梁林輝 杜翠華 梁大偉

摘要 川牛膝和懷牛膝為道地藥材，臨床使用廣泛，療效顯著，其成分三萜皂苷類、甾酮類、多糖類生物活性顯著，為其發(fā)揮藥效的主要物質?？偨Y國內(nèi)外公開發(fā)表的相關文獻，對川牛膝和懷牛膝中三萜皂苷類、甾酮類、多糖類成分的提取分離及含量測定研究進行綜述，以期為其有效成分進一步研究及開發(fā)提供參考。

關鍵詞 川牛膝;懷牛膝;化學成分;提取分離;含量測定

中圖分類號 R 284? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）09-0012-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.004

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

The Research Progress on Extraction and Determination Methods of Chemical Constituents in Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides

LIANG Lin-hui， DU Cui-hua， LIANG Da-wei

（Ya’an Polytechnic College， Ya’an， Sichuan 625000）

Abstract Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides are genuine crude drugs. It’s clinical application is extensive， and the activated ingredients are triterpenoid saponins， sterone compounds and polysaccharide. This paper summarizes the extraction and determination methods of chemical constituents in Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides， and provides a reference for its further development and utilization

Key words Cyathulae Radix;Achyranthis Bidentatae Radixpolysaccharides;Chemical constituent;Extraction;Determination

川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根，是川產(chǎn)道地藥材，主要產(chǎn)自雅安市天全縣、寶興縣、漢源縣以及樂山的金河口區(qū)，重慶、云南、貴州亦有分布;懷牛膝為河南省焦作市特產(chǎn)，是中國國家地理標志產(chǎn)品。它們具有逐瘀通經(jīng)、通利關節(jié)、利尿通淋的功能，用于經(jīng)閉癥瘕、胞衣不下、跌撲損傷、風濕痹痛、足痿筋攣、尿血血淋治療，臨床療效顯著?；瘜W成分主要有三萜皂苷類[1]、甾酮類[2]及多糖類[3]，有少量的生物堿、黃酮類等成分。近年來，關于川牛膝和懷牛膝的研究主要集中于化學成分鑒定及藥理學研究，其有效成分的提取、分離純化及含量測定研究較少，該研究從主要有效成分三萜皂苷類、甾酮類、多糖類的提取分離及含量測定方面進行綜述，以期為牛膝的進一步開發(fā)利用提供借鑒。

1 三萜皂苷

1.1 提取分離方法

三萜皂苷類化合物是川牛膝主要成分之一。羅懿釩等[4]綜述了牛膝中有效成分，發(fā)現(xiàn)39種三萜皂苷類化合物，其中7種為川牛膝中含有，主要為齊墩果酸型皂苷。王麗景[5]采用正交試驗考察了乙醇濃度、料液比、提前時間、提取次數(shù)等因素對牛膝中皂苷提取效果的影響，最優(yōu)工藝為乙醇濃度為80%、料液比1∶8、回流提取2次，每次3 h，牛膝總皂苷含量可達1.889 mg/mL，大孔樹脂吸附處理，含量可達60%。王俊等[6]分別以甲醇、乙醇為提取溶劑，比較超聲法、回流提取法和索氏提取法，發(fā)現(xiàn)乙醇提取效率明顯高于甲醇，超聲提取法與索氏提取法提取效率相當，均高于回流提取法。程永杰等[7]采用正交試驗法篩選出牛膝中總皂苷的最佳提取工藝為藥材10倍量的80%乙醇為溶劑，提取3次，每次1 h。柳立新等[8]比較了甲醇回流提取、乙醇回流提取、乙醚索氏提取除雜再用甲醇回流提取、水超聲提取和乙醇超聲提取5種方法，發(fā)現(xiàn)70%乙醇超聲提取和回流提取總皂苷的含量較高，分別為4.97%和4.75%。尚風琴[9]以70%乙醇為提取溶劑，料液比1∶10，比較了超聲法、回流法和浸漬法3種提取方法，結果顯示最佳提取方式順序為回流提取>浸漬提取>超聲提取，進一步正交試驗考察了乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)和提取時間4個因素，最優(yōu)提取工藝為采用90%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12，提取3次，每次1 h，川牛膝總皂苷含量達10.97 mg/g。目前針對川牛膝皂苷類化合物提取分離研究較少，通過上述文獻研究可知，川牛膝皂苷類化合物提取分離可采用乙醇回流提取法，通過有機溶劑萃取去除脂溶性成分，然后經(jīng)大孔樹脂進行分離純化，該方案簡單易行，且易于工業(yè)化。

1.2 含量測定方法

三萜皂苷類化合物含量檢測主要為紫外分光光度法和液相色譜法。衛(wèi)修來等[10]利用三萜總皂苷可與高氯酸-香草醛試劑顯色的原理，建立了紫外分光光度法測量牛膝總皂苷，以齊墩果酸為對照品，最大吸收波長為544 nm，該方法測得懷牛膝中總皂苷平均含量為6.24%;利用同一比色法方法，最大吸收波長為547 nm，柳立新等[8]測得土牛膝中總皂苷含量最高為4.97%。王麗景[5]選取最大吸收波長為527 nm，測定牛膝提取純化后總皂苷含量為60%，由于比色法所用的顯色劑專屬性較差，可能是造成最大吸收波長差異較大的原因。

歐麗蘭等[11-12]采用高效液相色譜法（HPLC）測定土牛膝中齊墩果酸含量、比較懷牛膝與川牛膝中皂苷含量的不同。尚風琴[9]建立了川牛膝總皂苷的HPLC-MS指紋圖譜，測得大孔樹脂富集后的川牛膝皂苷總提取物含量為52.5%。閆文靜等[13]采用HPLC-ELSD法較好地分離了兩種皂苷，并測定其含量。

2 甾酮

2.1 提取分離方法

川牛膝中甾酮類化合物多達13種，主要為杯莧甾酮及其類似物，是川牛膝發(fā)揮藥理作用的重要化學成分。2020版《中國藥典》規(guī)定，川牛膝中杯莧甾酮含量不得少于0.03%。王龍等[14]采用正交試驗法考察了水量、提取溫度、提取時間和次數(shù)3個因素對牛膝中甾酮的提取效率影響，最優(yōu)工藝為料液比1∶50，溫度50～100 ℃，提取2次，每次2 h，水煮提取物中蛻皮甾酮含量為9.30%。同時，還以水為溶劑提取牛膝總甾酮[15]，分別按料液比1∶20、1∶15水煎煮2次，每次2 h，提取液經(jīng)D型大孔樹脂處理，考察pH、吸附流速、洗脫液種類及用量對牛膝總甾酮的影響，在最優(yōu)分離條件下，D型大孔樹脂對牛膝甾酮的吸附量為28.9 mg/g，純化后的牛膝總甾酮含量達60%，蛻皮甾酮含量達10%。孟大利等[16-17]以乙醇為提取溶劑，采用回流提取法，經(jīng)大孔樹脂脫糖純化、系統(tǒng)溶劑萃取、硅膠色譜柱層析分離，得到漏蘆甾酮B、旌節(jié)花甾酮D和紅莧甾酮;林大專等[18]采用類似提取分離方法得到3種蛻皮甾酮。蒙漢富等[19]以甲醇或水為提取溶劑，采用正交試驗法考察了甲醇濃度、提取時間、提取次數(shù)、溶劑倍量4種因素，最佳提取工藝為60倍量30%甲醇超聲提取2次，每次1.5 h?？罪w飛等[20]采用回流提取法考察了乙醇濃度、溶劑倍量及提取時間3個因素對杯莧甾酮的提取效率影響，最優(yōu)提取工藝為用70%乙醇加熱回流提取2次，料液比分別為1∶12和1∶10，提取時間均為2 h。孫亮亮等[21]采用響應面分析法優(yōu)化了超聲法提取甾酮，以正丁醇水溶液為提取溶劑，考察了溶劑、料液比及提取時間對β-蛻皮甾酮提取效率的影響，最優(yōu)工藝為45%正丁醇溶液，料液比為1∶15，提取時間1.7 h。歐陽文等[22]采用甲醇回流提取3次，每次2 h，提取液濃縮后經(jīng)制備型ODS層析柱、硅膠柱層析分離得β-蛻皮箔酮、牛膝甾酮、水龍骨甾酮3種單體化合物。朱婷婷等[23]采用乙醇滲漉提取，濃縮液經(jīng)系統(tǒng)溶劑萃取、柱層析分離得25S-牛膝甾酮、25R-牛膝甾酮和β-牛膝甾酮單體化合物。

除了上述常規(guī)溶劑提取法外，鄭義哲[24]采用二氧化碳超臨界流體萃取法提取蛻皮甾酮，首先探索夾帶劑對提取蛻皮甾酮的影響，確定最優(yōu)工藝條件是以二甲亞砜為夾帶劑，壓力25 MPa、溫度70 ℃，夾帶劑流速0.5 mL/min，靜態(tài)萃取時間10 min，動態(tài)萃取時間1 h，二氧化碳流量2 L/min。

綜上可知，鑒于試驗條件及制備量的因素，川牛膝中甾酮類化合物可采用有機溶劑提取法，大孔樹脂分離純化，再結合有機溶劑（乙酸乙酯、正丁醇）萃取法可得到含量較高的甾酮類化合物，如分離單體化合物須經(jīng)多次層析分離等方法來實現(xiàn)。

2.2 含量測定方法

甾酮類與三萜皂苷具有相似的結構母核，可以采用香草醛-高氯酸比色法測量甾酮含量。王龍等[25]利用該方法，以β-蛻皮甾酮為對照，在最大吸收峰550 nm處，紫外分光光度法測得大孔樹脂富集后的牛膝提取物總甾酮含量為53.3%。劉姣等[26]以同樣的方法，采用最大吸收波長243 nm，測定懷牛膝中總甾酮含量為2.089%。

顯色法專屬性較差，目前甾酮類化合物含量檢測主要為高效液相色譜法。 胡亮等[27-28]采用反向色譜柱測定粗毛牛膝、野生牛膝和柳葉牛膝、杯莧甾酮含量。尚風琴[9]利用HPLC-MS法構建懷牛膝和川牛膝總甾酮指紋圖譜。川牛膝中甾酮類化合物主要為杯莧甾酮、羥基杯莧甾酮、森告甾酮等，2020版中國藥典規(guī)定了川牛膝中杯莧甾酮的檢測方法，采用HPLC法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為243 nm。

綜上可知，可利用HPLC法測定川牛膝甾酮類單體化合物的含量，該方法簡單，結果可靠。

3 多糖

3.1 提取分離方法

最新研究表明，川牛膝多糖類成分具有很好藥理活性。劉穎華等[29]采用水提醇沉法得川牛膝多糖粗品，經(jīng)陰離子交換樹脂和凝膠分離，得多糖純品，總收率為22.5%。趙磊等[30]以熱水為提取溶劑，經(jīng)氯仿萃取，濃縮后醇沉得到川牛膝粗多糖，考察提取時間、料液比、溫度、提取次數(shù)4種因素對多川牛膝粗多糖提取效率的影響，最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶15，提取溫度60 ℃，浸提時間2 h，提取1次，醇沉濃度85%，川牛膝多糖的收率為49.18%。侯劍萍等[31]采用水煎煮法提取粗多糖，經(jīng)脫蛋白、脫鹽和醇沉法純化，最佳提取純化工藝為料液比1∶10，提取3次，每次2 h，采用三氯乙酸（TCA）法脫蛋白，分子篩法脫鹽處理，80%乙醇沉淀。梁歌等[32]采同樣的水提醇沉法提取川牛膝粗多糖，通過正交試驗考察了提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度對多糖得率的影響，最佳提取工藝為提取溫度100 ℃，提取時間8 h，料液比1∶20，95%乙醇溶液。黃志芳等[33]采用75%乙醇回流提取，經(jīng)水提取、濃縮、醇沉，收集沉淀，再用三氯乙酸除去蛋白、醇沉、有機溶劑洗滌等步驟得到牛膝多糖，收率為7.2%，含量達12.85%。

劉傳敏等[34]采用酶解超聲法提取川牛膝多糖，正交試驗考察了酶解時間、酶用量、pH、酶解溫度對酶解效果的影響和樣品粒度、料液比、超聲時間、超聲次數(shù)對提取效果的影響。最佳工藝條件為酶解1 h，酶用量15 U/g，pH 5.0，酶解溫度50 ℃，粒度20目，料液比1∶40，超聲時間20 min。谷旭晗等[35]采用同樣的酶法提取川牛膝多糖，通過正交試驗確定最佳工藝條件為藥材粒徑550～830 μm、酶用量4 mg/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間90 min、溶劑pH為5.0、料液比1∶60，提取時間30 min，在此條件下，川牛膝多糖收率為71.7%。葉秀娟等[36]以復合酶解法進行提取，最佳提取工藝為料液比1∶20、復合酶用量0.7%、pH 6.0、溫度45 ℃，該條件下提取的川牛膝多糖含量大于52%。

魏濤等[37]利用超聲波輔助提取懷牛膝多糖，經(jīng)石油醚和乙醇脫脂除雜，水為溶劑，正交試驗確定最優(yōu)提取條件為超聲功率1 000 W、提取溫度60 ℃、提取時問60 min、料液比1∶30，懷牛膝多糖提取率為6.1%。姜艷等[38]采用同樣方法提取牛膝多糖，最后經(jīng)醇沉得到牛膝多糖，收率達到11.7%。趙玥琪等[39]以川牛膝為原料，比較了超聲輔助提取法與煎煮法提取多糖的效率，發(fā)現(xiàn)在相同的提取溫度、時間和料液比情況下，超聲波提取法比煎煮提取效率高9.8%。

除了上述超聲波提取法，微波輔助法也應用于牛膝多糖的提取分離研究中[40-41]。此外，蒸汽爆破預處理法有助于牛膝多糖的提取[42]。多糖純化工藝中，采用醇沉、萃取法除蛋白等方法較多，殼聚糖為絮凝劑有助于川牛膝的總多糖絮凝純化[43]。

3.2 含量測定方法

多糖測定方法主要為苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法比色法。丁淑彬等[44-45]采用紫外分光光度法、苯酚-硫酸顯色法，在490 nm波長處對川牛膝中多糖的含量進行了測定，該法簡單快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好。張純等[46]改良了蒽酮-硫酸比色法測牛膝多糖，經(jīng)典的蒽酮-六十顯色法反應條件為蒽酮試劑濃度為0.2%，反應溫度100 ℃，反應時間10 min，波長620 nm，發(fā)現(xiàn)反應溫度會改變最大吸收波長，優(yōu)化后的反應條件更改為反應溫度20 ℃，其他條件不變。李根林等[47]比較了苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法2種方法對多糖含量檢測的影響，發(fā)現(xiàn)苯酚-硫酸法顯色靈敏度高于蒽酮-硫酸顯色法。

除了上述比色法測量多糖外，多糖經(jīng)水解為單糖后可利用高效液相色譜法進行測定，王小燕等[48]利用牛膝多糖的柱前衍生化，建立懷牛膝多糖的柱前衍生化-HPLC指紋圖譜及單糖含量測定方法，可為懷牛膝飲片質量評價提供參考。

4 小結

該研究主要對川牛膝和懷牛膝中三萜皂苷類、甾酮類及多糖3種主要成分的提取分離與含量測定進行綜述，發(fā)現(xiàn)研究主要集中在化學成分和藥理學研究，對3種主要成分的批量純化工藝研究較少，對單體化合物的檢測方法研究還不足。川牛膝做為川產(chǎn)道地藥材，未來可進一步針對有效成分的分離及純化進行深入研究，為進一步開發(fā)川牛膝的應用提供有力支撐。

安徽農(nóng)業(yè)科學2022年

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