謝意通，張飛，石潔，馮莉，姜麗

外源蔗糖對紫背天葵采后品質(zhì)及葉綠體的影響

謝意通，張飛，石潔，馮莉，姜麗*

南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，南京 210095

【背景】紫背天葵采后生理代謝活躍，加上對低溫敏感，采后往往貯藏于略低于室溫的黑暗環(huán)境中，但紫背天葵長期黑暗貯藏，會出現(xiàn)采后糖饑餓，影響紫背天葵的品質(zhì)。黑暗貯藏也會抑制光合過程，導致光合同化產(chǎn)物減少，加劇采后糖饑餓，而蔗糖是植物體內(nèi)光合產(chǎn)物運輸?shù)闹饕问?。【目的】研究采后外源蔗糖處理對紫背天葵采后品質(zhì)、蔗糖代謝及葉綠體的影響，探討蔗糖處理延緩采后衰老的相關(guān)機制?！痉椒ā吭诤Y選出最佳蔗糖處理濃度的基礎(chǔ)上，檢測紫背天葵貯藏期間淀粉、可溶性糖、還原糖、可溶性蛋白和葉綠素含量，研究蔗糖處理對紫背天葵采后品質(zhì)的影響；檢測貯藏期間蔗糖、果糖、葡萄糖含量和蔗糖代謝相關(guān)酶活性如淀粉酶（Amylase）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖酸性水解酶（AI）、蔗糖合成酶（SS-s）和蔗糖分解酶（SS-c），研究蔗糖處理對紫背天葵蔗糖代謝的影響；利用透射電子顯微鏡觀測葉綠體超微結(jié)構(gòu)在貯藏期間的變化，檢測貯藏期間葉綠體脂氧合酶（LOX）活性、丙二醛含量（MDA）、最大光化學效率（Fv/Fm）和實際光化學效率（QY），研究蔗糖處理對葉綠體生理和功能的影響。在生化水平和亞細胞水平上探究采后蔗糖處理對紫背天葵的影響。【結(jié)果】前期的蔗糖濃度篩選發(fā)現(xiàn)，12%的蔗糖保鮮效果最佳，尤其在貯藏后期，12%蔗糖處理組與對照組相比，呼吸強度降低39%、失重率降低7.8%、腐爛率降低15.87%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在貯藏后期，處理組與對照組相比，蔗糖含量比為1.82、淀粉含量比為1.10、可溶性糖含量比為1.11、可溶性蛋白含量比為2.20和葉綠素含量比為1.23，蔗糖處理顯著延緩了糖類物質(zhì)和含氮物質(zhì)的降解。蔗糖處理顯著抑制SPS、AI和Amylase活性的上升，說明蔗糖處理抑制了紫背天葵的蔗糖代謝，從而減少了蔗糖和淀粉的分解。后期對紫背天葵葉綠體生理功能研究發(fā)現(xiàn)，貯藏結(jié)束時，處理組與對照組相比，有效維持了葉綠體結(jié)構(gòu)完整性、葉綠體脂氧合酶活性降低53.13%、葉綠體丙二醛含量降低33.33%、最大和實際光化學效率分別是對照組的1.35倍和1.97倍，說明蔗糖處理顯著延緩葉綠體衰老。進一步分析發(fā)現(xiàn)，紫背天葵葉綠體功能與淀粉和可溶性糖含量顯著正相關(guān)，表明糖饑餓引起的碳源匱乏會影響葉綠體功能?！窘Y(jié)論】蔗糖處理通過降低紫背天葵采后呼吸強度、失重率和腐爛率、調(diào)控蔗糖代謝、降低葉綠體膜脂氧化程度和維持葉綠體結(jié)構(gòu)完整，抑制了紫背天葵采后品質(zhì)劣變，從而延緩了紫背天葵衰老。

蔗糖代謝；葉綠體；糖饑餓；紫背天葵；保鮮

0 引言

【研究意義】紫背天葵（D.C），又名觀音菜、沖繩菠菜等，性喜溫[1]。紫背天葵是一種藥食同源的高檔蔬菜，富含營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的食用以及研究價值。由于紫背天葵采后的代謝旺盛，極易失水萎蔫和腐爛，因此保鮮極為需要。紫背天葵在采后階段，為了減少強光帶來的蒸騰效應(yīng)和抑制呼吸作用，往往貯藏于弱光或黑暗環(huán)境，但長期處于黑暗環(huán)境，其自身糖類物質(zhì)逐漸匱乏而發(fā)生糖饑餓，會引起其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)、葉綠素的分解周轉(zhuǎn)，從而加速衰老[2-3]。因此，研究紫背天葵采后糖饑餓影響品質(zhì)變化的規(guī)律以及探索延緩采后糖饑餓的保鮮方法具有積極的意義。【前人研究進展】近些年，關(guān)于紫背天葵采后生理和保鮮的研究愈來愈多，如紫外線C（UV-C）照射[4]、1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）[5]和一氧化氮（NO）熏蒸[6]以及納米包裝氣調(diào)等[7]，但都沒有與采后糖饑餓的結(jié)合研究。目前，關(guān)于采后糖饑餓引發(fā)衰老的相關(guān)研究還鮮有報道，國內(nèi)外對糖饑餓的相關(guān)研究主要集中在動植物的生長發(fā)育階段[8-9]和細胞水平[10]。植物中糖饑餓的誘導因素主要有弱光、極端溫度、干旱以及澇害等非生物脅迫[11-12]。這些脅迫的共同特點是破壞葉綠體，即通過破壞光合功能，影響糖類物質(zhì)的生成，進而誘發(fā)細胞自噬相關(guān)基因（）和衰老基因（）的表達，調(diào)控周轉(zhuǎn)葉綠體內(nèi)的含氮物質(zhì)（如葉綠素和蛋白質(zhì)等）來響應(yīng)機體內(nèi)的低碳環(huán)境[13]。Izumi等[14]研究發(fā)現(xiàn)水稻葉片在黑暗處理后，葉綠體自噬周轉(zhuǎn)過程和碳源狀態(tài)高度相關(guān)，而不是氮源狀態(tài)，揭示葉綠體的自噬周轉(zhuǎn)是由碳源匱乏誘導。IZUMI等[15]后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)外源添加蔗糖可以減少黑暗環(huán)境中自噬小泡的生成，證實在碳源匱乏狀態(tài)下添加外源蔗糖可以抑制葉綠體自噬，暗示蔗糖對延緩糖饑餓有一定作用。姚笛[16]通過研究不同可溶性糖浸泡青花菜，發(fā)現(xiàn)蔗糖處理可以減緩青花菜葉綠素以及營養(yǎng)物質(zhì)的降解?！颈狙芯壳腥朦c】蔗糖往往被當作營養(yǎng)液應(yīng)用于花卉的扦插培養(yǎng)，而用于農(nóng)產(chǎn)品采后保鮮的研究較少，外源碳源如蔗糖的處理是否可以延緩蔬菜采后衰老以及維持采后貯藏較高的碳源狀態(tài)還鮮有研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】在采后利用蔗糖處理紫背天葵，研究蔗糖處理影響紫背天葵采后生理代謝和品質(zhì)變化的規(guī)律，探討蔗糖是否對紫背天葵采后衰老有抑制作用，為生產(chǎn)實踐中的保鮮提供新方向。

1 材料與方法

試驗于2020—2021年在南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院進行。

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 紫背天葵，商品成熟度，于2020年11月采摘于蘇州潤匯農(nóng)業(yè)基地，要求生理相近、無機械損傷和蟲害，當天冰溫運回實驗室。

1.1.2 試劑 5尿苷二磷酸鈉鹽（UDP）、果糖6磷酸二鈉（F-6-P）、尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）均為生物試劑，源葉生物科技有限公司；蔗糖、果糖以及葡萄糖為色譜純，源葉生物科技有限公司；浸泡用蔗糖以及其余所有試劑均為國產(chǎn)分析純，壽德試驗器材有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Alpha1860A紫外可見分光光度計，上海譜元有限公司；IMAGINGPAM葉綠素熒光檢測儀，德國WALZ公司；Hitachi H7650透射電子顯微鏡，日本日立公司；島津LC-20A高效液相ELSD檢測系統(tǒng)（HPLCELSD），日本Shimadzu公司；H1750R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；FE30電導率儀，梅特勒托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同蔗糖濃度處理方法 將新鮮的紫背天葵分別用0（蒸餾水）、4%、8%、12%和16%的蔗糖濃度進行浸泡處理，具體處理方式如下：將30株（約300 g）生理相近的植株作為一捆（底部預(yù)留3 cm左右的基部用于浸泡），分別浸泡于50 mL不同濃度蔗糖溶液中，用5號自封袋作為處理容器，輕柔扎緊袋口，于40 L泡沫箱暗置密封12 h，箱內(nèi)放置0.1% KOH用于吸收CO2。處理完成后隨機選取4捆分裝于8 L左右的黑色PE塑料袋（用牙簽在塑料袋表面均勻戳20個小洞）并挽口，每個處理各3袋，黑暗貯藏于（20±2）℃、濕度（90±5）%環(huán)境下，分別于第-1、0、1、3、5和7天取樣（其中-1天指采摘樣品當天，0 d代表蔗糖處理完當天，如無特殊說明，本研究指標測定所用材料均為第0、1、3、5和7天取樣樣品），選取去除頂部幼芽后由上往下數(shù)第3、4片葉作為研究材料。

1.2.2 蔗糖濃度的篩選 在第0、1、3和5天分別測定樣品的呼吸速率[17]、失重率采用差重法、相對電導率[18]、腐爛率[19]，用于評價不同濃度蔗糖的處理效果，選出最佳處理濃度后，用該濃度進行后續(xù)的研究。

1.2.3 相關(guān)糖類物質(zhì)與可溶性蛋白的檢測 淀粉采用酸水解法；可溶性糖采用蒽酮比色法；還原糖采用3, 5二硝基水楊酸法；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍染色法；以上4個方法均參考曹建康等[20]方法。

葡萄糖、果糖和蔗糖參考高效液相色譜法[21]并稍作修改。1 g樣品用4 mL 80%乙醇50℃ 100 W超聲提取50 min，再80℃水浴1 h，冷卻至室溫后4℃、12 000×離心20 min，收集上清，過0.45 μm濾膜備用。色譜條件為：流動相為70%乙腈，色譜柱為ZORBAX Carbohydrate（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為35℃；檢測條件：檢測器為ELSD，流速為1 mL?min-1，進樣量為20 μL，氮氣壓力為350 kPa，漂移管溫度為50℃。

1.2.4 蔗糖代謝相關(guān)酶檢測 取2 g樣品，加入5 mL 100 mmol?L-1Tris（pH 7.2）提取緩沖液（含2 mmol?L-1EDTA、5 mmol?L-1MgCl2、5 mmol?L-1DTT、2%（v/v）乙二醇、0.2%（w/v）BSA和2%（w/v）PVP）渦旋混勻，于4℃下提取10 min，10 000×、4℃離心20 min。收集上清液，用100倍體積上清液的透析液（含1 mmol?L-1EDTA、2.5 mmol?L-1MgCl2、1 mmol?L-1DTT和1%（v/v）乙二醇）于4℃透析24 h，期間多次更換透析液。透析后的提取液保存于4℃，用于酶活性檢測，其中蔗糖磷酸合成酶（sucrosephosphate synthase，SPS）、蔗糖酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase，AI）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，包括合成方向SS-S和分解方向SS-C）的活性采用WU等[22]的方法，用葡萄糖作標準曲線，總酶活定義為每mg可溶性蛋白單位時間生成或消耗的葡萄糖含量（mg），單位為U?mg-1protein?？偟矸勖福ˋmylase）采用高俊鳳[23]的方法，其中總淀粉酶活性定義為每mg可溶性蛋白單位時間水解淀粉生成麥芽糖含量（mg），單位為U?mg-1protein，可溶性蛋白含量檢測方法與1.2.3一致。

1.2.5 葉綠體膜脂氧化

1.2.5.1 葉綠體提取 參考AUSTIN等[24]研究并稍作修改，取3 g樣品，加入10 mL預(yù)冷的緩沖液A（50 mmol?L-1Tris（pH 3.6），內(nèi)含25 mmol?L-1EDTANa2、1.25 mol?L-1NaCl、0.25 mol?L-1Vc、1.5%（w/v）PVP），振蕩，4℃靜置10 min，渦旋，400目尼龍布過濾，用玻棒擰干，用5 mL緩沖液A沖洗濾渣，再次擰干，500×、4℃離心5 min，收集上清，用緩沖液定容至10 mL，3 000×、4℃離心10 min，棄上清。加入10 mL緩沖液B（50 mmol?L-1Tris（pH 8.0），內(nèi)含25 mmol?L-1EDTANa2、1.25 mol?L-1NaCl、2.5 mmol?L-1DTT、0.1% BSA）振蕩，靜置5 min，渦旋，2 000×、4℃離心10 min，棄上清，再加10 mL緩沖液B重復(fù)操作。加入10 mL緩沖液C（50 mmol?L-1Tris（pH 8.0），內(nèi)含0.25 mol?L-1NaCl、20 mmol?L-1EDTANa2）振蕩，靜置5 min，渦旋，3 000×、4℃離心10 min，棄上清，再加3 mL緩沖液C重復(fù)操作，棄上清，最后用3 mL緩沖液C將葉綠體沉淀重懸后低溫保存。

1.2.6 葉綠體超微結(jié)構(gòu) 參考吳正鋒等[26]方法，選取第-1、3、5和7天的葉片，在葉片主葉脈兩側(cè)用刀片切取大小為4 mm×2 mm的組織塊，浸入2.5%（v/v）戊二醛溶液中，4℃初固定24 h以上，然后采用1%（w/v）的鋨酸溶液增加固定，用0.1 mol?L-1的磷酸緩沖液反復(fù)洗滌多次，固定后的樣品用梯度乙醇丙醇脫水（丙酮洗滌脫水），最后包埋在Spur環(huán)氧樹脂中。在超微切片機上切下超薄切片，用2.5%（w/v）乙酸鈾酰染色，隨后用檸檬酸染色后固定到銅網(wǎng)上，最后用透射電子顯微鏡以80 kV的加速電壓觀察、拍照。

1.2.7 葉綠素熒光 參考田雨等[27]方法，采用IMAGINGPAM葉綠素熒光檢測儀測定第-1、0、1、3、5和7天葉片的葉綠素熒光參數(shù)，每片葉片選取7個點，每個處理取20片獨立的葉片。葉片暗處理30 min后，測定葉片的初始熒光（F0）和最大熒光（Fm），計算最大光化學效率（FmF0）/Fm，即Fv/Fm。接著打開光化光，待熒光值穩(wěn)定后，測定葉片的穩(wěn)態(tài)熒光（Fs），最后打開飽和脈沖光，測定光適應(yīng)下的最大熒光產(chǎn)量（Fm'），計算實際光化學效率QY=（Fm'-Fs）/Fm'。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗均為3個生物學重復(fù)，利用SPSS 22.0進行單因素方差分析和t檢驗顯著性檢驗以及pearson相關(guān)性分析，測定結(jié)果用Mean±SD表示，同一時間組間差異顯著性通過字母標示法標示，不同字母表示差異顯著（＜0.05），并使用SigmaPlot 11.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度蔗糖處理紫背天葵的效果

經(jīng)過蔗糖處理后，紫背天葵在貯藏后期的呼吸強度都出現(xiàn)了上升。與對照對比，除了16%蔗糖處理，其他濃度的處理都先上升后下再上升，前期上升的原因可能是蔗糖為紫背天葵提供了外源碳源。其中12%的蔗糖處理后期上升最緩慢。16%的蔗糖處理使紫背天葵在前期的呼吸速率下降，后期則上升。

不同濃度蔗糖處理中，12%的蔗糖在貯藏后期保持紫背天葵水分的效果最好，但在前3 d天貯藏期間各處理間沒有顯著差異。與對照相比，各濃度的蔗糖處理都會使紫背天葵的細胞滲透率增加，但增加的程度并不與濃度成正相關(guān)，其中4%和16%蔗糖處理組的相對電導率增加程度最明顯，可能是低濃度和高濃度的蔗糖處理使紫背天葵處于脅迫狀態(tài)，誘發(fā)體內(nèi)膜脂的氧化。在各濃度處理中，12%的蔗糖處理可以明顯降低紫背天葵在貯藏期間的腐爛率（圖1）。綜上，12%蔗糖處理具有更好的保鮮作用，因此以該濃度開展下一步研究。

不同小寫字母代表顯著差異（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05).The same as below

2.2 蔗糖處理對紫背天葵淀粉、可溶性糖、還原糖和可溶性蛋白含量的影響

蔗糖處理可顯著延緩可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量在貯藏期間的下降（圖2）。對照組的可溶性糖含量和還原糖含量在處理當天到第1天的下降速度顯著大于蔗糖處理組，表明紫背天葵在早期暗貯藏期間消耗的儲備物質(zhì)較多，到了第3天略有上升，可能是由于淀粉的水解產(chǎn)生了較多的小分子可溶性糖。在貯藏的第3天和第5天，對照組的還原糖含量顯著高于蔗糖處理組，第7天時處理組的還原糖含量高于對照組。貯藏期間可溶性蛋白的變化可以反映蛋白質(zhì)的降解情況，從而可衡量機體的衰老程度[29]，對照組的可溶性蛋白含量在貯藏期間都低于蔗糖處理組，特別是貯藏后期，暗示對照組在貯藏期間由于碳源匱乏，加速了蛋白的分解利用。在貯藏第7天，處理組與對照組相比，淀粉含量比為1.09倍，可溶性糖含量比為1.1倍，還原糖含量比為1.8，可溶性蛋白含量比為2.2倍，因此，蔗糖處理可以顯著抑制紫背天葵糖類物質(zhì)和可溶性蛋白的降解。

2.3 蔗糖處理對紫背天葵蔗糖代謝的影響

2.3.1 對蔗糖合成的影響 SPS和SS-S作為蔗糖的主要合成酶，影響蔗糖的合成與代謝[30]。對照組的SPS活性在貯藏期間都高于蔗糖處理組，呈上升趨勢，而處理組在貯藏期間保持較為穩(wěn)定的活性（圖3）。處理組與對照組的SS-S活性在貯藏前期基本不變，而到貯藏后期，處理組與對照組均上升。在貯藏前3 d，SPS活性與蔗糖含量呈顯著正相關(guān)（=0.824，=0.044＜0.05），SS-S活性與蔗糖含量無顯著相關(guān)性（=0.258，=0.622＞0.05）；到了貯藏后期，SPS活性與蔗糖含量呈負相關(guān)（=-0.475，=0.341＞0.05），SS-S活性與蔗糖含量也呈負相關(guān)（=-0.437，=0.387＞0.05），但相關(guān)性均不顯著，暗示紫背天葵蔗糖含量在貯藏前期主要由SPS正調(diào)控，在貯藏后期則由SPS和SS-S共同負調(diào)控。淀粉酶（Amylase）將淀粉水解成小分子的糖類，進而生成蔗糖的合成前體物質(zhì)如UDPG和F-6-P，對照組的淀粉酶活性在貯藏后期，顯著高于處理組，淀粉酶活性與蔗糖含量呈顯著負相關(guān)（=-0.816，=0.038＜0.05），暗示處理組的紫背天葵在吸收外源蔗糖后，可以在貯藏后期保持較穩(wěn)定的蔗糖含量，從而抑制淀粉酶活性。

圖2 蔗糖處理對貯藏期間紫背天葵淀粉（A）、可溶性糖（B）、還原糖（C）和可溶性蛋白（D）含量的影響

圖3 蔗糖處理對紫背天葵蔗糖合成的影響

2.3.2 對蔗糖分解的影響 蔗糖的水解酶主要有SSC和AI，對碳源的轉(zhuǎn)運、分配利用和糖信號轉(zhuǎn)導有重要作用[31]。對照組和處理組的SSC活性在貯藏期間沒有顯著差異，到了貯藏后期，處理組和對照組的SSC活性稍微上升。蔗糖處理組的AI活性在貯藏第1天上升，第3天開始下降，貯藏后期活性緩慢上升；而對照組與處理組完全相反，對照組的AI活性在貯藏前期基本不變，到貯藏后期活性顯著上升（圖4）。葡萄糖與果糖含量在貯藏期間的變化趨勢基本一致，在貯藏前3 d，果糖含量與SS-C活性呈顯著正性相關(guān)（=0.852，=0.031＜0.05），與AI活性無顯著正相關(guān)性（=0.728，=0.101＞0.05）。但在貯藏后期，果糖含量與AI活性高度相關(guān)（=0.973，=0.027＜0.05），而與SS-C活性無顯著相關(guān)性（=-0.494，=0.506＞0.05）。暗示蔗糖的分解由SS-C和AI共同負責，兩者的主導作用與貯藏時期有關(guān)。

圖4 蔗糖處理對紫背天葵蔗糖分解的影響

2.4 蔗糖處理對紫背天葵葉綠體膜脂氧化和超微結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 葉綠體膜脂氧化 MDA是膜脂氧化的產(chǎn)物，其含量可以評價細胞的膜脂氧化程度[32]。由圖5可知，對照組和處理組的葉綠體MDA含量在貯藏期間都先上升后下降再緩慢上升，對照組葉綠體的MDA含量在貯藏期間均高于處理組，表明對照組的葉綠體在貯藏期間發(fā)生的膜脂氧化程度顯著高于處理組。LOX作為膜脂氧化的關(guān)鍵酶，和果蔬采后衰老具有密切關(guān)系。對照組的LOX活性在貯藏期間均高于處理組，且貯藏期間的活性變化與MDA含量變化極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)=0.81（＜0.01），表明葉綠體的膜脂氧化主要由LOX引起。說明對照組葉綠體的膜脂氧化高于處理組，證實蔗糖處理可以抑制葉綠體LOX活性，從而降低葉綠體的膜脂氧化程度。

圖5 紫背天葵葉綠體貯藏期間MDA（A）含量和LOX（B）活性變化

2.4.2 葉綠體超微結(jié)構(gòu) 處理前，紫背天葵的細胞壁清晰可見，細胞膜厚實光滑，葉綠體呈細長狀，類囊體膜清晰分明，噬餓顆粒和胞質(zhì)雜質(zhì)少。第3天時，對照組細胞出現(xiàn)了明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，基粒片層開始出現(xiàn)分離，胞質(zhì)中雜質(zhì)增加，而蔗糖處理則未出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，胞質(zhì)雜質(zhì)增加不明顯。第5天時，對照組的細胞膜出現(xiàn)褶皺并發(fā)生了斷裂，細胞膜變薄，葉綠體的膜結(jié)構(gòu)變得模糊，葉綠體形狀開始由細長狀變?yōu)闄E圓狀，胞質(zhì)雜質(zhì)與第3天相比變化不明顯，而處理組的細胞膜未出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，葉綠體膜結(jié)構(gòu)完整，噬餓顆粒稍微增多，胞質(zhì)雜質(zhì)變化仍舊不明顯。到貯藏第7天時，對照組的細胞膜已經(jīng)完全破裂，葉綠體出現(xiàn)空腔并開始崩解，胞質(zhì)雜質(zhì)明顯增多，葉綠體形狀變?yōu)榍驙睿欢幚斫M中葉綠體未出現(xiàn)明顯的崩解，但基粒片層發(fā)生卷曲，膜結(jié)構(gòu)變薄和模糊，胞質(zhì)雜質(zhì)開始增多。以上證實了蔗糖處理可以延緩葉綠體結(jié)構(gòu)的改變和葉綠體的崩解（圖6）。

2.4.3 葉綠體功能與葉綠素熒光 實際光化學效率和最大光化學效率可以反映植物光合能力的強弱，從而表征葉綠體的能力，研究紫背天葵在貯藏期間葉片光化學效率的變化，可以反映植株在貯藏期間的衰老程度。從圖7可見，蔗糖處理可以顯著抑制紫背天葵在貯藏期間光合能力的下降，維持紫背天葵葉綠體的正常功能，證實蔗糖處理可以延緩紫背天葵葉綠體的衰老。紫背天葵總?cè)~綠素含量的變化趨勢與實際光化學效率變化基本一致，兩者具有顯著正相關(guān)（=0.911，=0.002＜0.01），證實葉綠體的光化學效率變化與葉綠素降解有關(guān)。NPQ表征葉綠素分子在捕獲光能后以熱能形式耗散多余光能部分，可以表征葉綠素含量和光合效率。從NPQ貯藏變化圖中可以看出，蔗糖處理可以顯著抑制貯藏期間耗散熱能的增加，保持較高的光化學效率，進而表征了葉綠體較好的生理功能。

2.4.4 葉綠體生理功能與脂氧合酶相關(guān)性分析 葉綠體實際光化學效率與淀粉、可溶性糖、還原糖、可溶性蛋白和葉綠素等物質(zhì)具有顯著或極顯著的正相關(guān)性，而與蔗糖單個小分子物質(zhì)不相關(guān)。葉綠體LOX則與實際光化學效率相反，LOX與蔗糖小分子物質(zhì)顯著負相關(guān)（表1）。因此，12%蔗糖處理紫背天葵可以顯著維持貯藏期間淀粉、可溶性糖、還原糖、可溶性蛋白和葉綠素等物質(zhì)的含量，進而維持葉綠體的生理功能，同時為紫背天葵提供外源蔗糖，在貯藏后期保持了較高的蔗糖含量，這對延緩葉綠體LOX活性的升高可能有一定的作用。

圖A為-1 d的葉綠體超微結(jié)構(gòu)，B、D、F分別為對照組3、5和7 d葉綠體超微結(jié)構(gòu)；C、E、G分別為處理組3、5和7 d葉綠體超微結(jié)構(gòu)。CP：葉綠體；CM：細胞膜；W：細胞壁；S：淀粉粒；O：噬鋨顆粒；GL：基粒片層；VS：基粒片層囊泡化

表1 紫背天葵實際光化學效率、LOX活性與相關(guān)糖類物質(zhì)、可溶性蛋白和葉綠素含量的相關(guān)性

**表示具有極顯著相關(guān)性（＜0.01）；*表示具有顯著相關(guān)性（＜0.05）

** represent extremely significant correlation (＜0.01), * represent extremely significant correlation (＜0.05)

3 討論

在采后貯藏期間，紫背天葵采前所積累的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗殆盡，加上葉綠體光合作用被抑制，組織細胞長期處于糖饑餓逆境中，細胞衰老的進程加快。

3.1 蔗糖延緩紫背天葵采后品質(zhì)劣變

12%蔗糖處理在貯藏前期的呼吸強度高于對照，但在貯藏后期顯著抑制呼吸強度的上升，特別是貯藏結(jié)束時，處理組的呼吸強度只有對照組的61%，這可能是貯藏前期蔗糖處理為紫背天葵提供了足夠的能量，從而使呼吸強度上升；也可能是蔗糖參與了信號轉(zhuǎn)導，讓機體啟動了抗逆的前期準備以適應(yīng)逆境脅迫，從而在貯藏后期保持較低的呼吸強度，減少了貯藏后期紫背天葵糖類物質(zhì)的消耗。在貯藏后期，處理組與對照組相比，淀粉含量、可溶性糖含量、還原糖含量、蔗糖含量和可溶性蛋白含量等保留明顯高于對照組，該結(jié)果與姜麗等[33]植酸處理結(jié)果相近，特別是糖類物質(zhì)，蔗糖處理的效果要優(yōu)于植酸。ARAúJO等[34]認為，植株在糖饑餓狀態(tài)下，蛋白質(zhì)可被降解成游離氨基酸作為糖類物質(zhì)的替代物。ONO等[35]通過基質(zhì)靶向熒光蛋白和熒光蛋白標記葉綠體蛋白，證實葉綠體蛋白的降解可通過一種包含小體（RCB）轉(zhuǎn)運到液泡中進行，該過程主要由調(diào)控[36]。當受損的葉綠體越多，葉綠體自噬過程被激活，相應(yīng)的表達水平提高，以精準地調(diào)控受損葉綠體的清除[37]，加速氮素的周轉(zhuǎn)利用。對照組在貯藏期間，由于糖類物質(zhì)消耗過快，紫背天葵的糖饑餓加重，加上葉綠體結(jié)構(gòu)受損比處理組嚴重，導致對照組的氮素周轉(zhuǎn)利用加劇，因此，非糖物質(zhì)如蛋白質(zhì)和葉綠素的降解更快，從而加速紫背天葵品質(zhì)劣變。蔗糖處理可顯著延緩含碳和含氮物質(zhì)的消耗，從而抑制了紫背天葵的衰老，但蔗糖參與碳源的分配調(diào)控機制以及碳源與氮源之間的轉(zhuǎn)導調(diào)控模式還有待研究。

圖7 蔗糖處理對紫背天葵最大光化學效率（A）和實際光化學效率QY（B）、非光化學淬滅NPQ（C）以及總?cè)~綠素含量（D）的影響

Fig.7 The effects of sucrose treatment on the maximum photochemical efficiency (A), QY (B), the change of NPQ (C) and Chlorophyll content (D) ofduring storage

3.2 外源蔗糖處理調(diào)控蔗糖代謝

蔗糖作為大多數(shù)光合作物同化產(chǎn)物的主要運輸和卸載形式，對植物的能量代謝具有重要影響，同時也是橋接淀粉和己糖的重要代謝樞紐[31]。本研究結(jié)果表明，貯藏前期SPS活性與蔗糖含量呈顯著正相關(guān)，但在貯藏后期呈負相關(guān)，暗示紫背天葵在蔗糖充足的環(huán)境下，SPS是蔗糖合成的正向調(diào)控酶，而在蔗糖消耗殆盡時，蔗糖的合成則由SPS和SS-S共同負調(diào)控，該結(jié)果與田夢瑤等[38]的研究不完全一致。處理組在貯藏期間的蔗糖合成酶均顯著低于對照組，可能是蔗糖處理為紫背天葵提供外源蔗糖，從而抑制了蔗糖合成酶的活性。BALIBREA等[39]發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因（）的過表達可以調(diào)控轉(zhuǎn)化酶活性的升高和延緩葉片的衰老。貯藏前期，對照組保持了較高的SPS活性和較低的AI活性，處理組則相反，暗示在蔗糖充足的情況下，上調(diào)了AI活性同時抑制了SPS活性，為抗逆做好了物質(zhì)上的準備，以延緩衰老進程。而對照組在貯藏第5天的AI活性顯著高于處理組，暗示對照組為了延緩衰老，在貯藏后期的逆境誘導下才上調(diào)了AI活性，這也解釋了為什么貯藏前期蔗糖的分解主要與SS-C活性高度相關(guān)，而在貯藏后期與AI活性高度相關(guān)。應(yīng)對糖饑餓逆境，12%蔗糖處理組和對照組對SPS與AI兩種截然不同的調(diào)控，暗示SPS和AI可能是響應(yīng)糖饑餓的關(guān)鍵酶，SS-S和SS-C可能主要負責平衡蔗糖正常的基礎(chǔ)代謝，并非參與逆境響應(yīng)的關(guān)鍵酶。BISWAL等[40]通過糖受體證實了蔗糖參與植株抗逆信號的轉(zhuǎn)導，因此，推測蔗糖也可能參與紫背天葵糖饑餓的信號轉(zhuǎn)導，但具體是調(diào)控上游基因表達還是調(diào)控SPS和AI的活性還不清楚，后續(xù)可深入研究蔗糖參與紫背天葵糖饑餓的轉(zhuǎn)導模式。鑒于蔗糖處理對紫背天葵響應(yīng)采后糖饑餓有積極作用，因此后續(xù)還可探究采前蔗糖處理的實際效果與可行性。

3.3 蔗糖延緩葉綠體衰老

根據(jù)表1的相關(guān)性分析，葉綠體的衰老和多種物質(zhì)的消耗高度相關(guān)，暗示大量物質(zhì)的消耗是引起葉綠體崩解周轉(zhuǎn)的主要原因。葉綠體作為葉片氮含量最高（富含二磷酸核酮糖羧化酶和葉綠素）的細胞器[41]，是細胞氮素周轉(zhuǎn)利用的首選對象[42]。目前關(guān)于葉綠體的周轉(zhuǎn)降解途徑主要有兩種，一種是通過液泡中的蛋白水解酶[43]，另一種是葉綠體自身水解酶和液泡中的蛋白水解酶共同參與作用[44]。有研究證明葉綠體蛋白的降解與葉綠體數(shù)量上的減少在時空上并不同步[45]，暗示葉綠體的崩解機制比較復(fù)雜。在糖饑餓逐漸加劇下，貯藏后期對照組的葉綠體崩解程度顯著高于處理組，且葉綠體LOX與蔗糖具有顯著負相關(guān)，暗示葉綠體的膜脂氧化可能與蔗糖的減少有關(guān)。趙曉幗等[46]與胡月等[47]研究發(fā)現(xiàn)蔗糖處理可以維持研究材料較高的過氧化物酶、超氧陰離子歧化酶和抗壞血酸過氧化物酶的活性，從而提高機體的抗氧化能力，說明蔗糖對降低膜脂氧化具有潛在的作用。在LOX與葉綠體實際光化學效率的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，LOX與實際光化學效率并無顯著的相關(guān)性，暗示葉綠體衰老并非由單個因素誘導，葉綠體的膜脂氧化可能只是其中的一個誘導因子[48]。蔗糖可通過抑制糖類物質(zhì)、含氮物質(zhì)的消耗與降低膜脂氧化來延緩葉綠體衰老，但蔗糖具體是如何參與調(diào)控的分子機制還有待研究。

根據(jù)以上的分析，簡單繪制了蔗糖處理延緩紫背天葵采后糖饑餓的機制，如圖8所示。

紅色/綠色表示蔗糖處理組與對照組相比，酶活性或者物質(zhì)含量顯著高于/低于對照組，白色代表處理組與對照組無顯著差異（P＜0.05）；虛線表示具體調(diào)控的方式或參與的形式還不確定

4 結(jié)論

蔗糖處理通過降低紫背天葵貯藏期間的呼吸強度、失重率和腐爛率，抑制蔗糖代謝，降低葉綠體膜脂氧化程度，維持葉綠體功能與結(jié)構(gòu)完整性，延緩了紫背天葵采后品質(zhì)的劣變和葉綠體衰老，減緩了采后糖饑餓對紫背天葵的影響。

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XIE YiTong, ZHANG Fei, SHI Jie, FENG Li, JIANG Li*

College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【Background】The physiological metabolism ofis active after harvest, and it is sensitive to low temperature.After harvest, it is often stored in a dark environment with slightly lower than room temperature.However, the long-term dark storage ofwill lead to sugar starvation, which affects the quality of.The dark storage also inhibits the photosynthetic process, resulting in reduced photosynthetic assimilation products and aggravated postharvest sugar starvation, and sucrose is the main form of photosynthetic product transport in plants.【Objective】The effects of exogenous sucrose treatment on postharvest quality, sucrose metabolism and chloroplast ofwere studied to explore the related mechanism of sucrose treatment on delaying postharvest senescence in this study.【Method】On the basis of screening out the optimal concentration, the contents of starch, soluble sugar, reducing sugar, soluble protein and chlorophyll induring storage were detected to study the effect of sucrose treatment on postharvest quality of.The contents of sucrose, fructose, glucose, and sucrose metabolism related enzyme activities, such as Amylase, SPS, AI, SS-s, and SS-c, were detected during storage, and then the effects of sucrose treatments on sucrose metabolism ofwas studied.The changes of chloroplast ultrastructure during storage were observed by TEM.The activity of LOX, the content of MDA, and the Fv/Fm and QY of chloroplast during storage were detected, then the effects of sucrose treatment on the physiology and function of chloroplast were studied.The effects of postharvest sucrose treatment onwere studied at biochemical and subcellular levels.【Result】The screening of sucrose concentration in the earlier study showed that 12% sucrose had the best preservation effect.Especially in the late storage period, compared with the control (distilled water treatment), the respiratory intensity, weightlessness rate, and decay rate of 12% sucrose treatment decreased by 39%, 7.8%, and 15.87%, respectively.Further study found that in the late storage, compared with the control, the treated sucrose content ratio was 1.82, starch content ratio was 1.10, soluble sugar content ratio was 1.11, soluble protein content ratio was 2.20, and chlorophyll content ratio was 1.23, indicating sucrose treatment significantly delayed the degradation of carbohydrates and nitrogenous substances.Sucrose treatment significantly inhibited the activities of SPS, AI and Amylase, indicating that sucrose treatment inhibited sucrose metabolism, thereby reducing the decomposition of sucrose and starch.In the later study on the physiological functions of chloroplasts of, it was found that at the end of storage, compared with the control, the treatedeffectively maintained the structural integrity of chloroplasts, reduced the activity of chloroplast LOX by 53.13%, and reduced the content of MDA by 33.33%.The Fv/Fm and QY were 1.35 and 1.97 times that of the control, respectively, indicating that sucrose treatment significantly delayed the senescence of chloroplasts.Further analysis showed that chloroplast function was positively correlated with starch and soluble sugar content, indicating that carbon source deficiency caused by sugar starvation could affect chloroplast function.【Conclusion】Sucrose treatment inhibited postharvest quality deterioration and chloroplast senescence ofby reducing respiratory intensity, weightlessness rate and decay rate, regulating sucrose metabolism, reducing the degree of chloroplast membrane lipid oxidation, and maintaining the integrity of chloroplast structure, thereby delaying the senescence of.

sucrose metabolism; chloroplast; sugar starvation;D.C; preservation

2021-07-09；

2021-10-09

國家自然科學基金（31301576）、江蘇省高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目（PAPD）

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（責任編輯 趙伶俐）