陳凱麗，田秋恒，劉志洋，王海，熊杰，雷勇輝，孫燕飛

（石河子大學(xué)，新疆 石河子 832003）

新疆維吾爾自治區(qū)北疆地區(qū)屬溫帶大陸性氣候。 其鹽堿地面積廣闊，被稱為世界鹽漬土的博物館。 鹽分引起滲透和離子脅迫，抑制氣體交換和光合作用，最終損害植物的生長和發(fā)育[1]。大部分重度鹽堿化土地長期無法利用，嚴(yán)重制約著新疆農(nóng)業(yè)的發(fā)展。而棉花（Gossypium）具有較強(qiáng)的耐鹽性，是新疆鹽堿地上種植最多的經(jīng)濟(jì)作物。

叢枝菌根是陸地生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的植物根系與叢枝菌根真菌 （Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）的共生體。 AMF 能將它們的網(wǎng)狀菌絲延伸到根系外更廣闊的位置，從而擴(kuò)大宿主植物的根系與土壤的接觸面積，形成一個大型的功能性有機(jī)體。 AMF 的菌絲網(wǎng)絡(luò)不僅能提供比根毛更大的吸收表面積，而且有助于植物吸收土壤中的礦質(zhì)營養(yǎng)元素，尤其是磷[2]。 研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AMF 與棉花共生時， 棉花中磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因的表達(dá)水平和磷含量顯著提高。 AMF 的定植可顯著促進(jìn)棉花生長，提高棉花產(chǎn)量和纖維質(zhì)量[3]。Chen 等[4]研究發(fā)現(xiàn)AMF 能使宿主植物獲得耐鹽性，減輕鹽脅迫下植物的氧化損傷。 Hadian-Deljou 等[5]研究發(fā)現(xiàn)AMF 定植后的酸橙幼苗具有更好的滲透物質(zhì)積累和抗氧化防御系統(tǒng)反應(yīng)。Zhang 等[6]研究發(fā)現(xiàn)AMF 定植棉花根際可明顯抑制黃萎病的發(fā)生。 Jiang 等[7]發(fā)現(xiàn)施用AMF 能顯著促進(jìn)棉花根系生長，增強(qiáng)根系對滴灌殺蟲劑的吸收， 在減少殺蟲劑施用量和殘留量的同時，保持對棉花蚜蟲的防控效果。 值得注意的是，土著AMF 能夠促進(jìn)棉花的生長并提高耐鹽能力[8]，探究與挖掘AMF 資源有利于提高棉花抗逆性以應(yīng)對鹽堿環(huán)境。

本研究以新疆棉花根際土壤為研究對象，對新疆棉花根系A(chǔ)MF 侵染情況進(jìn)行調(diào)查研究，并從根際土壤中分離AMF 孢子， 通過形態(tài)學(xué)特征和巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）分子鑒定對新疆棉花AMF 進(jìn)行種類鑒定，探明與新疆棉花共生的AMF 種類及多樣性，為AMF 種質(zhì)資源在新疆棉花上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

1.1.1土樣的采集。2019 年9 月至10 月，在棉花結(jié)鈴?fù)滦跗冢?從新疆維吾爾自治區(qū)3 個市/ 縣5個鎮(zhèn)（表1）采集棉花根際土壤。 按照鎮(zhèn)的分布區(qū)域進(jìn)行采樣，每個鎮(zhèn)確定10 個采樣點(diǎn)，采樣點(diǎn)間隔約為2 km，每個采樣點(diǎn)均采用五點(diǎn)隨機(jī)取樣法采集土壤并混勻，共采集50 份土樣。 其中，由于棉田分布所限，鐘家莊鎮(zhèn)為8 個采樣點(diǎn)和十一連2 個采樣點(diǎn)（同屬于144 團(tuán)）。取樣時，去除雜草和表層土壤， 采集10～20 cm 土層距棉花主根數(shù)毫米范圍內(nèi)的土壤（稱為根際土），每份土樣采集2 kg，陰涼風(fēng)干后過篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 采樣地信息Table 1 Information on sampling sites

1.1.2根樣采集及處理。 采樣時，隨機(jī)采集一定數(shù)量帶有根尖的棉花側(cè)根及須根， 剪成2～3 cm小段， 清洗后放入甲醛- 乙酸- 乙醇（Formaldehydeacetic acid-ethanol fixative, FAA） 固定液中置于室溫保存1 d 以上。 每個土樣采集點(diǎn)取3 個根段，共計(jì)150 個根段。

1.2 分離鑒定

1.2.1根樣染色。 為觀察新疆棉花根系叢枝菌根侵染狀況， 采用堿解離-曲利苯藍(lán)染色法對棉花根系染色。 方法： 取出FAA 固定液中固定的根段，用蒸餾水沖洗3～5 次；剪成1.0～1.5 cm 小段，在10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）KOH 中90 ℃水浴20 min 進(jìn)行根段透明處理， 用蒸餾水沖洗3～5次；在10%H2O2中脫色3 h 20 min，用蒸餾水沖洗3～5 次；用2%鹽酸于室溫酸化20 min，再用0.05%曲利苯藍(lán)染劑于90 ℃水浴染色20 min，蒸餾水沖洗3～5 次；置于乳酸甘油溶液中脫色1 h。 取 出 根 段， 用 聚 乙 烯 醇- 乳 酸- 甘 油（Polyvinyl alcohol-lactate glycerol,PVLG）制片。置于Olympus（CX21）光學(xué)顯微鏡下觀察每條根段的侵染情況，分級記錄為0、10%、20%…，滿級為100%，即該條根段全部被侵染[9]。 觀察并記錄根段各種菌根結(jié)構(gòu)的侵染情況并計(jì)算侵染率（rI）。

式中，i為根段侵染等級（0，10%，…，100%），N為總根段數(shù)，Ni為i級根段數(shù)。

1.2.2叢枝菌根真菌的分離鑒定。稱取50 g 風(fēng)干土樣， 采用濕篩傾析- 蔗糖離心的方法篩選出AMF 孢子。 在Nikon（SMZ800N）體式顯微鏡下挑取形態(tài)相對完整的成熟孢子， 在Olympus（CX21）光學(xué)顯微鏡下（400 倍）觀察其顏色、形狀、大小、連孢菌絲，孢子壁的層數(shù)、類型和厚度，以及在Melzer’s 試劑下的顏色變化等特征。根據(jù)國際AMF 保藏中心（http://invam.wvu.edu）和波蘭農(nóng)業(yè)大學(xué)（http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota）等網(wǎng)站的描述，并參考近年來發(fā)表的中國新記錄種進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3物種多樣性分析。 按上述孢子篩選分離方法，根據(jù)劉潤進(jìn)[9]的方法進(jìn)行AMF 多樣性各指標(biāo)（表2）的測定和計(jì)算，每份土樣重復(fù)3 次。

表2 評價叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的生態(tài)學(xué)參數(shù)Table 2 Ecological parameters of diversity for evaluating AMF community structure

1.2.4叢枝菌根真菌單孢DNA 分子鑒定。 利用濕篩傾析-蔗糖離心法從棉花根際土壤中篩選出27 個形態(tài)各不相同的AMF 孢子，進(jìn)行PCR 分子鑒定。 將PCR 產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行測序。 單孢DNA 的提取參考龍良鯤等[10]的方法，在體視鏡下把濕篩傾析- 蔗糖離心后的單個AMF 孢子吸取出來， 用無菌水漂洗5 次， 放入盛有10 μL TE（Tris＋EDTA）緩沖液的1.5 mL 離心管中，其中TE 含有20%Chelex 100 sodium（Solarbio），然后用無菌槍頭把孢子充分搗碎， 沸水浴10 min，再置于冰上3～5 min，10 000 r·min－1下離心2 min，吸取上清液到新的離心管中即可。 提取的DNA于－20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

目標(biāo)DNA 片段的巢式PCR 擴(kuò)增，引物序列詳見表3。 用上述提取的AMF 單孢DNA 進(jìn)行第1 次PCR 擴(kuò)增， 反應(yīng)體系如下：10×PCR 緩沖液2 μL，0.1 mmol·L－1（終濃度）dNTPs，5 U·μL－1TaqDNA 聚合酶0.1 μL，10 μmol·L－1的NS1 和NS4 引物各1 μL，DNA 模板1 μL（質(zhì)量濃度10 mg·L－1），補(bǔ)雙蒸水ddH2O 至20 μL。 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表3 巢式PCR 所用AMF 引物Table 3 Arbuscular mycorrhizal fungi primers used for nested PCR

第2 次PCR 擴(kuò)增時， 將第1 次PCR 產(chǎn)物稀釋100 倍后作為模板（稀釋倍數(shù)可根據(jù)條帶亮度大小做出調(diào)整， 下同）， 引物替換為AML1 和AML2，反應(yīng)體系同第1 次。 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

第3 次PCR 擴(kuò)增時， 將第2 次PCR 產(chǎn)物稀釋100 倍后作為模板，引物替換為AMV4.5NF 和AMDGR。 反 應(yīng) 體 系 同 第1 次，AMV4.5NF 和AMDGR 引物各為0.8 μL，DNA 模板1 μL，補(bǔ)ddH2O 至20 μL。 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，一共30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。 將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序 （生工生物工程公司）， 所得序列與Maarj AM 數(shù)據(jù)庫（https://maarjambo-tany.ut.ee/）數(shù)據(jù)進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花根系叢枝菌根真菌侵染結(jié)構(gòu)

鏡檢棉花根段，可見清晰的菌絲、泡囊和孢子結(jié)構(gòu)，大多數(shù)根段都有AMF 侵染情況，侵染率為11.2%，表明棉花根系確實(shí)存在叢枝菌根真菌的定植（圖1）。

圖1 棉花根系叢枝菌根真菌的菌絲（A）、重樓型叢枝結(jié)構(gòu)（A）、泡囊（A）和孢子（B）Fig.1 Hyphae (A), paris-type arbuscule structure (A), vesicle (A) and spore (B) of cotton root AMF

2.2 棉花根際土壤叢枝菌根真菌多樣性

所有AMF 物種收錄于球囊菌門（Glomeromycota）下，本研究從50 份棉花根際土樣中共分離出4 屬6 種AMF 孢子（表4）。 包括：球囊霉 目（Glomerales）球 囊 霉 科（Glomaerceae）球 囊霉屬（Glomus）3 種，分別為單孢球囊霉（G.monosporum）、明球囊霉（G.clarum）、卷曲球囊霉（G.convolutum）；多樣孢囊霉目（Diversisporales）無梗囊霉科 （Acaulosporaceae） 無 梗囊霉屬（Acaulospora）1 種，為凹坑無梗囊霉（A.excavata）；類球囊霉目（Paraglomerales）類球囊霉科（Paraglomeraceae）類球囊霉屬（Paraglomus）1 種，為巴西類球囊霉（P.brasilianum）；原囊霉目（Archaeosporales）雙型囊霉科（Ambisporaceae）雙型囊 霉 屬（Ambispora）1 種， 為 薄 壁 雙 型 囊 霉（A.leptoticha）（圖2）。 其中，凹坑無梗囊霉為最常見種，單孢球囊霉、明球囊霉、薄壁雙型囊霉為常見種，巴西類球囊霉為少見種，卷曲球囊霉為偶見種（表4）。

表4 新疆石河子及周邊地區(qū)棉花根際土壤叢枝菌根真菌種類Table 4 AMF species in the cotton rhizosphere soil in Shihezi and surrounding areas in Xinjiang

單孢球囊霉孢子壁有2 層，L1 為透明的薄壁， 厚度為0.5～1.2 μm；L2 為黃棕色， 厚度為4～10 μm（圖2A）。有些孢子L2 上還存在稀疏的小刺突，基部大小為0.5～2.0 μm，高1.2～3.6 μm。連孢菌絲沿孢子壁彎曲，基部為漏斗形，不縊縮。

明球囊霉也有2 層孢子壁，L1 厚度為5～20μm，透明至淡黃色；L2 為透明的膜狀壁，厚度為1.0～1.5 μm（圖2B～C）。 連孢菌絲單根呈漏斗形或圓柱形，有的表面形成一些多皺或多疣狀突起。

圖2 新疆石河子及周邊地區(qū)棉花根際叢枝菌根真菌種類Fig. 2 AMF in the cotton rhizosphere soil in Shihezi and surrounding areas in Xinjiang

卷曲球囊霉孢子呈不規(guī)則形， 大小為2.5～7.0 μm，質(zhì)地較硬且易碎（圖2D）。 濕潤時為淺橘色或橘黃色，孢子被緊緊裹在大小為15～35 μm的菌絲套中。 內(nèi)含物為小油滴。

凹坑無梗囊霉孢子呈圓形或近圓形且為淺黃棕色，大小為120～165 μm。 孢子壁1 層，萌發(fā)壁2 層，均為無色透明。 在Melzer’s 試劑中反應(yīng)并呈現(xiàn)紅色（圖2E～F），表面有圓形或近圓形大凹坑狀紋。

巴西類球囊霉孢子為透明至淺灰色，球形或近球形，大小為70～130 μm（圖2G～H）。 它有3層孢子壁：L1 為無色透明的易逝壁，厚度為0.5～1.5 μm， 常在孢子成熟時消解或者脫落；L2 為無色透明至淺灰色，厚度為1.0～1.5 μm，在Melzer’s試劑中反應(yīng)并呈深黃色（圖2H）；L3 為層狀壁，透明且厚度為1.0～2.5 μm。 表面常附有土壤碎片或微粒。

薄壁雙型囊霉孢子的形態(tài)學(xué)分類鑒定待進(jìn)一步完善（http://fungi.invam.wvu.edu），孢子為圓形或近圓形，黃棕色，孢子壁1 層，連孢菌絲呈圓柱狀，表面有凸起紋（圖2I）。

依據(jù)6 個地區(qū)AMF 群落結(jié)構(gòu)多樣性的生態(tài)學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（表5），總體而言，多個樣本間生態(tài)學(xué)差異較小。 同一地區(qū)不同樣本間孢子密度有一定波動性，而柳毛灣鎮(zhèn)和鐘家莊鎮(zhèn)的種類組成和結(jié)構(gòu)相似。

表5 新疆石河子及周邊地區(qū)棉花根際土壤叢枝菌根真菌多樣性Table 5 Diversity of AMF in the cotton rhizosphere soil in Shihezi and surrounding areas in Xinjiang

依據(jù)巢式PCR 結(jié)果，挑取的27 個AMF孢子歸為4 個屬，分別是類球囊霉屬（Paraglomus）、球囊霉屬（Glomus）、雙型囊霉屬（Ambispora）和盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）。 其中：類球囊霉屬的22 個孢子歸類為3 個虛擬種 （Virtual taxa,VT）ParaglomusVTX00444、ParaglomusVTX00348、Paraglomussp. VTX00308， 孢子數(shù)占比分別是44.4%、14.8%和22.2%； 球囊霉屬的1 個孢子歸類為虛擬種Glomussp.VTX00154； 雙型囊霉屬的2 個孢子歸類2 個虛擬種，分別是Ambisporasp. VTX00283 和Ambisporasp.VTX00242；盾巨孢囊霉屬的2 個孢子未歸類到種。 由此可知，這些地區(qū)棉花根際土壤中優(yōu)勢種為ParaglomusVTX00444，優(yōu)勢屬為類球囊霉屬。

3 討論與結(jié)論

本研究在新疆棉花根系中觀察到泡囊、菌絲和重樓型叢枝等結(jié)構(gòu)， 說明AMF 能夠侵染新疆棉花根系并能與棉花建立較好的共生關(guān)系。 但是與其他植物如甘蔗[13]、玉米[14]、柑橘[15]、胡楊[16]和駱駝刺[17]相比，侵染率并不高。這可能是由于棉花須根較少，且秋季采集的發(fā)育后期的棉花樣本須根木質(zhì)化較為嚴(yán)重不易觀察。 此外，不同地理環(huán)境的海拔、土壤理化性質(zhì)、溫度、季節(jié)及土地管理方式等均會導(dǎo)致AMF 多樣性的差異[18-19]，不同種屬的AMF 對不同宿主植物的侵染也存在一定差異性[20]。 現(xiàn)在已有利用AMF 菌劑提高植物生長和抗逆性的報(bào)道，如毛樹春等[21]研究發(fā)現(xiàn)，對棉花接種地表球囊霉菌劑侵染率最高可達(dá)79.1%。因此，通過接種AMF 提高新疆棉花產(chǎn)量、品質(zhì)、移栽苗成活率等具有廣闊的前景。

本研究中形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定均分出4屬6 種AMF 孢子，二者結(jié)果相似，但種屬分類存在一定差異。 巴西類球囊霉在形態(tài)學(xué)鑒定中的相對多度明顯低于凹坑無梗囊霉，初步判定為少見種，而在分子鑒定中占比升高。 這可能是因?yàn)榉肿予b定時挑取AMF 孢子時受主觀因素影響，選取巴西類球囊霉孢子略多。

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定可以快速、高效地觀察出不同樣品中AMF 的種類與數(shù)量差異。但是，同一物種孢子在不同生長發(fā)育時期個體存在結(jié)構(gòu)差異，比如厚皮雙型囊霉（A.callosa）最外層孢子壁會隨著時間推移而脫落，有的種屬間孢子壁層數(shù)差異不明顯，增加了形態(tài)學(xué)鑒定的難度。國際AMF 保藏中心記錄16 屬82 種AMF， 而截至2011 年，我國已發(fā)現(xiàn)10 個屬131 種AMF[22]。由此可見，有一些AMF 物種未被鑒定歸類。對比之下，分子水平鑒定準(zhǔn)確度和可靠性較高。 Maarj AM 數(shù)據(jù)庫以孢子種的核糖體小亞基rDNA 序列為參考，將分子水平的鑒定結(jié)果歸類至屬甚至種的水平，稱之為虛擬種[23]。 本研究通過測序及序列比對將AMF 分為4 個屬，6 個虛擬種。序列比對時，部分樣本序列與已知序列的相似性未達(dá)到97%及以上。可見，還有一些AMF 物種序列沒有被納入該數(shù)據(jù)庫，也可能存在未知物種未被鑒定。 設(shè)計(jì)出能覆蓋大多數(shù)AMF 的特異性引物是分子鑒定亟待解決的技術(shù)瓶頸[24]，因?yàn)槌彩絇CR 擴(kuò)增技術(shù)的關(guān)鍵在于特異性引物[25]，常用的有AML1/AML2、AMV4.5NF/AMDGR、NS31/AM1，但每種引物對于不同屬AMF 的覆蓋率均有差異。 而且目前AMF 類群的鑒定也沒有確定一致的DNA 條形碼區(qū)域[26]。 此外，目前有關(guān)我國AMF 分子多樣性數(shù)據(jù)的樣本量不足，且存在不同生態(tài)系統(tǒng)、不同氣候區(qū)域等的不平衡。 因此，要反映我國AMF分子多樣性的整體狀況，還需要進(jìn)行大量研究[27]。從長遠(yuǎn)來看，采取形態(tài)學(xué)與分子技術(shù)相結(jié)合的辦法進(jìn)行AMF 群落研究有助于完善AMF 分類系統(tǒng)和增強(qiáng)AMF 研究的可持續(xù)性[28]。

綜合兩者鑒定結(jié)果，以分子鑒定為主，本研究區(qū)域的AMF 主要優(yōu)勢屬為類球囊霉屬，優(yōu)勢種為巴西類球囊霉。 在自然環(huán)境中，新疆棉花根系A(chǔ)MF 種質(zhì)資源豐富。其中球囊霉屬、無梗囊霉屬、雙型囊霉屬和類球囊霉屬的孢子種類和數(shù)量較多，與西伯利亞云杉[29]、沙蒿[30]的AMF 組成具有一定的相似性，說明這4 個屬能適應(yīng)不同的環(huán)境，具有適應(yīng)性強(qiáng)、分布較廣泛的特點(diǎn)。 AMF 的多樣性受到環(huán)境因素影響，適應(yīng)生境的菌種大量繁殖并隨之成為優(yōu)勢種，相反則會被慢慢淘汰至消失[31]。 出現(xiàn)頻度較高、重要值較高的AMF 物種可能是由于自身的生物學(xué)特性比較適應(yīng)該生境，這是其與地理環(huán)境條件和宿主植物共同進(jìn)化的結(jié)果。

完善植物叢枝菌根真菌的種質(zhì)資源調(diào)查，對篩選高效菌種、開發(fā)菌根真菌資源并在農(nóng)林業(yè)上的應(yīng)用具有重要意義。 在生物利用技術(shù)上，可通過接種AMF， 提高植物的抗旱性和耐受鹽堿脅迫能力，增強(qiáng)植物對氮、磷等元素的吸收能力[30]。本研究對新疆石河子及周邊地區(qū)棉花根際AMF的侵染狀況進(jìn)行了調(diào)查， 并對根際AMF 種類進(jìn)行了鑒定，確定了部分棉花根際AMF 種質(zhì)資源，補(bǔ)充了新疆AMF 菌種資源， 可為叢枝菌根的研究與應(yīng)用提供參考；在生產(chǎn)上，可為AMF 菌劑篩選提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為新疆棉花菌根化育苗、栽培和豐產(chǎn)提供理論依據(jù)[22]。