許江環(huán) 楊 善 王盼盼 郭海峰 周鴻凱

(廣東海洋大學 濱海農業(yè)學院， 廣東 湛江 524088)

水稻(

Oryza

sativa

L.)作為世界上種植范圍最為廣泛的糧食作物之一，已成為養(yǎng)活了世界一半以上人口的主糧。全世界鹽堿地的面積為9.54 億hm，其中我國的鹽堿地約1億hm，并且還在逐年增加。在全球糧食危機的背景下，鹽堿地作為生產糧食的重要土地潛在資源，可在保障國家糧食安全方面發(fā)揮重要作用，合理利用濱海鹽堿灘涂等進行耐鹽堿水稻良好品質性狀的選育和栽培是提高糧食總產量和品質的有效途徑。

鹽脅迫下，水稻植株體內產生大量的活性氧(Reactive oxide species, ROS)會造成細胞膜脂質過氧化和生物活性大分子的損傷，導致其光合作用等受到抑制，引起成穗數不足；開花后更是加快了植株衰老進程，讓光合產物無法在短時間內得到有效的累積，輕者致使植株生長受限和產量降低，重者甚至死亡。稻米中的植酸(Phytic acid，IP6)、抗壞血酸(Ascorbic acid，AsA)、花青素(Anthocyanins，AnC)和總黃酮(Total flavonoids，TF)是良好的抗氧化物質。AnC的鄰位羥基與自由基反應生成穩(wěn)定的半醌式結構，在降低氧化損傷和清除自由基方面的能力比其他天然抗氧化物質更強。IP6可以通過自身攜帶的負電荷磷酸鹽基團與金屬離子螯合來減緩重金屬毒害，還可以通過供氫來破壞過氧化物，中斷其形成醛、酮等產物。TF與AnC在改善人體記憶、抗癌、抗腫瘤和抗衰老等功能上發(fā)揮著重要作用。AsA可清除植物PSⅠ在供電子過程中由超氧陰離子在鐵-超氧化物歧化酶復合體的催化下產生的HO，或作為抗壞血酸過氧化物酶的底物來清除自由基，或作為羥化酶的輔助因子、PSⅡ的電子傳遞中間體、細胞信號轉導途徑中的調控元件來參與調節(jié)植物的生長發(fā)育。礦質元素也可參與植株抗氧化過程，在抗氧化和清除ROS能力上，鋅優(yōu)于硒，但是由于硒在植株體內存在形態(tài)的多樣性，如硒酸鹽、亞硒酸鹽、硒蛋白和硒代氨基酸及其衍生物等。富硒水稻中含有的硒蛋白水解物可以通過抑制重金屬誘導的促凋亡來保護細胞免受重金屬毒害。還有研究表明硒顯著促進了紫色馬鈴薯中花青素、鋅和鐵的累積。缺鐵會降低植株中抗氧化酶的活性，導致活性氧的累積，使得植株受到氧化損傷，而抗壞血酸除了自身作為抗氧化物質外，也可以通過促進植株對鐵的吸收來增加抗氧化酶的活性，從而提高植株的抗氧化能力。

植物組織內花青素等抗氧化物質含量研究已在馬鈴薯、葡萄和刺五加果等作物上開展，而NaCl脅迫對稻米中抗氧化物質(AsA、IP6、AnC和TF)和礦質元素含量影響的研究鮮見報道。本試驗設置9個含有NaCl的土壤處理，分別測定6個不同基因型稻米中抗氧化物質與礦質元素含量，旨在探究NaCl脅迫對水稻糙米中抗氧化物質與礦質元素含量的影響，以期為功能型水稻種植與鹽漬地改良利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻種質由廣東海洋大學濱海農業(yè)學院提供，‘海紅11’(‘HH 11’)、‘海紅12’(‘HH 12’)和‘建新99’(‘JX 99’)均為耐鹽秈型紅米水稻，‘陽山香稻’(YSXD)、‘香粘3號’(‘XZ 3’)和‘泰香粘’(‘TXZ’)均為鹽敏感秈型白米水稻。本試驗于2017-09-12—2017-12-04種植在廣東海洋大學農業(yè)生物技術研究所試驗基地內。

1.2 試驗方法

選用當年收獲的粒大飽滿、表面沒有病斑的成熟水稻種子各10 g，用10%的HO在培養(yǎng)皿中浸泡0.5 h消毒，用蒸餾水沖洗2 min后，平鋪在放有育苗專用紙的培養(yǎng)皿中，并放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽42 h，期間每隔8 h清洗并換水，用清水培育至三葉一心。每個試驗桶(規(guī)格：口徑30 cm，高35 cm)裝入過篩后風干、混和均勻的土壤10 kg，設置9個含有NaCl的土壤處理：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 g/kg。隨機區(qū)組試驗設計，3次重復，每組54桶，共162桶。每桶施4 g復合肥作基肥與桶內土壤和NaCl攪拌均勻，加水待鹽度穩(wěn)定后，選取約三葉一心期的幼苗移栽到桶內，6棵/桶。為了保持土壤濕潤，每桶均設置標有相同刻度2 cm的豎插牌，每天早晚觀察桶內水層，根據缺水情況補水至相同刻度，并且使用土壤含鹽量測試儀(Az8371，臺灣衡欣科技股份有限公司)測定桶內土壤鹽分狀況，保證土壤鹽分和電導率穩(wěn)定。

1.3 稻米指標的測定

2017年12月4日，將成熟的水稻收割裝入網袋，并曬干脫殼，將得到的糙米分別進行抗氧化物質和礦質元素含量的測定。植酸(

Y

)、花青素(

Y

)、總黃酮(

Y

)和硒(Se，

X

)分別參照趙仁勇、莫巍、劉江(芻鳥)和袁建等的方法進行測定；抗壞血酸(

Y

)采用2,4-二硝基苯肼比色法進行測定，磷(P，

X

)、鋅(Zn，

X

)、鐵(Fe，

X

)、鎂(Mg，

X

)和錳(Mn，

X

)參考鮑士旦等的方法進行測定。只在‘HH 11’、‘HH 12’和‘JX 99’中測得花青素的含量，而其他3個基因型稻米屬于白米，花青素含量極低，故不進行測定。

1.4 數據分析

運用Excel 2010進行數據整理，利用SPSS 23.0對數據進行方差分析以及簡單效應分析，Duncan法顯著性分析(

P

<0.05)，典型相關分析和典型冗余分析。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對不同基因型稻米中抗氧化物質和礦質元素含量的方差分析和簡單效應分析

由表1和表2可知，NaCl脅迫下稻米中除了AnC和Mg外，其他抗氧化物質和礦質元素的含量均在基因型和NaCl處理間的互作效應達到顯著水平。稻米中AnC的含量在基因型和NaCl處理間均達到極顯著差異，說明AnC在稻米中的累積是受到基因型和NaCl脅迫的相互獨立作用的影響。稻米中Mg含量在基因型和NaCl處理間差異均不顯著，說明稻米中Mg含量的累積均不受基因型和NaCl處理的顯著影響。

由表3和表4可知，每個NaCl處理中，AsA、IP6、TF、Zn、Fe和Se的含量在不同基因型稻米間差異均極顯著。在0、0.5和2.5 g/kg的NaCl處理下，不同基因型稻米間P的含量無顯著差異。在0和1.5 g/kg的NaCl處理中，不同基因型稻米間Mn含量差異顯著，在‘HH 11’和‘JX 99’中，稻米中Mn含量在不同的NaCl處理間均具有顯著差異?！甕SXD’、‘TXZ’和‘XZ 3’稻米中TF含量分別在不同NaCl處理間差異均不顯著。

2.2 NaCl脅迫對稻米中抗氧化物質含量的影響

由表5可知，AsA、IP6、TF和AnC含量在不同基因型稻米間差異顯著。除0.5、1.0和3.5 g/kg NaCl處理中‘HH 12’的AsA含量低于‘XZ 3’和‘HH 11’外，在其他NaCl處理中都是最高的?！甁X 99’稻米中IP6含量除了在1.5 g/kg的NaCl處理高于‘TXZ’，在其他NaCl處理中均顯著低于其他基因型稻米。‘HH 11’、‘HH 12’和‘JX 99’中TF含量均顯著高于其他3個基因型?！甁X 99’和‘XZ 3’的稻米中TF的含量隨著NaCl濃度的增加而呈上升趨勢；‘HH 11’和‘HH 12’的稻米中TF含量分別在3.5和2.5 g/kg NaCl處理達到最大值；而‘YSXD’和‘TXZ’的稻米中TF含量最大值分別在0.5和1.5 g/kg NaCl處理中。隨著NaCl濃度的增加，‘JX 99’的稻米中AnC含量呈上升趨勢；‘HH 11’和‘HH 12’的稻米中AnC累積含量達到最大值分別在2.5和3.0 g/kg NaCl處理中。

表3 NaCl脅迫下稻米中抗氧化物質的簡單效應
Table 3 Simple effects of antioxidant substances in rice under NaCl stress

變量效應Effect of variable抗壞血酸 Ascorbic acid植酸 Phytic acid總黃酮 Total flavonoids均方Mean squareF均方Mean squareF均方Mean squareFGWT(0)57.27450.04**6.2174.20**40.97157.88**GWT(0.5)126.71995.62**5.2562.76**44.03169.67**GWT(1.0)180.851 421.08**6.9883.38**55.43213.60**GWT(1.5)240.821 892.30**3.5442.32**60.20231.98**GWT(2.0)31.04243.88**6.3676.00**71.92277.12**GWT(2.5)26.80210.59**6.5578.22**79.12304.88**GWT(3.0)45.52357.66**5.1961.95**81.45313.84**GWT(3.5)38.18299.96**4.3351.67**93.91361.86**GWT(4.0)76.57601.69**2.3327.86**93.95362.03**TWG(HH11)28.23221.79**1.0312.33**6.6325.56**TWG(HH12)90.78713.31**2.5530.50**4.6517.90**TWG(JX99)24.00188.62**0.677.98**6.5525.23**TWG(YSXD)20.77163.20**7.1585.46**0.411.59TWG(TXZ)12.0394.54**3.5742.64**0.160.61TWG(XZ3)128.801 012.08**3.8546.04**0.130.52

注：GWT表示土壤中NaCl含量；TWG表示稻基因型。下同。

Note: GWT indicates NaCl content in soil；TWG indicates rice genotype. The same below.

2.3 NaCl脅迫下稻米中抗氧化物質與礦質元素含量的典型相關分析和典型冗余分析

對稻米中礦質元素和抗氧化物質的含量進行典型相關分析，結果表明第Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ對典型相關變量無統(tǒng)計學意義，見表6。第Ⅰ對典型相關變量(

U

，

V

)系數為

λ

=0.546(

P

<0.01)，其表達式為：

U

=-0

.

068

X

-0

.

623

X

+0

.

376

X

+ 0

.

067

X

-0

.

617

X

+0

.

025

X

V

=0

.

419

Y

+0

.

720

Y

-0

.

157

Y

-0

.

174

Y

式中：

X

、

X

、

X

、

X

、

X

和

X

分別為稻米中P、Zn、Fe、Mg、Se和Mn的含量；

Y

、

Y

、

Y

和

Y

分別表示AsA、IP6、AnC和TF的含量。在這一對典型變量(

U

，

V

)構成中，

U

以

X

(Zn)、

X

(Fe)和

X

(Se)的權重系數較大，

V

以

Y

(AsA)和

Y

(IP6)的權重系數較大。這一線性組合說明，在一定范圍內，隨著稻米中Zn和Se含量的降低，Fe含量的上升，稻米中AsA和IP6含量呈上升趨勢。

由表7可知，第Ⅰ對典型變量解釋了抗氧化物質指標自身變異的39.1%以及礦質元素指標自身變異的20.2%。冗余指數表明，抗氧化物質的第Ⅰ對典型變量能解釋礦質元素指標總變異的11.7%，而礦質元素則解釋了抗氧化物質總變異的6.0%。

3 討 論

3.1 稻米抗氧化物質含量在不同基因型和NaCl處理間的差異

在NaCl脅迫下，育種工作者若能合理利用不同基因型稻米中抗氧化物質和礦質元素含量表現出來的差異，則可為選育耐鹽性強的水稻品種和鹽堿地改良利用提供參考。AsA作為雙加氧酶的輔酶可以調節(jié)鐵蛋白介導的鐵吸收和釋放，參與抗氧化過程。周小華等研究發(fā)現，AsA通過調控抗氧化酶活性，提高滲透調節(jié)物質和抗氧化物質含量來降低HO的累積，從而緩解鋁脅迫下水稻質膜的過氧化程度，增強水稻的抗鋁性能。張啟雷等報道用甲基紫精和高光誘導的光氧化脅迫處理的水稻葉片中，AsA含量高的抗壞血酸合成關鍵酶

GLDH

基因超表達株系‘GO-2’比干涉株系‘GI-2’具有更強的抗氧化脅迫能力，從而說明了內源AsA能顯著增強水稻抗氧化能力。本試驗中，在9個NaCl處理中，稻米中AsA含量在6個基因型水稻中表現出極顯著差異，主要表現為在各個NaCl處理中，‘HH 12’的AsA含量比同一處理下含量最低的基因型稻米分別高115%、219%、206%、566%、105%、158%、310%、75%和260%，所以‘HH 12’可作為選育高AsA含量的種質資源。

表6 NaCl脅迫下稻米抗氧化物質和礦質元素含量之間的顯著性檢驗
Table 6 Significance test of antioxidant substances and mineral elements contents in rice under NaCl stress

4對典型變量的編號Four pairs of canonicalvariable numbers典型相關系數(λ)Correlations特征值eigenvalueWilks統(tǒng)計量Wilk’sF顯著性SignificanceⅠ0.546 **0.4260.5551.9060.008Ⅱ0.3600.1490.7911.1740.294Ⅲ0.2650.0760.9090.8910.526Ⅳ0.1490.0230.9780.5600.643

表7 NaCl脅迫下稻米抗氧化物質和礦質元素含量的典型冗余分析
Table 7 Canonical redundancy analysis of antioxidant substances and mineral elements contents in rice under NaCl stress

4對典型變量的編號Four pairs of canonicalvariable numbers抗氧化物質Antioxidant substances礦質元素Mineral elements組內Within groups組間Between groups組內Within groups組間Between groupsⅠ0.3910.1170.2020.060Ⅱ0.2210.0290.2150.028Ⅲ0.2000.0140.1500.011Ⅳ0.1880.0040.1440.003

IP6具有很強的抗氧化能力和螯合能力。但也有研究表明，籽?？寡趸脚c籽粒活力呈正相關，與植酸含量無相關關系。稻米中IP6長期被人們看作抗營養(yǎng)物質，對稻米中Zn、Fe等礦質元素含量和生物有效性產生負面影響，高IP6含量的稻米容易使長期食用的人群產生“隱形饑餓”的隱患。本試驗中，在9個NaCl濃度處理后，‘JX 99’稻米中IP6含量分別比同一NaCl處理下含量最高的基因型稻米低80%、77%、86%、59%、92%、85%、84%、85%和72%，所以在選育低IP6含量的種質資源中‘JX99’相對于其他基因型水稻更好。

孫玲等和陳萍萍等等研究表明，有色稻稻米的總抗氧化能力和羥自由基清除能力與花色苷和類黃酮含量之間均呈極顯著正相關，且有色稻的種皮顏色越深，其抗氧化作用越強。本試驗中，‘HH 11’、‘HH 12’和‘JX 99’3個基因型紅米中TF含量顯著高于其他3個白米基因型秈稻?！甁X 99’的稻米中AnC含量隨著NaCl處理濃度的增加而增加，相對于‘HH 11’和‘HH 12’更具有緩解NaCl脅迫傷害的潛能。

3.2 NaCl脅迫下稻米中抗氧化物質和礦質元素含量的變化

抗氧化物質和礦質元素之間存在錯綜復雜的關聯性。已有研究發(fā)現，外源高P處理可能對水稻穗部的Zn、Fe等礦質元素的轉運和累積有一定程度的“阻礙”效應，會誘發(fā)稻米中Zn含量的降低及其生物有效性的下降，甚至出現“高磷促進缺鋅”現象。Iwai等的研究表明在水稻種子發(fā)育的過程中，從源器官轉運過來的P會直接轉化為IP6并迅速在糊粉層細胞中累積，而Zn與IP6的結合松散，多分布在糊粉層至內胚乳中。Persson等通過測定大麥籽粒中的Fe、Zn、P和S的形態(tài)，提出Zn主要與多肽結合，而Fe主要與IP6結合。孫鵬堯等試驗結果表明，降低AnC的穩(wěn)定性有兩種情形，一是Fe會與花青素類物質形成絡合物，二是高含量的AsA會被Fe氧化產生HO從而破壞AnC的穩(wěn)定性。在土壤低P情況下，P抑制了植株對Se的吸收，而在高P條件下，P促進植株對Se的吸收。Pu等研究表明對于大多數有色稻、有色小麥和有色馬鈴薯等作物而言，有色品種比同一作物的白色品種有更高的Se和AnC含量的累積，在有色品種中高含量的Se都有高含量的AnC，且Se含量的累積會隨著作物成熟階段著色逐步加深而增加。本研究結果表明，在一定范圍內，隨著稻米中Zn和Se含量的降低，Fe含量的上升，稻米中AsA和IP6含量呈上升趨勢。這一結果可能是因為在NaCl脅迫下，水稻稻米成熟的過程中，從“源”運來的P快速轉化為IP6，使得IP6含量增加，同時由于Fe含量在稻米中的增加，一部分Fe會被IP6螯合，還有一部分Fe會在受脅迫后被產生的部分活性氧(ROS)氧化成Fe，此時稻米中高含量的AsA也會被Fe氧化生成HO等產物，在新形成的Fe和氧自由基的作用下，稻米中AnC的穩(wěn)定性被破壞，導致AnC含量的下降，從而引起了稻米中Se含量的降低，而稻米中Zn含量的下降可能是受到P的“阻礙”效應。

4 結 論

在9個不同 NaCl處理(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 g/kg)下，6個基因型稻米中花青素的含量受到基因型和NaCl處理間相互獨立作用的影響；抗壞血酸和植酸含量在不同基因型稻米中差異顯著；P、Zn、Fe和Se的含量在互作效應上均達到顯著差異，而稻米中Mg含量的累積在基因型和NaCl處理間均無顯著影響。除Mg外，P、Zn、Fe、Se和Mn的含量在不同NaCl濃度處理間均差異顯著。在基因型和不同NaCl處理的互作效應下，稻米中Fe的含量分別與抗壞血酸和植酸含量呈顯著正相關，而Zn和Se的含量分別與抗壞血酸和植酸含量呈顯著負相關。