李波 張偉溪 丁密 余金金 丁昌俊 黃秦軍

(國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)，北京，100091)

蒙古櫟(Quercusmongolica)是殼斗科(Fagaceae)櫟屬樹種，極為耐寒，耐旱[1-3]。主要分布于我國東北地區(qū)、內(nèi)蒙古東部、北京、河北等地[4]，朝鮮半島、俄羅斯遠(yuǎn)東、蒙古及日本北海道等地亦有分布。蒙古櫟是我國主要用材樹種之一，且具有良好的生態(tài)利用價值[5]。蒙古櫟研究價值較高，是國家二級保護樹種。近年來其空間分布格局、群落結(jié)構(gòu)特征、生長形態(tài)特征等研究較多[6-9]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基于分子標(biāo)記技術(shù)對蒙古櫟遺傳多樣性的研究不斷深入，如張杰等[10]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)對蒙古櫟多種群遺傳多樣性進行研究，以期為蒙古櫟早期選擇提供合理依據(jù)；有學(xué)者通過采用SSR標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)中國東北長白山附近的遼東櫟種群是蒙古櫟的基因滲入的結(jié)果，證明了遼東櫟和蒙古櫟在該地區(qū)是有一定的歷史聯(lián)系[11]；有學(xué)者[12]利用SNP技術(shù)對蒙古櫟的遺傳多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳距離和空間距離之間沒有顯著相關(guān)性。

高通量測序技術(shù)的飛速進步，由1～6個核苷酸串聯(lián)重復(fù)的DNA序列的簡單序列重復(fù)(SSR)得到了廣泛的挖掘和開發(fā)。不同物種的EST序列和基因組等數(shù)據(jù)的飛速增加，使開發(fā)SSR引物的來源更加豐富。如貫春雨等[13]通過NCBI庫下載落葉松屬、黃杉屬、冷杉屬和松屬合計共EST序列40 608條，設(shè)計EST-SSR引物132對；楊青松和趙艷[14]基于川滇高山櫟(Quercusaquifolioides)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對其SSR位點分析，結(jié)果顯示，SSR類型主要為單核苷酸重復(fù)；石曉蒙等[15]通過利用櫟屬62對SSR引物，對栓皮櫟(Quercuspetraea)的遺傳多樣性進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中17對引物具有高多態(tài)性；孫靜靜[16]利用遼東櫟(Quercuswutaishansea)和蒙古櫟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)出92對引物，其中77對能在櫟屬槲櫟組(Quercusaliena)中成功擴增；Ueno et al.[17]以蒙古櫟內(nèi)側(cè)樹皮為試驗材料，構(gòu)建了cDNA庫，發(fā)現(xiàn)274個SSR位點。而通過蒙古櫟EST數(shù)據(jù)庫中開發(fā)SSR并對群體遺傳多樣性進行檢測的研究相對較少。本研究通過下載蒙古櫟EST序列及其葉綠體基因組，對其進行處理后查找SSR位點信息并進行特征分析，設(shè)計SSR引物后進行有效篩選，并對不同種源蒙古櫟群體進行遺傳變異分析，以期為蒙古櫟遺傳多樣性研究提供有效的分子標(biāo)記技術(shù)支持。

1 研究區(qū)概況

2018年收集8個不同種源的蒙古櫟種子，種植于遼寧省楊樹研究所苗圃地，2020年9月進行取樣。基本情況見表1。

表1 研究樣地基本概況

2 研究方法

2.1 DNA的提取

每個種源至少10株，選擇其新鮮、完整、無病害的葉片，采用TaKaRa公司DNA提取試劑盒提取蒙古櫟基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，提取基因組DNA于-20 ℃保存，用于后續(xù)PCR擴增。

2.2 EST序列的獲得及處理

在NCBI下載蒙古櫟EST序列和蒙古櫟葉綠體基因組(NC_043858.1)(截至至2019年8月27日)。利用perl腳本est-trimmer，僅用于去除EST序列中過短的序列(<100 bp)以及mRNA的“帽子”和“尾巴”(A或T)。下載CAP3對est-trimmer處理后的序列進行聚類和拼接，以獲得無冗余和盡可能長的重疊序列。CAP3的參數(shù)取默認(rèn)值，其中，折疊一致百分比域值N>80，重疊長度域值N>40。

2.3 SSR位點的查找

利用perl腳本misa程序(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)對CAP3拼接后的序列進行SSR位點搜索。SSR位點重復(fù)單元為單核苷酸、雙核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸，搜索標(biāo)準(zhǔn)分別對應(yīng)為，單核苷酸重復(fù)數(shù)至少為10；雙核苷酸重復(fù)數(shù)至少為6；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸為重復(fù)單位時，重復(fù)數(shù)均至少為5；以及中間間隔不超過100 bp的復(fù)合型SSR。

2.4 SSR引物的設(shè)計及篩選

基于Linux(版本bio-linux)Primer3批量設(shè)計引物，引物設(shè)計的主要參數(shù)為:SSR位點上下游100 bp之內(nèi)；引物長度18～23 bp，20 bp最佳；GC所占比例40%～60%;擴增產(chǎn)物預(yù)期片段為100～300 bp，上下游引物解鏈溫度Tm值差異不超過5 ℃。用Electronic PCR去除有多處比較的引物,保證引物擴增的特異性。

PCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)、DNA30～50 ng、正反引物各1.0、9.5 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 5 s；95 ℃變性30 s，最佳退火溫度45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2.5 SSR遺傳多樣性

基于選擇的引物進行合成，在樣品上進行擴增檢測。將所有樣品Index PCR擴增產(chǎn)物等量混合，并經(jīng)割膠回收獲得最終的FastTargetTM測序文庫，文庫的片段長度分布經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer驗證。文庫摩爾濃度精確定量后，最終于Illumina Hiseq平臺，以(2×150)bp與(2×250)bp的雙端測序模式進行高通量測序，獲得Fast Q數(shù)據(jù)。通過比對讀取片段和序列數(shù)據(jù)計算SSR等位基因的數(shù)量。兩步校正后列出了SSR基因序列和重復(fù)數(shù)，包括滑移調(diào)整和擴增效率調(diào)整。利用軟件GenALEX6.501計算等位基因數(shù)、期望雜合度、多態(tài)性信息含量等指標(biāo)，采用MEGA version5.0進行群體間UPGMA聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 蒙古櫟EST-SSR分布特點

下載的蒙古櫟3 385條EST序列，共1 855 072 bp，平均長度548.03 bp，平均GC含量45.90%。其經(jīng)est-trimmer和CAP3處理后得到418條無冗余EST序列，全長309 802 bp。共檢索出含有SSR位點的序列132條，SSR位點總數(shù)為163個；僅含有1個SSR位點的有103條，占78.03%；而含有1個以上SSR位點有29條序列，占21.97%。這些序列中含有18個重疊復(fù)合型SSR位點，占總SSR位點的11.04%。

3.2 蒙古櫟EST-SSR的類型和頻率

蒙古櫟EST序列中發(fā)現(xiàn)的SSR位點共有5種類型，如表2。其中處理后的EST序列未查找到五核苷酸類型的SSR位點。SSR位點的數(shù)量隨著核苷酸的數(shù)量呈現(xiàn)先增后減的趨勢。當(dāng)重復(fù)類型為二核苷酸的時候，SSR位點有80個，達(dá)到總SSR位點數(shù)的49.08%。而出現(xiàn)頻率最低的五核苷酸數(shù)量為0，其次就是六核苷酸僅占比0.61%。

表2 不同SSR重復(fù)類型的數(shù)量

在蒙古櫟的EST序列中，共發(fā)現(xiàn)19種SSR重復(fù)類型。單核苷酸僅有A與T一種，共有32個，占總SSR重復(fù)類型的19.632%。二核苷酸有4種類型，分別是AC與GT、AG與CT、AT與AT、CG與CG，其中AG與CT類型在整個SSR類型中出現(xiàn)頻率最多，數(shù)量為72個，占比為44.172%。三核苷酸有10種類型，主要是AAC與GTT、AAG與CTT、ACC與GGT、AGG與CCT這4種，而其它6種類型，合計15個，僅占9.201%。四核苷酸僅出現(xiàn)3種類型，AAAC與GTTT、AAAG與CTTT及ATCC與ATGG各出現(xiàn)2次，均占總SSR重復(fù)類型的1.227%。六核苷酸AAGCAG與CTGCTT僅出現(xiàn)1次，占總SSR重復(fù)類型的0.613%(表3)。

表3 主要SSR重復(fù)類型的比例

3.3 葉綠體基因組的SSR特點

下載的蒙古櫟葉綠體全基因組共161 194 bp，MISA位點查找SSR位點88個，平均1831.75出現(xiàn)1個SSR位點。88個位點中含有9個重疊復(fù)合型SSR位點，占10.230%。葉綠體基因組中SSR類型較為單一，僅有單核苷酸、二核苷酸及三核苷酸。而重復(fù)類型為單核苷酸，SSR位點有82個，達(dá)到葉綠體基因組總SSR位點數(shù)93.18%。二核苷酸重復(fù)類型有5個，三核苷酸所占比例極低，僅出現(xiàn)1個，占比1.136%。

從葉綠體基因組SSR的重復(fù)次數(shù)來看，重復(fù)10次和11次數(shù)量最多，分別為44個和20個；最多重復(fù)次數(shù)為15次，共2個。根據(jù)MISA查找發(fā)現(xiàn)共有4種SSR重復(fù)類型。單核苷酸A與T出現(xiàn)頻率最高，達(dá)81次，占SSR位點總數(shù)的92.045%；而單核苷酸C與G僅在重復(fù)次數(shù)為11次時，出現(xiàn)1個。二核苷酸中出現(xiàn)類型為AT與AT，在重復(fù)次數(shù)為5、6、7，分別為2個、2個、1個。三核苷酸AAT與ATT出現(xiàn)頻率極低，僅在重復(fù)6次時，出現(xiàn)1個(圖1)。

圖1 蒙古櫟葉綠體SSR的基序類型數(shù)量分布

3.4 蒙古櫟SSR引物設(shè)計及驗證

基于perl腳本，整合了MISA(查找SSR位點)、Primer3.0(批量設(shè)計引物)和Electronic PCR進行批量SSR引物設(shè)篩選計，利用EST序列共設(shè)計篩選出引物63對，占總的已鑒定出SSR位點的38.65%；葉綠體全基因組設(shè)計篩選30對引物，占總?cè)~綠體鑒定出SSR位點的34.09%(表4)。

對已設(shè)計出的引物，進行合成，并在來自不同種源的蒙古櫟種源進行PCR擴增驗證。PCR擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于EST序列設(shè)計的SSR引物在8份來源不同的DNA上均能擴增出單一條帶且擴增效果好，共12對，而擴增出至少6個清晰條帶的共有33對(如圖2)?；谌~綠體全基因組設(shè)計的SSR引物均能擴增出條帶且擴增清晰單一，共有13對引物，而能在8個種源DNA中擴增出至少6個清晰條帶的有19對。部分引物瓊脂糖凝膠電泳圖如。

3.5 驗證蒙古櫟SSR多態(tài)性檢測

基于上述篩選的結(jié)果合成6對引物，從前人對蒙古櫟SSR遺傳多樣性研究中挑選一對引物[18]進行合成。對8個種源群體DNA進行PCR擴增，用以檢測這8個種源群體的遺傳多樣性以及引物多態(tài)性，引物信息見表4。哈溫平衡檢測發(fā)現(xiàn)7個位點在8個種源蒙古櫟群體上均未偏離平衡(表5)。7對SSR引物在8個種源的蒙古櫟群體中共檢測到37對等位基因，這些位點的觀測等位基因數(shù)目為2.5(SH-21)～7.625(Qden05011)，平均每個位點有5.286個等位基因(Na)。有效等位基因(Ne)的變化范圍為1.637(SA-23)～5.118(SA-43)，平均有效等位基因數(shù)為3.643。從Shannon多樣性指數(shù)看，SH-21的值最小(I=0.64)，Qden05011的值最大(I=1.801)，平均Shannon多樣性指數(shù)為1.291。觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的變化范圍分別為0.315(SH-21)～0.847(SA-39)、0.381(SA-23)～0.799(Qden05011)，均值分別為0.605和0.622。多態(tài)性信息含量的變化范圍為0.371(SA-23)～0.893(SA-49)，均值為0.692，從多態(tài)性看，SA-39、SA-43、SA-49與Qden05011的多態(tài)性水平相差不大。

表4 多態(tài)性SSR引物信息

引物SA47、SA48、SA49分別對應(yīng)1～8、9～16、17～24。

引物SC24、SC25、SC26分別對應(yīng)1～8、9～16、17～24。

表5 7個SSR位點在蒙古櫟群體中的遺傳多樣性參數(shù)

8個種源蒙古櫟群體水平的遺傳多樣性見表6。不同種源群體的觀測等位基因(Na)和有效等位基因數(shù)(Ne)的變化范圍分別為4.571(M2和M66)～6(M63)、2.976(M67)～4.373(M63)，平均值分別為5.286和3.643。Shannon多樣性指數(shù)的均值為1.291，其中M2的值最小(I=1.107)，M68的值最大(I=1.495)。觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的變化范圍為0.546(M63)～0.698(M68)、0.538(M2)～0.71(M68)，無偏期望雜合度(UHe)的均值為0.66，其變化范圍為0.57(M2)～0.752(M68)。M66的固定指數(shù)(F)最大，為0.167，且其期望雜合度高于觀測雜合度，說明種源M66存在遺傳缺失現(xiàn)象。M11的固定指數(shù)最小，僅為-0.101，而它的期望雜合度低于觀測雜合度，說明該種源內(nèi)部個體間存在遺傳分化的現(xiàn)象。

根據(jù)等位基因數(shù)據(jù)計算其群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)、群體間近交系數(shù)(Fit)、群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)，見表7。群體內(nèi)近交系數(shù)的均值為0.025，SA-25位點的值最小，為-0.11，SH-21位點的值最大，為0.192；群體間近交系數(shù)的均值為0.168，SH-21位點的值最大，為0.382，而最小值為0.015(SA-23)；群體間遺傳分化系數(shù)的均值為0.147，變化范圍為0.056(SA-23)～0.279(SA-25)，說明蒙古櫟群體間具有中等水平的遺傳分化?；蛄鞯淖兓秶鸀?.647(SA-25)～2.264(Qden05011)，均值為1.933，說明蒙古櫟群體間存在較大的基因流，減弱了基因遺傳漂變的作用，群體間發(fā)生遺傳分化的程度有所減弱。

表6 蒙古櫟群體水平的遺傳多樣性參數(shù)

表7 蒙古櫟群體遺傳分化系數(shù)和基因流

對蒙古櫟群體的AMOVA分析結(jié)果(表8)表明：種源間的遺傳變異占10.216%，種群內(nèi)的變異占89.784%，與種源群體間遺傳分化系數(shù)相差不大，說明了蒙古櫟的遺傳多樣性主要是由種源群體內(nèi)的遺傳差異導(dǎo)致的。根據(jù)Nei’s遺傳距離構(gòu)建蒙古櫟不同種源的UPGMA聚類圖，見圖3。

圖3 蒙古櫟群體UPGMA遺傳距離聚類圖

8個種源的蒙古櫟可分為3類，第1類：M22、M52、M66和M68；第2類：M11和M63；第3類：M2和M67?？梢钥闯觯晒艡捣N源與地理位置可能存在較弱的相關(guān)性，對遺傳距離和地理距離進行Mantel檢驗，發(fā)現(xiàn)兩者沒有顯著相關(guān)性(R2=0.001 8，p=0.09)，結(jié)果表明：地理隔離不是導(dǎo)致蒙古櫟遺傳變異的主要因素。

表8 蒙古櫟種源群體的分子方差分析

4 結(jié)論與討論

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，SSR分子標(biāo)記的引物開發(fā)方法也隨之變多。費時費力構(gòu)建傳統(tǒng)文庫逐漸被新的技術(shù)方法取代，如通過改良文庫法，即構(gòu)建富集文庫測序開發(fā)SSR引物[19]；基于該物種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)或者通過簡化基因組測序進行開發(fā)SSR引物的研究越來越多[20-21]。而隨著數(shù)據(jù)庫EST和全基因組的增加，開發(fā)SSR引物也越來越方便，即通過下載數(shù)據(jù)庫中的EST序列，處理后通過軟件或腳本查找SSR位點信息，再使用引物設(shè)計軟件進行設(shè)計篩選引物[22-24]。

而SSR位點查找軟件或腳本，大多研究使用perl腳本MISA進行查找[24-26]。還有通過李強等[27]開發(fā)的本地SSR Hunter進行本地SSR位點搜索查找。但二者一般搜索標(biāo)準(zhǔn)不同，MISA一般設(shè)置條件為：單核苷酸為重復(fù)單位時，重復(fù)數(shù)至少為10；雙核苷酸為重復(fù)單位時，重復(fù)數(shù)至少為6；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸為重復(fù)單位時，重復(fù)數(shù)均至少為5。而本地軟件SSR Hunter的一般標(biāo)準(zhǔn)為：重復(fù)單位長度為2～6 bp，最少重復(fù)次數(shù)為5次。搜索標(biāo)準(zhǔn)因人而異，但是SSRHunter的不同之處在于，對單核苷酸重復(fù)位點不能進行查找，不能對中間間隔不超過100 bp的復(fù)合型SSR進行篩選，但是這款軟件查找位點信息可以給出位點上下游150 bp信息，便于逐一設(shè)計SSR引物。而MISA可通過perl腳本結(jié)合Primer3進行批量設(shè)計引物，顯然更快捷方便。

本研究通過SSR Hunter 1.3查找SSR位點175個，逐一設(shè)計篩選比對得到引物22對，在8份種源不同的模版上有效擴增達(dá)6份以上，且單一性良好、條帶清晰的有14對引物，達(dá)63.64%；而MISA查找位點163個，批量設(shè)計篩選引物63對，8份模版上有效擴增達(dá)6份以上，且單一性良好條帶清晰的有33對，占比52.38%。因為數(shù)據(jù)工作量的重復(fù)性和批量設(shè)計引物的需求，相比較MISA更方便。對比本研究結(jié)果，張元燕等[28]對4種櫟屬的SSR位點進行分析，序列處理采用的軟件及SSR位點查找標(biāo)準(zhǔn)的不一致，會導(dǎo)致有明顯差異。

通過從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載蒙古櫟EST序列，經(jīng)過處理組裝得到418條序列，全長309 802 bp，含有SSR位點有132條序列，SSR位點163個。而蒙古櫟葉綠體基因組全長161 194 bp，SSR位點88個。相比較其他物種，數(shù)據(jù)庫中蒙古櫟EST序列較少，可能與蒙古櫟研究較少有關(guān)。基于蒙古櫟EST序列發(fā)現(xiàn)的SSR類型，單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸較多，達(dá)到95%以上；而五核苷酸則沒有發(fā)現(xiàn)，六核苷酸重復(fù)類型僅占比0.61%。基于葉綠體基因組查找的SSR，僅存在單核苷酸，二核苷酸和三核苷酸，單核苷酸最多，88個SSR位點中出現(xiàn)82個單核苷酸位點。19種重復(fù)類型中，AG與CT和A與T，這二種類型占了總SSR重復(fù)類型的63%。二核苷酸AG與CT出現(xiàn)的比例最高，出現(xiàn)72次。這與王書珍等[29]的研究結(jié)果相似，二核苷酸最多，其次是單核苷酸。徐小彪等[30]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃EST-SSR中二核苷酸為主要類型，AG與CT出現(xiàn)次數(shù)最多，結(jié)果相似。在葉綠體基因組中，A與T出現(xiàn)比例最高，為81次。重復(fù)次數(shù)為10次和11次時，SSR位點出現(xiàn)最多。

設(shè)計合成的6對SSR引物，與前人研究的Qden05011引物相比較，在這8個種源群體上，SA-39、SA-43、SA-49與Qden05011的多態(tài)性水平一致，具有較高的多態(tài)性。有學(xué)者[31]利用9對SSR引物對蒙古櫟的多態(tài)性進行檢測，結(jié)果顯示其多態(tài)性信息含量的變化范圍為0.487 2～0.848 3，均值為0.723 7，孫靜靜[16]設(shè)計的SSR引物PIC的變化范圍為0.49～0.95，均值為0.83。本研究開發(fā)的6對SSR引物的多態(tài)性信息含量為0.371～0.893，均值大于0.5，說明了開發(fā)的SSR引物在蒙古櫟遺傳多樣性研究中起到的作用是顯著的。

7對引物在8個不同種源蒙古櫟上的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，每個SSR位點的平均等位基因數(shù)(Na)為3.643，Shannon多樣性指數(shù)(I)為1.291，平均期望雜合度(He)為0.622，平均多態(tài)性信息含量(PIC)為0.692。張杰[32]利用ISSR技術(shù)分析蒙古櫟的遺傳多樣性，結(jié)果為Na=1.451 8、Ne=1.305 9和I=0.254 6；陳罡等[33]利用10對SSR分子標(biāo)記對分布在遼寧省的蒙古櫟天然群體進行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，Na=7.3、I=1.270、He=0.624，這說明了蒙古櫟群體具有較高的遺傳變異和遺傳多樣性水平。對比櫟屬其他樹種，遼東櫟(Na=10.272 7、I=1.754 3、He=0.753 8)[34]、白櫟(Quercusfabri)(Na=5.41、He=0.542、I=1.151)[35]、短柄枹櫟(Quercusglandulifera)(Na=3.67、He=0.43、I=0.66)[36]、歐洲栓皮櫟(Quercusvariabilis)(He=0.65、Na=0.72)[37]，說明蒙古櫟存在較為豐富的遺傳多樣性，在櫟屬樹種中具有中等程度的遺傳多樣性。

種源間的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示：不同種源間存在一定的差異性，種源間存在遺傳缺失或種源內(nèi)部間個體間遺傳分化等現(xiàn)象。李文英等[38]采用AFLP技術(shù)分析蒙古櫟群體遺傳變異，發(fā)現(xiàn)蒙古櫟天然群體間存在一定程度的遺傳分化(Gst=0.077)，且存在一定的基因交流，Nm為5.99；李文英和顧萬春[39]利用等位酶分析蒙古櫟天然群體發(fā)現(xiàn)其群體間遺傳分化度Gst為0.107，群體內(nèi)變異量占89.27%，但其基因流Nm為2.08，處于較低水平；張杰等[10]利用ISSR分析蒙古櫟群體遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，種源內(nèi)的遺傳變異占總遺傳的73.43%，基因流Nm值較低，僅1.381 8；王越[18]利用SSR標(biāo)記分析蒙古櫟遺傳多樣性，結(jié)果顯示94.41%的遺傳多樣性存在于種群內(nèi)，基因流為4.222 1，蒙古櫟群組的遺傳分化程度處于中等水平；陳罡等[33]開發(fā)10對SSR引物對遼寧蒙古櫟8個天然群體分析發(fā)現(xiàn)，群體間遺傳分化系數(shù)為0.065 5，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，群體間存在的基因流達(dá)4.471。本研究發(fā)現(xiàn)蒙古櫟群體的基因流為1.933，處于較低的水平。其基因流較低的原因可能是風(fēng)媒傳粉的多年生蒙古櫟[40]，其種子主要依靠重力和小型嚙齒動物傳播，因而較大的地理隔離可能會導(dǎo)致種源群體間的低基因流；生境片段化亦會影響基因流的強度。弱基因流僅在一定程度上弱化種間的遺傳差異，減少群體間的遺傳差異，因而本研究發(fā)現(xiàn)F統(tǒng)計顯示群體間的遺傳分化系數(shù)僅為0.147，相對較高，且AMOVA分析也發(fā)現(xiàn)群體間的遺傳變異占10.216%，種源內(nèi)的變異占89.784%。相較其他櫟屬的研究，舒瑪櫟(Quercusshumardii)群體間變異貢獻率達(dá)到15.12%[41]、意大利卡拉布里亞的栓皮櫟13%的變異存在于群體間[9]、意大利南部栓皮櫟20%的遺傳變異存在于居群間[9]、大果櫟(Quercusmacrocarpa)3%的遺傳變異發(fā)生在居群間[9]、川滇高山櫟居群間的變異為8.9%[42]、槲櫟11.45%的變異是發(fā)生在群體間的[16]，蒙古櫟種源間分化水平處于中等水平程度。利用Mantel檢驗發(fā)現(xiàn)蒙古櫟遺傳距離和地理距離之間沒有顯著相關(guān)性，且根據(jù)聚類分析發(fā)現(xiàn)蒙古櫟群體并非按照地理位置聚類，這與李文英和顧萬春[39]的結(jié)果一致，同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在其他櫟屬樹木中，栓皮櫟[43]、麻櫟(Quercusacutissima)[44]、白櫟[45]等，這可能跟其自身遺傳特性相關(guān)，且生存環(huán)境變化有關(guān)。

采用不同SSR位點查找軟件，因其不同的搜索標(biāo)準(zhǔn)，可能產(chǎn)生的結(jié)果有所不同。在大量轉(zhuǎn)錄組或者數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)下，快速便捷的MISA結(jié)合Primer3、Electronic PCR批量設(shè)計并篩選去除有多處比較的引物，明顯更適合研究的需求?；诿晒艡狄阎狤ST數(shù)據(jù)庫進行處理查找SSR位點，發(fā)現(xiàn)二核苷酸和單核苷酸發(fā)生頻率最高，而葉綠體基因組中單核苷酸發(fā)生頻率最高。設(shè)計合成的93對引物，其中有52對引物能在多種源中有效擴增，為蒙古櫟遺傳多樣性研究和分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)，提供了構(gòu)建遺傳譜系的依據(jù)；基于7對SSR引物發(fā)現(xiàn)，蒙古櫟具有中等程度的分化水平，且主要的遺傳變異來源群體間，個體間存在遺傳分化或者缺失現(xiàn)象。蒙古櫟群體并非完全按照地理位置聚類，可能與其自身遺傳特性和生存環(huán)境變化有關(guān)。