申庸凡, 李志軍, 達(dá)云萌, 尹 克, 任貴云

(1. 河北省眼科醫(yī)院 口腔科, 河北 邢臺(tái), 054000; 2. 河北醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 口腔科, 河北 邢臺(tái), 054000;3. 河北省口腔醫(yī)院 口腔科, 河北 石家莊, 050000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有較高的病死率[1]。雖然OSCC在中國(guó)的發(fā)病率低于印度、日本等國(guó)家，但仍不可忽視[2]。OSCC患者5年生存率在50% 左右，且多數(shù)患者確診時(shí)已至中晚期[3]。目前，組織病理學(xué)是診斷OSCC的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在一些限制，如易受取樣部位、活檢方法等因素影響。DNA啟動(dòng)子甲基化是一種被廣泛研究的表觀遺傳現(xiàn)象，其通過(guò)改變基因表達(dá)而不影響DNA序列參與癌變進(jìn)程。異常的啟動(dòng)子甲基化也是OSCC早期分子事件之一[4]。Dickkopf-1(DKK-1)蛋白是Wnt/β-catenin腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制蛋白之一，在各種纖維性疾病和腫瘤組織中表達(dá)異常[5], 但DKK-1在OSCC發(fā)病和進(jìn)展中的作用尚不清楚。本研究旨在檢測(cè)口腔組織活檢標(biāo)本、口腔上皮細(xì)胞標(biāo)本中DKK-1蛋白表達(dá)和基因啟動(dòng)子甲基化水平，以確定其鑒別病變的能力，并為OSCC的早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究在開(kāi)展前已得到評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)。選取2018年4月—2021年3月診斷為OSCC(國(guó)際疾病分類ICD-10-CM)的患者作為OSCC組研究對(duì)象(n=67)。納入標(biāo)準(zhǔn): 患者根據(jù)既往疾病史、臨床表現(xiàn)和病理檢查診斷為來(lái)源于口腔頰部OSCC, 無(wú)局部封閉、手術(shù)切除、放療和化療等沒(méi)有腫瘤特異性治療史; 年齡>18歲并簽署書(shū)面知情同意書(shū)者。排除標(biāo)準(zhǔn): 合并其他口腔疾病的患者，如口腔扁平苔蘚、口腔白斑，以及嚴(yán)重全身性疾病者。取30例阻生智齒患者的健康口腔黏膜組織作為健康對(duì)照組。另外取30例口腔黏膜下纖維病變(OSF)者行頰黏膜活檢時(shí)的組織標(biāo)本作為癌前病變組。記錄病史和生活習(xí)慣，包括咀嚼檳榔習(xí)慣、高血壓、糖尿病及其他全身性疾病。健康對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn): 沒(méi)有口腔黏膜疾病或其他嚴(yán)重的全身性疾病者。癌前病變組納入標(biāo)準(zhǔn): 口腔黏膜下纖維索觸診和(或)黏膜蒼白變化，但這些變化并不滿足其他疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)(包括癌變)，也沒(méi)有口腔疾病治療史或任何全身性疾病者。

1.2 樣本采集

用口腔拭子(OS)收集所有患者的口腔上皮細(xì)胞: 一個(gè)拭子用于收集病變部位的細(xì)胞，另一個(gè)用于收集對(duì)側(cè)黏膜的細(xì)胞。口腔上皮細(xì)胞收集于磷酸鹽緩沖生理鹽水中。所有樣本于24 h內(nèi)送往化驗(yàn)室進(jìn)行甲基化檢測(cè)。此外，所有OSCC患者的組織標(biāo)本均來(lái)自于外科手術(shù)切除。

1.3 組織DKK-1蛋白表達(dá)檢測(cè)

對(duì)石蠟包埋組織進(jìn)行 4 μm連續(xù)切片，檸檬酸鹽緩沖液加熱至95 ℃, 20 min抗原修復(fù)，雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min, 羊血清封閉30 min, 滴加DKK-1一抗工作液(1∶200, 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司), 4 ℃孵育過(guò)夜，羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h, DAB 顯色(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司) 1 min, 風(fēng)干后封片，光學(xué)顯微鏡下(放大400倍)觀察免疫組化檢測(cè)結(jié)果。用染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比2項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)結(jié)果。染色強(qiáng)度評(píng)分: 陰性=0分，弱=1分，中度=2分，強(qiáng)=3分; 陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分: ≤10%陽(yáng)性細(xì)胞=0分, >10%～25%陽(yáng)性細(xì)胞=1分, >25%～50%陽(yáng)性細(xì)胞=2分, >50%陽(yáng)性細(xì)胞=3分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比總評(píng)分為0～1分為陰性, >1分為陽(yáng)性。

1.4 組織和OS標(biāo)本中DKK-1基因甲基化狀態(tài)檢測(cè)

首先利用QIAamp DNA Mini Kit(德國(guó)Qiagen公司)從樣本中提取基因組DNA(gDNA), 并用NanoDrop 2000c紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定濃度?；谥貋喠蛩猁}轉(zhuǎn)化的方法檢測(cè)基因甲基化狀態(tài)，利用EpiTect重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)將500 ng gDNA進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾，并進(jìn)行定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(qMSP)。利用TaqMan探針和LightCycler 480高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Roche applied science公司)對(duì)DKK-1進(jìn)行檢測(cè): 95 ℃預(yù)變性10 min, 隨后50個(gè)循環(huán)(95 ℃變性10 s, 60 ℃退火40 s, 40 ℃延伸40 s)。COL2A1作為內(nèi)參基因進(jìn)行定量，當(dāng)內(nèi)參基因Cp>35時(shí)，反應(yīng)無(wú)效。最后利用ΔCp(Cp靶基因-CpCOL2A1)預(yù)估DKK-1基因的甲基化水平。甲基化指數(shù)(MI)=2-ΔCp×10 000。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件用于分析數(shù)據(jù),DKK-1基因MI不符合正態(tài)性檢驗(yàn)，表示為中位值(四分位值)，進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織標(biāo)本與OS標(biāo)本中DKK-1基因甲基化水平進(jìn)行Spearman相關(guān)系數(shù)分析。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，并分析曲線下面積(AUC)、靈敏度及特異度。

2 結(jié) 果

2.1 各組組織中DKK-1蛋白表達(dá)情況

DKK-1蛋白主要定位于基底層上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)(圖1A)。與健康對(duì)照組(93.33%, 28/30)相比，癌前病變組(66.67%, 20/30)和OSCC組(20.90%, 14/67)DKK-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=48.521,P<0.001); 此外, OSCC組腫瘤組織中DKK-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于癌前病變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.068,P<0.001), 見(jiàn)圖1。

A: 健康對(duì)照組、癌前病變組、OSCC組組織中DKK-1蛋白表達(dá)情況(放大倍數(shù)100倍); B: OSCC腫瘤組織DKK-1蛋白陰性表達(dá)(0～1分)和陽(yáng)性表達(dá)(>1分)(放大倍數(shù)200倍)。圖1 免疫組化法檢測(cè)各組組織中DKK-1蛋白表達(dá)情況

2.2 各組組織和OS標(biāo)本中DKK-1基因啟動(dòng)子甲基化水平

無(wú)論是組織標(biāo)本還是OS標(biāo)本，癌前病變組和OSCC組DKK-1基因甲基化水平均高于健康對(duì)照組，且OSCC組DKK-1基因甲基化水平高于癌前病變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見(jiàn)表1。此外，癌前病變組和OSCC組患者病變同側(cè)OS標(biāo)本中DKK-1基因甲基化水平高于病變對(duì)側(cè)標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。經(jīng)Spearman相關(guān)系數(shù)分析，組織標(biāo)本與OS病變同側(cè)標(biāo)本中DKK-1基因甲基化水平呈正相關(guān)性(rs=0.672,P<0.001), 見(jiàn)圖2。

表1 健康對(duì)照組、癌前病變組、OSCC組組織和OS標(biāo)本中DKK-1基因啟動(dòng)子甲基化水平[M(P25, P75)]

圖2 組織標(biāo)本與OS病變同側(cè)標(biāo)本中DKK-1基因甲基化水平Spearman相關(guān)系數(shù)分析

2.3 OSCC組織中DKK-1蛋白表達(dá)和基因甲基化水平的關(guān)系

DKK-1蛋白陰性表達(dá)組織中基因甲基化水平[3.150(1.987, 6.070)]高于陽(yáng)性表達(dá)組織的[1.073(0.950, 1.160)], 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.653,P<0.001)。

2.4 ROC曲線分析

組織和OS病變同側(cè)標(biāo)本中DKK-1基因甲基化水平用于鑒別診斷OSCC和癌前病變的AUC分別為0.799(95%CI: 0.713～0.884,P<0.001)、0.843(95%CI: 0.762～0.924,P<0.001), 經(jīng)Z檢驗(yàn), 2種標(biāo)本AUC比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 組織標(biāo)本和OS病變同側(cè)標(biāo)本中DKK-1基因甲基化水平診斷OSCC和癌前病變的ROC曲線分析

2.5 分層分析

利用病變同側(cè)和對(duì)側(cè)OS標(biāo)本DKK-1基因甲基化數(shù)據(jù)對(duì)OSCC病變病理特征進(jìn)行診斷。當(dāng)進(jìn)行年齡、性別、吸煙史、飲酒史、T分期、N分期、骨質(zhì)侵犯的分層分析時(shí),AUC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 表明DKK-1基因甲基化可能不受上述因素影響。而基于腫瘤分期和腫瘤分化程度進(jìn)行分層分析時(shí),AUC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 DKK-1基因甲基化水平在OS標(biāo)本中不同亞組間比較

3 討 論

OSCC可起源于口腔中的任何組織，其惡性程度較高，預(yù)后較差, 5年生存率只有41.0%～79.5%[6-7]。近年來(lái)，流行病學(xué)研究[8]顯示，中國(guó)OSCC發(fā)病呈增加和年輕化趨勢(shì)，并引起廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn),DKK-1基因高甲基化檢測(cè)有望成為OSCC早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。由于ROC曲線分析已被廣泛應(yīng)用于診斷方法學(xué)的行為分析，因此利用ROC曲線分析，證實(shí)在組織或OS標(biāo)本中,DKK-1基因甲基化水平可用于OSCC和OSF患者的鑒別診斷。此外，這些差異不受年齡、性別、吸煙史、飲酒史以及腫瘤N分期、T分期、骨質(zhì)侵襲等因素的影響。而中晚期OSCC患者OS標(biāo)本中DKK-1基因高甲基化更普遍，證明OS標(biāo)本中病變部位DKK-1基因甲基化水平足以反映OSCC患者腫瘤組織標(biāo)本中DKK-1基因甲基化狀態(tài)和DKK-1蛋白表達(dá)水平，且可用于OSCC的早期診斷。

DKK-1屬于DKK家族，作為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6共受體的抑制配體, DDK-1阻斷其與Wnt的相互作用，從而導(dǎo)致β-catenin降解, DDK-1已被鑒定為抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分泌蛋白[9]。研究[10]證實(shí)，與正常對(duì)照細(xì)胞相比，口腔鱗狀細(xì)胞中DKK-1表達(dá)頻繁上調(diào)，然而作者并未進(jìn)一步利用臨床標(biāo)本證實(shí)DKK-1與疾病進(jìn)展的關(guān)系。DDK1表達(dá)降低被認(rèn)為是Wnt/β-catenin 通路異常激活的機(jī)制之一。眾所周知, Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)生、器官發(fā)生和體內(nèi)平衡中發(fā)揮著重要作用。這一信號(hào)級(jí)聯(lián)是許多正常生理過(guò)程所必需的，如細(xì)胞增殖、組織再生、胚胎發(fā)育和許多其他系統(tǒng)和局部效應(yīng)，其可以在不同的水平上被調(diào)節(jié)[11]。因此，通路的缺陷可能會(huì)導(dǎo)致一些復(fù)雜的效應(yīng)。研究[12-15]發(fā)現(xiàn)DKK-1異位表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，或通過(guò)凋亡促進(jìn)因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。DKK-1在許多腫瘤中(肝癌等)低表達(dá)，但在其他腫瘤中(非小細(xì)胞肺癌、食管鱗癌等)過(guò)表達(dá)，說(shuō)明DKK-1在不同腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著復(fù)雜而不同的作用。因此，在人類多種癌癥的研究中, DKK-1被認(rèn)為是診斷和預(yù)后的一種很有前途的生物標(biāo)志物。本研究首先證實(shí)DKK-1蛋白在健康對(duì)照組織上皮細(xì)胞細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)烈，而在OSF和OSCC組織中表達(dá)顯著減弱。這說(shuō)明DKK-1在口腔黏膜組織中表達(dá)下調(diào)，可能是影響OSF發(fā)病和惡性轉(zhuǎn)化的重要分子機(jī)制。

異常的啟動(dòng)子甲基化被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵事件。不同的Wnt信號(hào)在OSCC和OSF組織中發(fā)生高甲基化，如Wnt-抑制因子-1[16]。在本研究中,DKK-1基因甲基化水平在健康的口腔黏膜中較低，但在 OSF和OSCC癌組織中較高，這提示DKK-1基因甲基化異?？赡苁桥c抑制DKK-1基因表達(dá)或下調(diào)DKK-1蛋白表達(dá)有關(guān)，進(jìn)而阻斷了DKK-1對(duì)Wnt/β-catenin通路的抑制，導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路的異常激活，這在OSF惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用。DNA異常甲基化已被報(bào)道是OSCC的重要致癌機(jī)制。由于甲基化所致的表達(dá)異常是可逆的，可以使用去甲基化藥物使甲基化沉默基因重新表達(dá)，因此深入研究口腔癌抑制基因甲基化也將會(huì)為口腔癌的預(yù)防和治療提供新思路。

組織病理學(xué)是目前世界范圍內(nèi)診斷OSCC的黃金標(biāo)準(zhǔn)[17], 然而一般來(lái)說(shuō)，常規(guī)活組織檢查至少需要4～5 d, 且屬于侵入性手段。此外其他診斷手段，如DNA倍體分析和亞甲藍(lán)染色等也有一定的臨床應(yīng)用局限性[18]。相比之下，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR結(jié)合口腔采樣拭子技術(shù)檢測(cè)DNA甲基化是一種相對(duì)簡(jiǎn)單、客觀、耗時(shí)短、應(yīng)用廣泛、非侵入性的分子生物學(xué)技術(shù)。與活檢檢查相比, OS標(biāo)本甲基化檢測(cè)可能成本較高，因其需要特定的試劑和儀器來(lái)完成工作，但是隨著該技術(shù)的普及，成本將會(huì)迅速降低。因此，考慮到該技術(shù)的有效性和可行性，檢測(cè)OS標(biāo)本DNA甲基化顯示出作為OSCC早期輔助診斷手段的巨大潛力，特別是對(duì)于不適合進(jìn)行手術(shù)或活檢的特定人群。在亞組分析中，年齡、性別、吸煙史、飲酒史等環(huán)境因素的暴露基本不會(huì)影響DNA甲基化的檢測(cè)。由于環(huán)境暴露(包括生活方式和飲食習(xí)慣)可能在中國(guó)不同地理區(qū)域內(nèi)有很大的差異性，未來(lái)鼓勵(lì)進(jìn)行更多有針對(duì)性的研究。

綜上所述，從病變部位采集的OS標(biāo)本中檢測(cè)到DKK-1基因甲基化狀態(tài)可充分反映腫瘤組織樣本中DKK-1基因的甲基化水平和DKK-1蛋白表達(dá)情況，并且OS標(biāo)本中DKK-1基因高甲基化可用于OSF癌變監(jiān)測(cè)以及OSCC的早期診斷，其有望成為臨床上一種非侵入性和替代或輔助性的診斷工具。