陳琴，李多露，趙杰銀，高文舉，陳全家，曲延英

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 教育部棉花工程研究中心/ 新疆作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052）

新疆是我國最大的植棉區(qū)，相較于國內(nèi)其他棉區(qū)有著氣候干燥、晝夜溫差大、日照時(shí)間長等優(yōu)勢(shì)。 截至2020 年，新疆棉花種植面積和總產(chǎn)量已分別占全國的78.9%和87.3%[1]。 然而，水分蒸發(fā)量大、水資源匱乏，以及日益加重的土地鹽堿化， 致使新疆植棉面積和纖維品質(zhì)受到影響，嚴(yán)重制約了新疆棉花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[2]。 植物遭受到干旱脅迫時(shí)， 往往會(huì)發(fā)生細(xì)胞膜通透性增加、葉綠體減少、 體內(nèi)活性氧積累量增加等現(xiàn)象，導(dǎo)致植物萎蔫、體內(nèi)細(xì)胞代謝水平紊亂[3-4]。 在長期的干旱脅迫下，植物會(huì)改變自身形態(tài)結(jié)構(gòu)和體內(nèi)生理生化水平以更好地適應(yīng)干旱環(huán)境。

蔗糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物，是植物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成中不可或缺的成分[5]。 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（Uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase, UDPGP） 作為蔗糖代謝過程中次級(jí)代謝產(chǎn)物尿苷二磷酸葡萄糖（Uridine diphosphate glucose,UDPG）合成的關(guān)鍵酶之一，在植物的生長、發(fā)育、養(yǎng)分儲(chǔ)存、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和適應(yīng)環(huán)境脅迫中起著關(guān)鍵作用[6-8]。研究表明，一方面UDPGP 能夠催化葡萄糖活化，將1- 磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDPG，再通過蔗糖磷酸合成酶合成6-磷酸蔗糖， 之后6-磷酸蔗糖在蔗糖磷酸酶的作用下合成蔗糖[9-10]；另一方面，蔗糖能夠在蔗糖合酶或轉(zhuǎn)化酶作用下降解為UDPG，參與植物體內(nèi)的糖代謝調(diào)控[11-12]。

UDPGP 參與代謝調(diào)控以及糖原、 淀粉和纖維素等物質(zhì)的合成，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。 Flores-Diaz 等[13]研究表明，UDPGP基因的單點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞UDPG 缺乏；Meng 等[14]研究也顯示UDPGP 不是蔗糖、 淀粉和細(xì)胞壁合成的限速酶， 但它在擬南芥中必不可少，UDPGP缺失的擬南芥突變體種子產(chǎn)量下降高達(dá)50%；Long 等[7]利用水稻突變體研究發(fā)現(xiàn)，編碼UDPGP1的FLOURY ENDOSPERM 8 影響水稻胚乳中淀粉的合成；陳小敏等[15]證明小分子碳源和有機(jī)氮源能夠提高香菇菌絲胞內(nèi)UGP基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)多糖含量的增加；Wang 等[16]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)棉花UPGPG基因的擬南芥可溶性糖、 淀粉和纖維素含量增加，但木質(zhì)素含量未增加，表明該基因參與了擬南芥糖代謝和細(xì)胞壁的生物合成。 Zhang等[17]預(yù)測(cè)UPGPG基因的過表達(dá)可能增加黃麻的纖維素含量。 UDPGP 也參與了植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)過程。 郭鑫[18]研究表明，興安落葉松中的LgUGPase1和LgUGPase2基因主要參與植物生長發(fā)育中的代謝調(diào)控，對(duì)光、逆境脅迫和植物激素有一定的響應(yīng)。 Deng 等[19]發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）的UPGPG突變體對(duì)十二烷基硫酸鈉和高濃度NaCl 敏感， 對(duì)棉花和煙草幼苗的毒力降低，突變孢子的萌發(fā)顯著延遲。 但目前關(guān)于陸地棉 （Gossypium hirsutumL.）UPGPG基因的系統(tǒng)鑒定和抗旱相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究基于本課題組蛋白雙向電泳及質(zhì)譜分析篩選結(jié)果[20]，選擇棉花抗旱相關(guān)的GhUDPGP基因，并對(duì)其基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在解析UDPGP基因家族在棉花中的進(jìn)化和擴(kuò)增， 以及在棉花干旱脅迫應(yīng)答過程中的表達(dá)模式，為深入解析GhUDPGP基因在植物干旱脅迫響應(yīng)過程中的功能和作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本研究所用陸地棉耐旱品種KK1543 和干旱敏感品種新陸早26 號(hào)[21]均由新疆作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。 采用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液水培法將棉花幼苗培養(yǎng)至兩葉一心， 用15%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 聚乙醇（Polyethylene glycol,PEG）6000 模擬干旱脅迫， 分別于處理后0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 對(duì)棉花根、莖、葉進(jìn)行取樣，每個(gè)樣品3 次生物學(xué)重復(fù)，置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 GhUDPGP 家族基因鑒定與蛋白理化性質(zhì)分析

從CottonGen 數(shù)據(jù)庫（https://www.cottongen.org/）中下載陸地棉基因組（ZJU,TM-1,2.1）和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。借助UDPGP 蛋白結(jié)構(gòu)域（PF01704）的隱馬爾可夫模型， 基于Hmmsearch 搜索結(jié)果，通過本地Blast 獲取陸地棉全基因組UDPGP 蛋白序列，進(jìn)一步利用在線數(shù)據(jù)庫CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）、Pfam（http://pfam.xfam.org/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）鑒定含有完整UDPGP 結(jié)構(gòu)域的蛋白。 利用ExPASy（http://cn.expasy.org/tools）在線工具和ProtComp Version 9.0 軟件分析陸地棉UDPGP 蛋白的氨基酸殘基數(shù)量、分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及亞細(xì)胞定位等。

1.3 進(jìn)化樹分析

利用MEGA 7 軟件中的Clustal W 對(duì)陸地棉的UDPGP 蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)， 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中自展值（Bootstrap）設(shè)定為1 000[22]，利用在線網(wǎng)站Evolview （https://evolgenius.info//evolview-v2/）對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

1.4 染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析

利用TBtools 軟件提取GhUDPGP基因在染色體上的位置信息。 通過MEME 程序[23]對(duì)UDPGP家族成員進(jìn)行基序分析（最大發(fā)現(xiàn)數(shù)設(shè)為15）。通過CottonGen 下載基因組注釋文件，利用TBtools軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

1.5 順式作用元件預(yù)測(cè)

通過TBtools 提取陸地棉UDPGP基因起始密碼子上游2 000 bp 序列作為啟動(dòng)子區(qū)， 利用Plant CARE 數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)GhUDPGP基因啟動(dòng)子區(qū)可能存在的順式作用元件。

1.6 RNA-seq 分析

從NCBI SAR 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）下載陸地棉不同器官（根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣和花托）和干旱脅迫處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) （基因組測(cè)序計(jì)劃編號(hào)：PRJNA248163）。 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分析，得到表達(dá)量數(shù)據(jù)。 基于TPM（Transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads）對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2（TPM＋1）標(biāo)準(zhǔn)化處理，并利用R 4.0.2 軟件進(jìn)行表達(dá)量熱圖的繪制。

1.7 基因表達(dá)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果， 利用Premier 5.0 和DNAMAN 軟件設(shè)計(jì)GhUDPGP10和GhUDPGP26的特異性引物（表1），通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 檢測(cè)1.1 中各材料中2 個(gè)基因的表達(dá)情況。以GhUbq7基因作為內(nèi)參基因，在ABI 7500 fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行qRT-PCR 分析。 反應(yīng)體系為20.0 μL， 包括Eva Green2×qPCRMasterMix910.0 μL、ddH2O6.8 μL、正反向引物各0.6 μL、cDNA 模板2.0 μL。 PCR擴(kuò)增條件為94 ℃30 s；94 ℃5 s；60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)后增加熔解曲線。 每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)， 采用2－ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)量的相對(duì)定量分析。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉UDPGP 基因的鑒定和分析

本研究在陸地棉基因組中共鑒定出31 個(gè)GhUDPGP基因。根據(jù)GhUDPGP基因在染色體上的位置依次命名為GhUDPGP01～GhUDPGP31。如表2 所示，經(jīng)預(yù)測(cè)，UDPGP基因家族成員的開放閱讀框 （Open reading frame, ORF） 長度為186～2 628 bp，UDPGP 蛋白質(zhì)含有61～875 個(gè)氨基酸殘基，其分子質(zhì)量為6.88～96.66 ku，等電點(diǎn)為4.91～9.91。 31 個(gè)基因不均等地分布在18條染色體上， 其中A 亞組有12 個(gè)，D 亞組有19個(gè)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，陸地棉中UDPGP 家族成員定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞間隙。

表2 陸地棉UDPGP 基因信息Table 2 Information of UDPGP genes in G. hirsutum

2.2 陸地棉UDPGP 蛋白的進(jìn)化分析

陸地棉31 個(gè)UDPGP 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）顯示，陸地棉UDPGP 蛋白可分為5 個(gè)亞族Ⅰ～Ⅴ， 其中A 亞組的8 個(gè)蛋白與D 亞組的同源蛋白（圖1 中☆標(biāo)記）分別聚在一起，這個(gè)結(jié)果也證實(shí)了約150 萬年前棉屬A 和D 亞基因組發(fā)生的多倍化事件[24]。 此外，來自D 亞組3 對(duì)蛋白（圖1中△標(biāo)記）間相似性為81%～99%，推測(cè)它們可能在長期的進(jìn)化過程中發(fā)生了分化；還有9 個(gè)蛋白（圖1 中○標(biāo)記）沒有發(fā)現(xiàn)同源蛋白，說明編碼這些蛋白的基因可能在進(jìn)化過程中發(fā)生了突變或者其同源基因丟失。

圖1 陸地棉31 個(gè)UDPGP 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of 31 UDPGP proteins from G. hirsutum

2.3 陸地棉UDPGP 基因的結(jié)構(gòu)特征分析

利用MEME 分析UDPGP 蛋白保守基序發(fā)現(xiàn)，相同亞族的成員含有相同的基序（圖2 A），第Ⅰ亞族的基序最多（15 個(gè)），而第Ⅳ亞族的2 個(gè)蛋白僅有2 個(gè)基序。 基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該家族基因成員含有2～21 個(gè)外顯子 （圖2 B），其中GhUDPGP06、GhUDPGP10、GhUDPGP20和GhUDPGP26基因的外顯子數(shù)目最多 （21 個(gè)），GhUDPGP18、GhUDPGP27和GhUDPGP29基因的外顯子數(shù)目最少（2 個(gè)）。從基因長度來看，不同長度的基因具有相似的編碼區(qū)序列， 說明UDPGP基因在進(jìn)化過程中內(nèi)含子長度存在較大的變異，可能導(dǎo)致其功能多樣化。

圖2 陸地棉UDPGP 蛋白保守基序（A）及基因結(jié)構(gòu)（B）特征分析Fig. 2 Analysis of conserved motif (A) and gene structure (B) of UDPGP family in G. hirsutum

2.4 陸地棉UDPGP 家族基因的順式作用元件分析

啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在陸地棉UDPGP家族基因啟動(dòng)子序列中，有19 個(gè)基因含有響應(yīng)脫落酸的ABRE 元件、17 個(gè)基因含有響應(yīng)赤霉素的GARE 元件、14 個(gè)基因含有響應(yīng)水楊酸的TCA 順式作用元件。 此外，還發(fā)現(xiàn)11 個(gè)基因含有響應(yīng)生長素的TGA 元件、14 個(gè)基因含有響應(yīng)干旱的MYB 結(jié)合位點(diǎn)、14 個(gè)基因包含響應(yīng)茉莉酸甲酯的TGACG 元件。 這些發(fā)現(xiàn)暗示陸地棉UDPGP基因除參與植物生長代謝調(diào)控外，還與植物的逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。

2.5 陸地棉UDPGP 家族基因表達(dá)分析

為明確UDPGP基因的組織表達(dá)特異性及其在干旱脅迫下的表達(dá)模式，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)31個(gè)GhUDPGP基因在棉花根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣和花托及干旱脅迫處理后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行聚類分析。 組織特異性表達(dá)分析顯示（圖3A），正常生長條件下，不同GhUDPGP基因呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式， 其中GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在陸地棉各個(gè)器官中均存在不同程度高表達(dá)，其余基因則呈現(xiàn)低表達(dá)甚至不表達(dá)趨勢(shì)，暗示GhUDPGP10和GhUDPGP26基因可能在陸地棉生長發(fā)育過程中扮演重要角色。 同時(shí)， 分析干旱脅迫處理下UDPGP基因在棉花根部的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在受干旱脅迫時(shí)上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量較高（圖3B）， 推測(cè)GhUDPGP10和GhUDPGP26基因可能參與了棉花干旱脅迫響應(yīng)過程。

圖3 陸地棉UDPGP 基因的表達(dá)分析Fig. 3 Expression analysis of UDPGP genes in G. hirsutum

為進(jìn)一步研究GhUDPGP10和GhUDPGP26基因的功能，對(duì)抗旱棉花品種KK1543 和干旱敏感型品種新陸早26 號(hào)分別進(jìn)行了干旱脅迫處理。 利用qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，抗旱材料KK1543經(jīng)干旱處理后12 h，GhUDPGP10基因在根中顯著高表達(dá)，在葉和莖中表達(dá)量相對(duì)較低（圖4A）；干旱敏感型材料新陸早26 經(jīng)干旱脅迫后48 h，GhUDPGP10基因在葉中較高水平表達(dá)， 在根和莖中表達(dá)相對(duì)較低（圖4C）。 總體上，GhUDPGP26基因也表現(xiàn)出在抗旱材料根中高表達(dá)（圖4B），在干旱敏感型品種葉中高表達(dá)的模式（圖4D），推測(cè)GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在陸地棉不同部位發(fā)揮作用，可能通過不同的調(diào)控通路參與棉花抗旱響應(yīng)過程。

圖4 干旱脅迫下不同材料中GhUDPGP10 和GhUDPGP26 的表達(dá)分析Fig. 4 Expression analysis of GhUDPGP10 and GhUDPGP26 under drought stress in different cotton materials

3 討論

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，陸地棉GhUDPGP 家族蛋白位于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞間隙， 這與賀望興等[25]、Muchut 等[26]的研究結(jié)果一致。 組織特異性表達(dá)分析顯示，31 個(gè)GhUDPGP基因在陸地棉根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣和花托中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式， 表明UDPGP 作為植物體內(nèi)蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在植物不同部位發(fā)揮著不 同 的 作 用。 Park 等[27]將atugp1/atugp2雙 突 變后，花粉發(fā)育異常，導(dǎo)致雄性不育。 Chivasa 等[28]明確UGP1 是一種新型植物細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑。Yi等[29]發(fā)現(xiàn)Ugp1 在釀酒酵母中可以調(diào)節(jié)各種碳水化合物的含量，進(jìn)而影響蛋白激酶活性，從而參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，維持菌體長期存活。呂楠等[30]研究表明， 鐵皮石斛中DoUGPase1基因的表達(dá)水平與植株體內(nèi)多糖物質(zhì)的積累成正比，可促進(jìn)植物的生長發(fā)育。

陸地棉UDPGP家族基因啟動(dòng)子區(qū)含有多個(gè)逆境響應(yīng)調(diào)控元件，推測(cè)GhUDPGP基因在植物抵抗逆境脅迫的過程中也發(fā)揮重要作用。 自然光條件下，擬南芥受到冷脅迫和蔗糖處理，AtUGPase基因呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)[31]。 擬南芥中UGPase基因的表達(dá)能夠維持植物體內(nèi)營養(yǎng)狀態(tài)的穩(wěn)定，增強(qiáng)其對(duì)鹽脅迫的耐受性[32]。在受到干旱脅迫和鹽脅迫時(shí)， 青杄USP1基因通過增強(qiáng)植物的活性氧清除能力及抑制膜脂氧化損傷來提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性[33]。 胡楊中UGP1/UGP2基因的協(xié)同作用有助于促進(jìn)胡楊的生長發(fā)育及提高對(duì)鹽脅迫的耐受能力[34]。最近，Liu 等[35]從76 個(gè)物種中鑒定了454 個(gè)UDPGP 蛋白，并通過表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)， 水稻UDPGP基因受茉莉酸、脫落酸、鎘和冷脅迫誘導(dǎo)。 以上研究均暗示UDPGP 可能在植物發(fā)育和逆境響應(yīng)中起重要作用。

本研究分析了GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在干旱脅迫條件下的表達(dá)特性， 發(fā)現(xiàn)GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在不同抗旱性棉花材料間的表達(dá)存在差異。 在15%PEG 6000脅迫處理?xiàng)l件下，GhUDPGP10基因主要在抗旱棉花材料的根中高表達(dá)，顯著高于其在莖和葉中的表達(dá)（干旱處理后3～24 h），但是在干旱敏感材料中葉中表達(dá)量較高；GhUDPGP26基因在抗旱材料的根部高表達(dá)，在干旱敏感型材料的葉片中表達(dá)上調(diào)，推測(cè)GhUDPGP10基因作為關(guān)鍵基因在棉花根部發(fā)揮重要作用，而GhUDPGP26基因在棉花葉片和根部均能發(fā)揮一定的功能，UDPGP基因可能通過不同的途徑參與了陸地棉對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)， 但GhUDPGP10和GhUDPGP26基因在棉花干旱脅迫響應(yīng)中的功能和作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過基因家族分析，在陸地棉中鑒定出31 個(gè)具有UGPDP 保守結(jié)構(gòu)域的家族成員，系統(tǒng)進(jìn)化分析將其分為5 個(gè)亞族。 啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)， 該家族基因含有響應(yīng)脫落酸、赤霉素、水楊酸等的順式作用元件，暗示該家族基因在干旱脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。 RNA-seq和表達(dá)分析表明，GhUDPGP10和GhUDPGP26可能作為主要基因參與棉花干旱脅迫響應(yīng)。 本研究為進(jìn)一步解析棉花UDPGP基因的抗旱機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步提高棉花的逆境適應(yīng)性提供了潛在的基因資源。