李秀青，王倩，胡子曜，雷建峰，代培紅，劉超，劉曉東，李月*

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

棉花不僅是我國重要的經(jīng)濟作物，還在紡織工業(yè)和國防軍事上發(fā)揮著重要的作用[1]。 然而棉花在生長過程中會遭受各類生物脅迫的影響，這些因素嚴(yán)重制約著棉花的產(chǎn)量及纖維品質(zhì)，繼而對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟造成巨大損失。 棉花黃萎病是一種土傳維管束真菌病害，其致病菌主要為大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）或黑白輪枝菌（Verticillium albo-atrum），嚴(yán)重制約著棉花的正常生長[2]。 大麗輪枝菌為我國主要的棉花黃萎病病原菌，寄主范圍廣、傳播速度快、破壞面積大，因而防治極為困難。 目前還沒有對黃萎病有效的殺菌劑。 因此篩選、鑒定棉花抗黃萎病相關(guān)基因并研究其抗病分子機制從而培育棉花抗病種質(zhì)材料，對黃萎病的防治具有重要意義。

為了抵御外界脅迫，植物進化出了一系列調(diào)控機制來保證其正常的生長發(fā)育。 當(dāng)植物受到外界刺激后，胞外信號轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信號并在細胞內(nèi)進行傳遞，從而使植物產(chǎn)生相應(yīng)的生理生化反應(yīng)來抵御逆境因素的影響[3]。 促絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)途徑是植物抵御逆境脅迫的重要調(diào)節(jié)機制之一[4]。MAPK 家族由MAPK、MAPKK 和MAPKKK 組成[5]，MAPK 級聯(lián)途徑與植物生長發(fā)育之間的關(guān)系一直是研究的熱點。 對于MAPK 級聯(lián)途徑的研究最初是1993 年Kieber 等[6]在擬南芥（Arabidopsis thaliana） 突變體ctr1中發(fā)現(xiàn)一個基因CTR1， 該基因編碼一個與Raf 蛋白激酶家族密切相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 并且可以調(diào)控乙烯信號通路。 此后越來越多的研究表明MAPK 級聯(lián)途徑廣泛參與植物生長發(fā)育及各種逆境脅迫響應(yīng)。 當(dāng)植物體遭受微生物或病原體的侵染、機械損傷、低溫、干旱、滲透壓及活性氧等脅迫時均會激活體內(nèi)的MAPK 級聯(lián)途徑[7]。 Victoria 等[8]發(fā) 現(xiàn)MKP2 通 過 與MPK3 和MPK6 相互作用，介導(dǎo)植物抵御病原體入侵反應(yīng)；Tsuyoshi等[9]發(fā)現(xiàn)擬南芥ATMPK4，MEK1 和ATMEKK1彼此相互作用構(gòu)成特定的MAPK 級聯(lián)， 這是MAPK 級聯(lián)途徑存在的第一個證明，該途徑可以介導(dǎo)植物抗逆反應(yīng)；Shoresh 等[10]在黃瓜中超表達TIPK基因后顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株抗木霉菌侵染的能力；煙草WRKYs通過與MAPK 級聯(lián)途徑相互作用，正向調(diào)控植株對粉虱的防御能力[11]。

目前已有相關(guān)報道表明，MAPK 級聯(lián)途徑中的基因參與棉花抗病原菌侵染。 郭慧敏[12]對陸地棉（G.hirsutum）、雷蒙德氏棉（G.raimondii）和亞洲棉（G.arboreum）3 種棉花中MAPK基因家族所有蛋白序列進行了聚類分析并利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS）技術(shù)分析了22 個MAPK基因的功能，初步篩選出了在棉花抗黃萎病中可能起重要調(diào)控作用的13 個MAPK基因。 Meng 等[13]在陸地棉基因組中共鑒定出24 個MKK基因并利用VIGS 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，GhMKK4，GhMKK6和GhMKK9基因在棉花抗黃萎病中發(fā)揮正調(diào)控作用，GhMKK10基因在棉花抗黃萎病中發(fā)揮負調(diào)控作用。 王倩等[14]從陸地棉中克隆出了一個MAPK基因GhMAPKKK3， 利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative real-time PCR, qRT-PCR）技術(shù)分析表明該基因響應(yīng)棉花黃萎病菌誘導(dǎo)。 但目前關(guān)于棉花MAPK基因在抵御黃萎病菌反應(yīng)中的功能及相關(guān)抗病分子機制仍然知之甚少。

本研究利用實驗室前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆得到了1 個響應(yīng)黃萎病菌誘導(dǎo)表達的MAPK基因GhMAPKKK2，利用VIGS 技術(shù)及一系列分子生物學(xué)手段對該基因的功能及可能參與的調(diào)控通路進行了初步探究，為解析棉花抗黃萎病的反應(yīng)機制及棉花抗病育種提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為耐黃萎病陸地棉品種中棉所35，由本實驗室繁殖保存。

農(nóng)桿菌菌株GV3101 為本實驗室保存。 煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）載體及含陽性對照TRV-GhCLA1 載體的農(nóng)桿菌菌株和大麗輪枝菌強致病力落葉型菌株V991 均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃全生研究員惠贈。

Trans-T1 大腸桿菌感受態(tài)細胞、pEASYBlunt Zero 克隆載體、FastPfu Fly DNA 聚合 酶、T4 DNA Ligase、RNase A、TaqDNA 聚合酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司； 植物總RNA 提取試劑盒購于杭州博日科技公司；熒光定量試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于加拿大ABM 生物科技有限公司； 限制性內(nèi)切酶購于賽默飛世爾科技公司；試驗所用卡那霉素、慶大霉素、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate, Me-JA）、 水 楊 酸（Salicylic acid,SA） 及培養(yǎng)基配制等化學(xué)試劑均購于北京索萊寶生物有限公司； 引物合成和DNA 測序均由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1基因克隆。 以陸地棉中棉所35 的cDNA為模板進行PCR 擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖電泳檢測，回收目的片段并連接至pEASY Blunt-Zero 克隆載體；對質(zhì)粒進行酶切鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒送至上海杰李生物技術(shù)有限公司進行測序[15]。

1.2.2生物信息學(xué)分析。 使用Expasy（http://web.expasy.org/protparam/） 在線程序計算GhMAPKKK2 蛋白的理化參數(shù)。 在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對分析獲得GhMAPKKK2 的同源蛋白序列， 使用MEGA7 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3接菌處理及取樣。將保存在－80 ℃冰箱的大麗輪枝菌V991 取出后，參照Li 等[15]的方法進行活化培養(yǎng)。 選取大小一致且顆粒飽滿的中棉所35 的種子，參照Li 等[15]的方法進行培育、種植及接菌處理，對照組（MOCK）用Czapek's 培養(yǎng)基處理。 分別在接菌處理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 取棉花植株根部組織，每個時間點均取3 個生物學(xué)重復(fù)。 取樣后立即置于液氮中并轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.4激素誘導(dǎo)處理及取樣。 參照王鈺靜[16]的方法，選取生長狀況一致的棉株，將其根部洗凈后分別浸泡在100 μM·L－1Me-JA 和1 mM·L－1SA溶液中，對照組（MOCK）加相同體積的無水乙醇。 分別在處理后0 h、4 h、8 h、12 h 對植株根部進行取樣，每個時間點均取3 個生物學(xué)重復(fù)。 取樣后立即置于液氮中并轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.5基因表達分析。 使用植物總RNA 提取試劑盒對棉花根部或葉片樣品進行總RNA 的提取，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA 的合成。 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板， 參照ABM 熒光定量試劑盒說明書，以棉花泛素基因GhUBQ7為內(nèi)參基因[17]，進行qRT-PCR 反應(yīng)，利用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量[18]，熒光定量引物信息見表1。

1.2.6VIGS 載體構(gòu)建與侵染。 根據(jù)GhMAPKKK2基因（Gh_D10G0119）的編碼序列（Coding sequence,CDS）， 利用SGN-VIGS 在線軟件設(shè)計抑制目的基因表達的靶序列，利用DNAMAN 軟件設(shè)計特異性引物并分別在上、下游引物5’端加入EcoRⅠ和KpnⅠ的酶切位點（表1）；以陸地棉cDNA 為模板進行PCR 擴增，回收目的片段并連接至pEASY Blunt-Zero 平端克隆載體，挑取陽性單克隆進行測序。 將測序結(jié)果與預(yù)期完全一致的質(zhì)粒以及TRV2 沉默載體進行雙酶切，分別回收目的片段，用T4 DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞。 取10 μL 左右鑒定正確的TRV：GhMAPKKK2 重組質(zhì)粒以及TRV：RNA1 和TRV：RNA2 質(zhì)粒， 利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 中，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，用于后續(xù)試驗。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers for experiments

選取生長至兩片子葉完全展開、真葉未露出且生長較為一致的棉花幼苗，參照Li 等[15]的方法，進行農(nóng)桿菌菌體的活化、重懸，利用注射法侵染 棉 花 子 葉。 TRV：GhMAPKKK2、TRV：00 和TRV：GhCLA1 侵染的植株分別作為試驗組、陰性對照、陽性對照。侵染后15 d 左右，當(dāng)陽性對照植株的葉片出現(xiàn)白化表型時， 對試驗組和陰性、陽性對照的第二片真葉及根部進行取樣，每個樣本均取3～4 個重復(fù)，利用qRT-PCR 技術(shù)對基因的沉默效率進行檢測。

1.2.7黃萎病抗性鑒定。 選取兩片真葉完全展開且生長狀況一致的GhMAPKKK2沉默植株和陰性對照植株進行黃萎病菌的接種處理[15]。 接種后20 d 拍照記錄GhMAPKKK2沉默植株和陰性對照植株的病癥情況并采用葉片分級法統(tǒng)計病情指數(shù)[15]，同時對GhMAPKKK2沉默植株和陰性對照植株進行剖稈檢測及莖段恢復(fù)培養(yǎng)試驗[16]。

于接菌前（0 h）及接菌后6 h、12 h、24 h 和48 h 取植株根部組織， 檢測GhMAPKKK2沉默植株和陰性對照植株中JA 和SA 信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhMAPKKK2 基因的克隆與序列分析

從陸地棉中棉所35 的cDNA 中克隆獲得GhMAPKKK2的CDS，長度為1 341 bp。 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示該基因位于陸地棉D(zhuǎn)t 亞組第10 號染色體上， 含有2 個外顯子和1 個內(nèi)含子，編碼446 個氨基酸。GhMAPKKK2 蛋白的相對分子量為49.45 ku，脂肪系數(shù)為82.33，理論等電點為5.68， 平均疏水性為－0.257， 不穩(wěn)定系數(shù)為40.58，表明該蛋白為酸性、親水性、不穩(wěn)定蛋白。

根據(jù)NCBI 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫BLAST 結(jié)果，選取雷蒙德氏棉、海島棉（G.barbadense）、亞洲棉、擬 南 芥（A.thaliana）、水 稻（Oryza sativa）、可 可（Theobroma cacao）、榴蓮（Durio zibethinus）、番茄（Solanum lycopersicum）、蘋果（Malus domestica）、歐洲甜櫻桃 （Prunus avium） 等物種中GhMAPKKK2 同源蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。 結(jié)果顯示GhMAPKKK2 與雷蒙德氏棉中GrMAPKKK2 親緣關(guān)系最近， 與水稻中OsMAPKKK12-1 親緣關(guān)系較近（圖1）。

圖1 GhMAPKKK2 蛋白系統(tǒng)進化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of GhMAPKKK2 protein

2.2 GhMAPKKK2 基因在黃萎病菌及激素誘導(dǎo)下的表達模式分析

與對照相比，GhMAPKKK2基因在黃萎病菌V991 處理后6 h、12 h 和72 h 表達量顯著上調(diào)，在48 h 表達量顯著降低，24 h 無顯著變化 （圖2A）。 與對照組相比，GhMAPKKK2基因在外源JA 處理后4 h 和8 h 表達量顯著上調(diào)（圖2B）；而其表達量在外源SA 處理后4 h 和8 h 顯著下調(diào)，12 h 無顯著差異 （圖2C）。 以 上結(jié) 果表 明，GhMAPKKK2基因響應(yīng)黃萎病菌及外源JA、SA激素誘導(dǎo)處理。

圖2 GhMAPKKK2 的表達模式分析Fig. 2 Expression patterns analysis of GhMAPKKK2

2.3 GhMAPKKK2 基因VIGS 載體構(gòu)建及沉默效率檢測

PCR 擴增GhMAPKKK2基因的沉默靶序列（圖3A），將其連接至中間載體pEASY Blunt-Zero 并進行測序；隨后通過雙酶切、連接反應(yīng)將沉默靶序列克隆至TRV2 載體， 經(jīng)雙酶切驗證，其大小符合預(yù)期（圖3B），表明GhMAPKKK2的VIGS 沉默載體構(gòu)建成功。

侵染后15 d 左右， 陽性對照TRV：GhCLA1的葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象（圖3C），利用qRT-PCR 技術(shù)檢測GhCLA1及目的基因GhMAPKKK2在根和真葉中的表達量。 結(jié)果顯示，與陰性對照相比，陽性對照中GhCLA1的表達量和試驗組中GhMAPKKK2基因的表達量均顯著下調(diào) （圖3D～E），表明VIGS 沉默載體可以在植株體內(nèi)正常工作， 同時成功獲得GhMAPKKK2基因的沉默植株。

圖3 GhMAPKKK2 基因的沉默效率檢測Fig. 3 Silencing efficiency of GhMAPKKK2 gene

2.4 GhMAPKKK2 基因沉默植株的黃萎病抗性鑒定

選取30 株生長狀態(tài)一致的GhMAPKKK2基因沉默植株和TRV：00 陰性對照植株進行黃萎病菌侵染處理，20 d 后拍照記錄其表型差異并進行病情指數(shù)統(tǒng)計及剖稈檢測和莖段恢復(fù)培養(yǎng)試驗。 結(jié)果顯示，與陰性對照植株相比，GhMAPKKK2基因沉默棉株的葉片黃化、植株萎蔫程度更加嚴(yán)重， 健康狀況明顯差于陰性對照植株（圖4A）； 病情指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，GhMAPKKK2基因沉默植株的病情指數(shù)為57，顯著高于陰性對照植株的32 （圖4B）； 剖稈檢測試驗結(jié)果顯示，GhMAPKKK2基因沉默植株莖稈的褐變程度明顯重于陰性對照植株（圖4C）；莖段恢復(fù)培養(yǎng)試驗結(jié)果顯示，GhMAPKKK2基因沉默植株的莖段在培養(yǎng)基上長出的真菌菌絲數(shù)量明顯多于陰性對 照 植 株 （圖4D）。 以 上 結(jié) 果 表 明， 沉 默GhMAPKKK2基因后顯著降低了棉花對黃萎病菌的抗性，GhMAPKKK2基因可能是棉花抗黃萎病反應(yīng)的一個正調(diào)控因子。

圖4 GhMAPKKK2 基因沉默植株的抗病性鑒定Fig. 4 Disease resistance identification of GhMAPKKK2 gene silencing plants

2.5 VIGS 植株中JA 和SA 激素傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達分析

為抵御病原菌侵染，植物進化出了多種保護機制，激素調(diào)控是植物防御病原體侵染的一個重要途徑，而JA 和SA 是兩種重要的防御激素，能夠協(xié)助植株抵御病原菌的侵染。 為進一步探究沉默植株對黃萎病抗性減弱的機制，通過qRT-PCR技術(shù)檢測了沉默植株與陰性對照植株在接種黃萎病菌后不同時間段的根部組織中JA 和SA 信號通路相關(guān)基因的表達量。 結(jié)果顯示，在GhMAPKKK2基因沉默植株中，JA 信號通路相關(guān)基因GhAOC的表達量在接菌前（0 h）和接菌后6 h 顯著低于陰性對照植株 （圖5A）；GhPR4的表達量在接菌后6 h、12 h、24 h 和48 h 均顯著低于陰性對照植株（圖5B）；GhPDF1基因的表達量在接菌后6 h、24 h 和48 h 均顯著低于陰性對照植株（圖5C）。 SA 信號通路相關(guān)基因GhNPR1的表達量在接菌后6 h、24 h 和48 h 均顯著低于陰性對照植株 （圖5D）；GhPAD4的表達量在接菌后6 h 和12 h 均顯著低于陰性對照植株 （圖5E）。表明GhMAPKKK2基因可能通過JA 和SA激素信號通路，在棉花抗黃萎病中扮演正調(diào)控的角色。

圖5 黃萎病菌侵染后GhMAPKKK2 基因沉默植株根部JA/SA 信號通路基因表達分析Fig. 5 Analysis of the expression of JA/SA signaling pathway genes in the roots of GhMAPKKK2 gene silencing plants after Verticillium dahliae infection

3 討論

棉花是我國乃至世界重要的經(jīng)濟作物。 黃萎病已逐漸成為制約棉花產(chǎn)量及品質(zhì)的首要生物脅迫因素，而目前對于黃萎病菌的侵染仍缺乏針對性的防控措施， 導(dǎo)致其無法得到有效的控制。傳統(tǒng)雜交育種方法現(xiàn)已無法與現(xiàn)實生產(chǎn)發(fā)展的需求相匹配，因此，挖掘、鑒定棉花抗黃萎病相關(guān)基因并研究其抗病分子機制，對棉花抗病分子育種具有重要意義。

目前在棉花黃萎病抗性基因挖掘方面已取得一定進展，李秀青等[19]利用VIGS 技術(shù)干涉了陸地棉GhAAT基因的表達， 沉默植株的抗病性顯著降低；Zhang 等[20]抑制GbVe1基因表達后顯著增強了植株對黃萎病菌的敏感性；Sun 等[21]抑制GhSWEET42基因表達后增強了棉花對大麗輪枝菌的抗性，過表達該基因則導(dǎo)致抗性減弱，表明該基因是棉花抗黃萎病反應(yīng)的一個負調(diào)控因子。 Hu 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，類GhWRKY1 通過直接激活木質(zhì)素合成相關(guān)基因GhPAL6和GhCOMT1的表達從而參與棉花抗黃萎病反應(yīng)。 近年來還有一些抗性基因如GhWRKY40-like[23]、GhWRKY70[23]、GhDIR[24]、GhROP6[25]、GhADF6[25]、GhBsr-k1[15]、Gh4CL30[26]、GhRDUF4D[27]等被挖掘。

MAPK 級聯(lián)途徑是植物體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)機制之一，廣泛調(diào)控植物對各種逆境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。 目前已有許多研究表明，MAPK 級聯(lián)在植物防御病原體侵染中起著關(guān)鍵作用。如OsMAPK12-1基因正向調(diào)控水稻對白葉枯病和條紋葉枯病的抗性[28]；番茄中SlMAPK3基因參與SA 和JA 信號通路，在抗黃葉卷曲病毒中發(fā)揮著積極作用[29]；Wang 等[30]抑制GhMKK6基因表達后顯著降低了棉花對枯萎病菌的抗性；MAPK 支架蛋白基因GhMORG1可以通過激活MKK6-MKK4 級聯(lián)反應(yīng)增強棉花對尖孢鐮刀菌的抗性[31]；GhMAPK20通過介導(dǎo)GhMKK4-GhMPK20-GhWRKY40 級聯(lián)反應(yīng)，負調(diào)控棉花對尖孢鐮刀菌的抗性[32]。本研究利用實驗室前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)， 獲得了一個MAPK 家族成員GhMAPKKK2，在黃萎病菌脅迫誘導(dǎo)下，其表達量呈上調(diào)趨勢；利用VIGS 技術(shù)沉默該基因表達，沉默植株對黃萎病菌的敏感性明顯增強。 以上結(jié)果初步表明GhMAPKKK2基因作為一個正調(diào)控因子，參與棉花抗黃萎病反應(yīng)。

作為植物免疫的中樞調(diào)節(jié)因子，激素在植物抗病信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用， 其中SA 和JA 途徑是目前研究最多的兩條激素防御途徑[33-34]。已有許多研究表明，部分抗病基因通過SA 和JA信號途徑參與調(diào)控植株的抗病反應(yīng)。 Xiong 等[35]利用VIGS 技術(shù)沉默GhGDH2基因后激活了JA和SA 信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達， 從而增強了棉花的抗病性；Long 等[36]抑制GbMPK3基因的表達后顯著降低了植株對大麗輪枝菌的敏感性， 沉默植株中SA 途徑相關(guān)基因的表達量顯著上調(diào)；Feng 等[37]從陸地棉中鑒定出一個響應(yīng)SA和JA 的植物細胞壁相關(guān)受體樣激酶基因GhWAKL， 抑制其表達后降低了植株體內(nèi)的SA含量， 同時增強了植株對大麗輪枝菌的敏感性；Zhu 等[38]通過抑制GhRPS6基因的表達，降低了植株體內(nèi)SA 和JA 的含量繼而減弱了棉花的抗病性；Chen 等[39]抑制GhGPA表達后增強了棉花對黃萎病的敏感性， 同時下調(diào)了SA 與JA 信號通路中相關(guān)基因的表達；Gao 等[40]利用VIGS 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)SA 與JA 通路之間的重要調(diào)節(jié)因子GbSSI2在棉花抗黃萎病反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。 此外GhBLH7-D06 可靶向結(jié)合GhPAL-A06的啟動子區(qū)域從而抑制其表達，最終通過抑制木質(zhì)素的生物合成和JA 信號傳導(dǎo)途徑來負調(diào)控棉花對黃萎病的抗性[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，GhMAPKKK2基因在外源JA 誘導(dǎo)下整體呈上調(diào)表達趨勢，而在外源SA 誘導(dǎo)下整體呈下調(diào)表達趨勢， 表明GhMAPKKK2基因響應(yīng)外源JA 和SA 處理。 在黃萎病菌脅迫處理后， 與陰性對照植株相比，GhMAPKKK2基因沉默植株中JA 信號通路基因GhPR4、GhPDF及GhAOC和SA 信號通路基因GhNPR1和GhPAD的表達量均顯著下調(diào)。 表明GhMAPKKK2基因可能參與了JA 和SA 信號通路，進而作為一個正調(diào)控因子參與棉花抗黃萎病反應(yīng)。 本研究利用反向遺傳學(xué)的方法，初步證明了GhMAPKKK2是一個抗黃萎病的正調(diào)控基因， 為培育棉花抗病新種質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)，同時也為棉花抗病遺傳育種提供了靶標(biāo)基因。

4 結(jié)論

根據(jù)實驗室前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從陸地棉中克隆了1 個促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPKKK2， 該基因CDS 長度為1 341 bp，編碼446 個氨基酸， 進化樹分析顯示該蛋白與GrMAPKKK2 同源性最高。GhMAPKKK2基因響應(yīng)黃萎病菌及外源JA、SA 激素處理。 利用VIGS技術(shù)沉默其表達后增強了棉花對黃萎病菌的敏感性，病情指數(shù)統(tǒng)計、剖稈檢測及莖段恢復(fù)培養(yǎng)等試驗表明GhMAPKKK2基因沉默植株的抗病性顯著弱于陰性對照植株。qRT-PCR 檢測結(jié)果表明GhMAPKKK2基因可能參與JA 和SA 信號通路，繼而在棉花抗黃萎病反應(yīng)中作為一個正調(diào)節(jié)因子。