫(kù)，為雞消化道功能益生菌的開(kāi)發(fā)提供了豐富的菌株資源。Duquenoy 等根據(jù)微生物的不同特性，如有無(wú)孢子、是否需要氧氣等，設(shè)置了不同類型的固體培養(yǎng)基，對(duì)雞盲腸中的微生物進(jìn)行分離、培養(yǎng)，最終獲得了347 個(gè)純培養(yǎng)物，經(jīng)過(guò)MALDI-TOF-MS 和16S rRNA 基因測(cè)序技術(shù)鑒定，發(fā)現(xiàn)這347 個(gè)純培養(yǎng)物至少歸類于60 個(gè)菌種。

董等利用培養(yǎng)組學(xué)方法對(duì)3 頭斷奶前后仔豬回腸和結(jié)腸中的細(xì)菌進(jìn)行高通量分離、培養(yǎng)和鑒定，通過(guò)25 種不同類型培養(yǎng)基，分別在有氧和厭氧條件下對(duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，共篩選獲得包括梭桿菌、擬桿菌等較難分離的菌株和乳酸菌等在內(nèi)的1 385 株厭氧、好氧和兼性厭氧細(xì)菌及116 個(gè)疑似新菌株。

培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，在反芻動(dòng)物消化道微生物分離、培養(yǎng)中鮮有報(bào)道。Zehavi 等在改良的M10 培養(yǎng)基中添加30 mL 厭氧蒸餾處理的瘤胃液，在厭氧培養(yǎng)箱中（5% H、20% CO、75% N）獲得的純培養(yǎng)物約占牛瘤胃中微生物總OTU 數(shù)的23%～40%。該研究發(fā)現(xiàn)，樣品稀釋的倍數(shù)和培養(yǎng)基類型是影響瘤胃微生物在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。

培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在動(dòng)物消化道微生物研究中得到了應(yīng)用，但仍處于初步發(fā)展階段。通過(guò)培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)獲得的大量新菌株，不僅豐富了動(dòng)物消化道微生物數(shù)據(jù)資源庫(kù)，為深入挖掘消化道微生物功能、闡明宿主與消化道微生物的關(guān)系等提供重要信息，也為開(kāi)發(fā)具有潛在利用價(jià)值的益生菌提供了重要的菌株資源和基因資源。

但培養(yǎng)組學(xué)作為微生物研究的新興方法，仍存在許多不足之處：無(wú)法對(duì)形成生物膜的微生物進(jìn)行分離；無(wú)法分離固體樣品（如土壤、沉積物和糞便等）中的微生物；難以實(shí)現(xiàn)對(duì)厭氧微生物的分離培養(yǎng)，也無(wú)法為微生物提供生長(zhǎng)所需的氣體基質(zhì)?？偟膩?lái)說(shuō)，大多數(shù)培養(yǎng)組學(xué)方法依賴于復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作以及精密的實(shí)驗(yàn)條件，明確微生物生存的最佳環(huán)境條件，精簡(jiǎn)微生物分離培養(yǎng)的操作程序，開(kāi)發(fā)、優(yōu)化多種微生物鑒定方法，是微生物培養(yǎng)組學(xué)進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵。

5 小 結(jié)

高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，使人們忽視了對(duì)微生物的分離培養(yǎng)。近年來(lái)微生物培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)的快速興起，足以說(shuō)明微生物培養(yǎng)在微生物功能研究以及對(duì)微生物資源開(kāi)發(fā)和利用中的重要性。微生物培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，極大提高了復(fù)雜生境中微生物的可培養(yǎng)性，極大增加了新菌種的數(shù)量，為深入探究微生物功能與宿主間的作用關(guān)系、微生物資源的開(kāi)發(fā)利用提供了原材料。雖然微生物培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)相較于高通量測(cè)序技術(shù)，程序繁瑣且工作量大，但是其在微生物研究中發(fā)揮的重要作用顯而易見(jiàn)。