宋桂華，周瓊閣，張 巖，管志偉，呂偉剛 ，郭彥榮，張冰雪，彭明浩

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病，規(guī)范治療3～6個(gè)月仍不能達(dá)到良好控制的哮喘稱之為難治性哮喘，激素抵抗是難治性哮喘的主要原因之一[1-2]。難治性哮喘占支氣管哮喘的5%～10%，不僅嚴(yán)重影響兒童的身心健康及生活質(zhì)量，還給家庭和社會(huì)帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3-4]。核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(nuclear transcription factor activator protein-1，AP1)蛋白產(chǎn)物c-jun的表達(dá)與激素抵抗型哮喘的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著密切的關(guān)系，因其可能參與降低糖皮質(zhì)激素的抗炎活性而致糖皮質(zhì)激素抵抗，從而發(fā)展為難治性哮喘[5-6]。研究[7-9]表明，中醫(yī)藥治療難治性哮喘有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已成為研究熱點(diǎn)。課題組綜合多年來臨床治療兒童難治性哮喘的經(jīng)驗(yàn)，基于痰瘀互結(jié)之理論，創(chuàng)立蘇葶平喘湯，臨床療效顯著，但缺乏客觀依據(jù)來驗(yàn)證。故本研究通過建立難治性哮喘小鼠模型研究蘇葶平喘湯對(duì)難治性哮喘小鼠肺部病理改變及肺組織c-jun表達(dá)的影響，探討蘇葶平喘湯治療兒童難治性哮喘的作用機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

無特定病原體(specified pathogen free，SPF) 級(jí)BALB/C雌性小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[許可證號(hào)SCXK(魯)20140007]，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為37009200016677。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于河南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房[許可證號(hào)SYXK(豫)2019-0001]完成。本研究獲得河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(審批編號(hào)20180829001)。 動(dòng)物購(gòu)買后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品、試劑與儀器

蘇葶平喘湯組成：紫蘇子10 g，葶藶子10 g，蜜紫菀10 g，款冬花10 g，浙貝母10 g，姜半夏10 g，膽南星10g，橘紅6 g，茯苓10 g，地龍6 g，赤芍6 g，川芎6 g，甘草片 6 g。藥材由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。所有藥材經(jīng)浸泡、煎熬、過濾，濃縮成100 mL藥汁，1 mL含0.71 g生藥。將藥汁裝入已消毒容器中，置于4 ℃冰箱保存。地塞米松注射液，2 mL∶5 mg，河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司產(chǎn)品,批號(hào)21901131；氯化鈉注射液，500 mL∶4.5 g，河南科倫藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號(hào)A18121804-1。卵清蛋白(OVA)Grand Ⅴ、Grand Ⅱ，Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)依次為SLBK6455V，SLBP0782V；氫氧化鋁 [AL(OH)3]粉，500 g/瓶，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20180902；水合氯醛，鄭州派尼化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號(hào)180408；40 g/L多聚甲醛通用型組織定液,武漢賽維爾生物有限公司產(chǎn)品，批號(hào)YP184309；c-jun試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)PSHNDEFJE3；總核糖核酸(RNA)提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)R1200；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega公司產(chǎn)品，批號(hào)0000280839；熒光定量試劑，Roche公司產(chǎn)品，批號(hào)06402712001；引物，上海生物工程有限公司產(chǎn)品。NE-C900型霧化吸入器，歐姆龍有限公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡，德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品；DFC420型彩色冷CCD及圖像分析系統(tǒng)，德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品；ST360型酶標(biāo)儀，上?？迫A生物工程股份有限公司；MY-10型手持式組織研磨器，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品； NanoDroP2000型微量核酸測(cè)量?jī)x，美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；LCZ480型熒光定量PCR儀，美國(guó)羅氏診斷產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；無酶離心管，愛思進(jìn)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組及模型的建立

將50只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、蘇葶平喘湯組、地塞米松組，蘇葶平喘湯和地塞米松組，每組10只。按照參考文獻(xiàn)[10-11]復(fù)制難治性哮喘小鼠模型，分為致敏和激發(fā)兩個(gè)過程：致敏期2周，激發(fā)期從第3周開始，維持共11周。造模完成，經(jīng)組織病理學(xué)鑒定模型制備成功。

1.4 治療方法

自激發(fā)第7周起，各組進(jìn)行如下處理。蘇葶平喘湯組：灌胃蘇葶平喘湯水煎劑16.68 g/(kg·d)(按正常人體劑量9.1倍進(jìn)行折算)，并腹腔注射0.5 mL生理鹽水。地塞米松組：灌胃生理鹽水0.5 mL；并給予地塞米松1 μg/(g·d)，腹腔注射 0.5 mL。蘇葶平喘湯和地塞米松組：灌胃蘇葶平喘湯水煎劑16.68 g/kg；并給予地塞米松針1 μg/(g·d)，腹腔注射0.5 mL?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組給予等量生理鹽水進(jìn)行灌胃和腹腔注射。各組均1 d 1次，連續(xù)3周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

末次給藥24 h內(nèi)給予各組小鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 g/L的水合氯醛(10 μL/g體質(zhì)量)進(jìn)行麻醉，快速眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，立即摘取肺組織。取全血置于普通試管內(nèi)，靜置2 h后，離心半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，取上清液于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ⌒∈笞蠓谓M織，以40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)制備病理切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。取右肺放入無酶的微型離心管中，置于-80 ℃冰箱內(nèi)，以備逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)。200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理學(xué)改變，以實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)c-jun表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

在實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠共死亡3只。蘇葶平喘湯組死亡1只，發(fā)生在造模過程中，考慮為難治性哮喘急性發(fā)作所致。蘇葶平喘湯和地塞米松組死亡2只，其中1只在灌胃后死亡，考慮灌胃過程中操作失當(dāng)而致；另外1只小鼠考慮長(zhǎng)期腹腔注射導(dǎo)致腹腔感染而致。

2.1 肺組織病理學(xué)改變

空白對(duì)照組小鼠肺組織未見炎性改變。模型對(duì)照組支氣管管壁厚度增加，支氣管管壁及周圍均可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔狹窄，形狀不規(guī)則，管腔內(nèi)可見大量黏液分泌。3個(gè)藥物組較模型對(duì)照組支氣管病變減輕，以地塞米松組+蘇葶平喘湯組最優(yōu)。見圖1。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的表達(dá)

2.2.1 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的擴(kuò)增曲線

見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的擴(kuò)增曲線圖

2.2.2 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的溶解曲線

見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的溶解曲線圖

2.2.3 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的表達(dá)

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組c-Jun mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，3個(gè)藥物組的c-Jun mRNA表達(dá)減少(P<0.05)。3個(gè)藥物組的c-Jun mRNA組間對(duì)比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的表達(dá)

3 討 論

美國(guó)科學(xué)家Lee等[12]首次發(fā)現(xiàn)了核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(Nuclear transcription factor activator protein-1，AP1)，并鑒定其為轉(zhuǎn)錄因子。AP1是Jun、Fos、ATF和MAF形成的同源或異源二聚體[13]，其中最為穩(wěn)定的AP1二聚體形式是由c-Fos和c-Jun組成的[14]。在正常情況下，AP1的蛋白水平和活性很低。當(dāng)受到外來刺激(如生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)介質(zhì)激素及環(huán)境壓力等)時(shí)，AP1被激活，可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多個(gè)調(diào)節(jié)過程[15]，對(duì)免疫炎癥性疾病[16-17]的發(fā)生發(fā)展起重要作用。具體來說，AP1可通過調(diào)控先天性免疫系統(tǒng)的活性，與其他家族的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，調(diào)控原始T細(xì)胞分化，與糖皮質(zhì)激素受體相互作用或通過反式抑制等方式來參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[18]。哮喘作為一種氣道慢性炎癥性疾病，可使AP1的活性增強(qiáng)，而糖皮質(zhì)激素作為機(jī)體重要的應(yīng)激激素和臨床常用的抗炎、抗免疫藥物，可下調(diào)AP1的表達(dá)。難治性哮喘以病情反復(fù)、難以控制為主要特點(diǎn)，是一種吸入中高劑量糖皮質(zhì)激素等藥物足劑量足療程仍不能達(dá)到良好控制的哮喘，其糖皮質(zhì)激素抵抗作用受糖皮質(zhì)激素受體、轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、P糖蛋白及巨噬細(xì)胞游走抑制因子的影響[19]。其中AP1對(duì)難治性哮喘患者糖皮質(zhì)激素抵抗作用的影響主要體現(xiàn)在：①AP1的過度活化可影響JNK/AP-1信號(hào)通路，阻斷糖皮質(zhì)激素受體與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)單元及其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，發(fā)揮抑制作用[20];②抑制了糖皮質(zhì)激素抗膠原生成的作用，使成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原增多，加重了氣道重構(gòu)，使支氣管壁硬化，減弱了糖皮質(zhì)激素的治療作用[21]。

蘇葶平喘湯為自擬方，由蘇葶丸合滌痰湯化裁而來，輔以活血化瘀之赤芍、川芎、地龍?！夺t(yī)宗金鑒》曰：“痰飲壅逆因作喘，痰飲蘇草滾痰從，停飲喘急不得臥，瀉飲降逆蘇葶功?！碧K葶丸由紫蘇子、葶藶子組成，治療急性支氣管炎和哮喘療效確切[22-25]。滌痰湯是中醫(yī)治療痰證的一首古方，在《奇效良方》及《證治準(zhǔn)繩》中均有記載[26]，由膽南星、半夏、枳實(shí)、茯苓、橘紅、石菖蒲、人參、竹茹、甘草組成。該方本為中風(fēng)后痰迷心竅而用，古方今用，被用于支氣管炎哮喘的治療，對(duì)抑制氣道重塑、緩解氣道炎癥反應(yīng)有積極作用[27]。

方中紫蘇子主治咳逆痰喘，潤(rùn)心肺，尤能下氣定喘，止嗽消痰，利膈寬胸，溫中開郁。葶藶子滑潤(rùn)而香，瀉肺定喘。肺為水源，葶藶子不僅能瀉肺氣還能瀉肺水。紫蘇子與葶藶子共為君藥。紫菀、款冬花降氣平喘，疏利開通，以利肺氣；浙貝母清熱化痰，開宣肺氣。半夏辛溫性燥，能燥濕化痰，和胃降逆；膽南星、橘紅可加強(qiáng)半夏燥濕化痰的作用，且橘紅有理氣行滯之功，與半夏合用體現(xiàn)了治痰先理氣、氣順則痰消的治療理念。肺脾不足，風(fēng)邪乘之，而痰壅其經(jīng)絡(luò)。茯苓益氣補(bǔ)脾，以杜絕生痰之源。以上各藥共為臣藥。地龍性走竄，搜風(fēng)剔絡(luò)以止咳平喘?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，地龍可抑制肺組織平滑肌肌動(dòng)蛋白及纖維連接蛋白，松弛氣管平滑肌，改善氣道纖維化，防止氣道重塑，其有效成分琥珀酸和次黃嘌呤具有平喘止咳的功效[28-29]。赤芍、川芎活血化瘀，可消除肺微血管痙攣，改善局部微循環(huán)，減輕肺纖維化[30-31]。地龍、赤芍、川芎為佐藥。甘草既可助茯苓益氣健脾，又可調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏祛痰通絡(luò)、活血化瘀之功，組方精煉，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，升中有降，開中有合，寒溫得宜，使宣降得復(fù)、痰飲得消、瘀血得散，喘證自平。

本研究結(jié)果證實(shí)了蘇葶平喘湯能有效抑制激素抵抗型哮喘小鼠體內(nèi)AP1產(chǎn)物c-Jun的表達(dá)，并能改善肺部炎癥的浸潤(rùn)，揭示了該方治療激素抵抗型哮喘的主要作用機(jī)制，為中醫(yī)藥更好治療哮喘提供了科學(xué)依據(jù)。