段飛揚(yáng)，王力，詹曉北，蔣蕓，李志濤，高敏杰*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(江蘇艾津作物科技集團(tuán)有限公司，江蘇 南京，211511)

結(jié)冷膠是少動(dòng)鞘氨醇單胞菌所產(chǎn)的多糖，其分子骨架由β(1→3)-D-葡萄糖、β(1→4)-D-葡萄糖醛酸、β(1→4)-D-葡萄糖和α(1→4)-L-鼠李糖線性四糖重復(fù)單元按摩爾比1∶1∶1∶1聚合組成，分子質(zhì)量達(dá)0.5×106～1×106Da[1-3]。結(jié)冷膠寡糖可由結(jié)冷膠降解得到，具有益生活性[4]、植物誘導(dǎo)抗病性[5]、提高免疫活性[6]等生物學(xué)功能，其制備具有重要意義。寡糖一般通過物理、化學(xué)、生物(酶)法降解多糖制備，比較3類方法，酶法特異性強(qiáng)，產(chǎn)物均一，是較理想的方法[7]。目前，缺乏有效降解結(jié)冷膠的酶是結(jié)冷膠及其寡糖應(yīng)用的最大障礙。

結(jié)冷膠裂解酶(EC 4.2.2.25,gellan lyase)特異性裂解結(jié)冷膠主鏈的糖苷鍵，釋放非還原端為不飽和葡萄糖醛酸的葡萄糖醛基-葡萄糖基-鼠李糖基-葡萄糖四糖單元[8]。MIYAKE等[9]對(duì)來自Bacillussp.GL1的結(jié)冷膠裂解酶在大腸桿菌中胞內(nèi)表達(dá)，并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行了研究。通過基因工程技術(shù)獲得重組的功能蛋白，是進(jìn)行工業(yè)用高效蛋白生產(chǎn)的重要途徑[10]。除大腸桿菌，目前研究比較深入的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)還有枯草芽胞桿菌和畢赤酵母(Pichiapastoris)等[11]。較其他表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)宿主遺傳性能穩(wěn)定、表達(dá)外源蛋白分泌效率高、產(chǎn)物便于分離純化、誘導(dǎo)型菌株具有較完善的發(fā)酵策略，應(yīng)用廣泛[12]。在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，醇氧化酶AOX1基因強(qiáng)啟動(dòng)子最為常用，受甲醇嚴(yán)格調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白，能達(dá)到很高的生產(chǎn)水平[13]。

本研究首次應(yīng)用畢赤酵母構(gòu)建表達(dá)Bacillussp.GL1來源結(jié)冷膠裂解酶基因，誘使結(jié)冷膠裂解酶胞外分泌，發(fā)酵擴(kuò)大生產(chǎn)。經(jīng)分離純化，重組結(jié)冷膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)被測(cè)定，并利用其對(duì)結(jié)冷膠進(jìn)行降解，這是對(duì)獲得大量結(jié)冷膠裂解酶用于寡糖制備和工業(yè)應(yīng)用的初步探索，為進(jìn)一步開發(fā)利用結(jié)冷膠資源，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌JM109、畢赤酵母GS115及分泌型酵母表達(dá)載體pPIC9K均購自美國Invitrogen公司，并保藏于糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑與儀器

限制性核酸內(nèi)切酶(EcoR Ⅰ、NotⅠ和SalⅠ)、DL-10 000 DNA Marker、SanPrep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒和Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒等，大連TaKaRa公司；酵母粉、蛋白胨、甘油和無水甲醇等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；結(jié)冷膠(食品級(jí))，無錫格萊克斯生物科技有限公司。

Micro Pulser型電轉(zhuǎn)儀、C1000 Touch型PCR儀，美國Bio-Rad公司；3K15型高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；Bio Flo 115型7 L發(fā)酵罐，美國NBS公司；ultrafleXtreme型質(zhì)譜儀，美國Bruker Daltonics公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L)。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖 20(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L)。

MD培養(yǎng)基(g/L)：無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base, YNB)13.4，生物素4×10-5，葡萄糖20，瓊脂20。

MM培養(yǎng)基：YNB 13.4 g/L，生物素40 μg/L，甲醇5 mL/L，瓊脂20 g/L。

BMGY培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，磷酸鉀緩沖液100 mmol/L、pH 6.0，YNB 13.4 g/L，生物素40 μg/L，甘油10 g/L。

BMMY培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，磷酸鉀緩沖液100 mmol/L、pH 6.0，YNB 13.4 g/L，生物素 40 μg/L，甲醇 10 mL/L。

上述培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min或115 ℃滅菌30 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

選取Bacillussp.GL1來源結(jié)冷膠裂解酶基因(GenBank ID:AB006853.1)中已報(bào)道的功能活性區(qū)域(N-terminal gellan lyase, nGL)[9]，根據(jù)畢赤酵母(P.pastorisGS115)的偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成結(jié)冷膠裂解酶基因(nGL1)，獲得商品重組克隆質(zhì)粒pUC57-nGL1。根據(jù)優(yōu)化后的基因序列設(shè)計(jì)引物，分別在引物5′和3′端分別加上EcoR Ⅰ和NotⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。本研究中PCR擴(kuò)增體系所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

pUC57-nGL1溶解稀釋至一定濃度用EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收、純化后，進(jìn)而用T4 DNA連接酶連接到經(jīng)過相同的工具酶線性化載體pPIC9K上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-nGL1(圖1)，并轉(zhuǎn)化到E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中富集。選取含有氨芐抗性LB平板上陽性克隆子，提取質(zhì)粒使用EcoR Ⅰ和NotⅠ進(jìn)行單酶切和雙酶切及菌落PCR鑒定。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid

1.2.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建及驗(yàn)證

鑒定成功的pPIC9K-nGL1經(jīng)SalⅠ酶切線性化后電轉(zhuǎn)化入P.pastorisGS115染色體DNA中，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，以得到轉(zhuǎn)化子。采用MD/MM平板點(diǎn)植對(duì)照法篩選甲醇快速利用型(Mut+)表型，進(jìn)一步通過YPD-遺傳霉素(G418)平板篩選優(yōu)良的表達(dá)菌株[14]。隨機(jī)挑取其單菌落，接種于3 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。以Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取酵母基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后1.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR結(jié)果。PCR鑒定正確的重組菌經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證目的基因整合到酵母基因組中，將測(cè)序正確的菌株命名為P.pastorisGS115-pPIC9K-nGL1并于-40 ℃甘油管中保藏。

1.2.3 重組結(jié)冷膠裂解酶活性的測(cè)定

取適量酶液與Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)混勻，加入終質(zhì)量濃度為0.5 g/L的底物結(jié)冷膠溶液激活反應(yīng)，渦旋振蕩1 min，于45 ℃水浴反應(yīng)20 min后，煮沸10 min滅活。酶活力定義為在1 mL上述反應(yīng)體系條件下，1 min轉(zhuǎn)化底物生成1 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)單位U。二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖濃度[15]。

1.2.4 重組結(jié)冷膠裂解酶的誘導(dǎo)表達(dá)與篩選

參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)操作手冊(cè)[16]，挑取構(gòu)建成功的重組畢赤酵母單菌落接種至50 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=2.0～6.0，4 ℃、4 000×g離心5 min收集菌體。用100 mL BMMY培養(yǎng)基重懸并稀釋至OD600=1.0，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；每隔24 h加入無水甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，發(fā)酵120 h。發(fā)酵結(jié)束菌液4 ℃、8 000×g離心5 min收集上清液測(cè)定酶活力，并用8% SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

1.2.5 重組結(jié)冷膠裂解酶的分離純化

發(fā)酵液上清液于80%飽和硫酸銨鹽析沉降，沉淀物復(fù)溶后4 ℃透析過夜，而后經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex-G100柱層析[17]。層析組分加到預(yù)先經(jīng)Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L, pH 7.0)平衡的DEAE-52纖維素層析柱，用0～0.8 mol/L NaCl溶液(同種緩沖液配制)進(jìn)行線性梯度洗脫，設(shè)置280 nm測(cè)紫外吸光值，分管收集[18]得到純酶液，待處理樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組結(jié)冷膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

最適反應(yīng)溫度測(cè)定。分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃條件下檢測(cè)結(jié)冷膠裂解酶酶活性，設(shè)最高酶活力為100%，計(jì)算各水平條件下相對(duì)酶活力。

溫度穩(wěn)定性檢測(cè)。取等量純酶液置于45、50、55 ℃水浴鍋中溫育，每隔30 min取樣，于冰上冷卻5 min，保持其他反應(yīng)條件不變，計(jì)算相對(duì)酶活力。

最適反應(yīng)pH測(cè)定。保持其他反應(yīng)條件不變，反應(yīng)體系中加入相同體積的pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、9.5的Tris-HCl緩沖液，設(shè)最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

pH穩(wěn)定性檢測(cè)。取等量純酶液用相同體積的pH值為4、5、6、7、8、9、10、11的緩沖溶液懸浮，于4 ℃放置12 h，保持其他反應(yīng)條件不變，隨后計(jì)算相對(duì)酶活力。

金屬離子穩(wěn)定性檢測(cè)。在酶反應(yīng)體系中分別加入0.1 mol/L K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe3+、Mn2+，以不加金屬離子Tris-HCl緩沖液的酶的活性為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.2.7 重組畢赤酵母工程菌的7 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)

接種重組畢赤酵母單菌落于BMGY培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h即得種子液。將2.7 L BMGY培養(yǎng)基加入7 L發(fā)酵罐內(nèi)，經(jīng)滅菌處理后調(diào)節(jié)發(fā)酵體系維持在30 ℃、pH 6.0并穩(wěn)定2 h。隨后加入300 mL種子液。對(duì)發(fā)酵罐的通氣量和轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)節(jié)，維持溶氧在20%上下，培養(yǎng)20～24 h，使得發(fā)酵液中的所有甘油被消耗完。此時(shí)進(jìn)入展開甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，調(diào)pH 6.0，并處于30 ℃條件下。利用同時(shí)反饋控制辦法進(jìn)行在線測(cè)定[19]，甲醇質(zhì)量濃度維持在10 g/L。發(fā)酵過程中，每間隔6 h需要對(duì)典型生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和記錄，如生物量和結(jié)冷膠裂解酶活力。

1.2.8 重組結(jié)冷膠裂解酶的裂解產(chǎn)物分析

以低質(zhì)量濃度0.5 g/L的結(jié)冷膠溶液為底物進(jìn)行酶促降解反應(yīng)，每隔30 min取樣，用展開劑(正丙醇∶乙酸∶水=5∶2∶3，體積比)于Merck薄層板(TLC Silica gel 60F 254, 20×20 cm)上將產(chǎn)物分離進(jìn)行薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)分析。為進(jìn)一步鑒定降解產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)束后樣品經(jīng)0.22 μm水系膜過濾器過濾后以2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB)為基質(zhì)，利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)在正離子模式下對(duì)產(chǎn)物寡糖的質(zhì)荷比進(jìn)行分析，以確定結(jié)冷膠寡糖的聚合度[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次平行，測(cè)定參數(shù)取平均值，利用Origin 8.5軟件繪制圖表并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組畢赤酵母的構(gòu)建及篩選

陽性克隆子經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證提取重組質(zhì)粒并分別使用EcoR Ⅰ和NotⅠ進(jìn)行單酶切和雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果如圖2-a，在瓊脂糖凝膠上EcoR Ⅰ或NotⅠ單酶切的產(chǎn)物大小約12 827 bp的單條帶，EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切分別得到3 551 bp的nGL1片段和9 276 bp的線性pPIC9K片段，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-nGL1構(gòu)建成功。

經(jīng)電轉(zhuǎn)、篩選，隨機(jī)選擇8株陽性轉(zhuǎn)化子于YPD液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培，然后取適量菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖2-b，在瓊脂糖凝膠3 551 bp的位置上有明顯條帶即nGL1片段，表明重組質(zhì)粒pPIC9K-nGL1已成功電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115細(xì)胞中，經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序表示基因工程菌重組P.pastorisGS115-pPIC9K-nGL1構(gòu)建成功。

a-重組表達(dá)質(zhì)粒電泳鑒定圖(M-Marker；1-NotⅠ單切； 2-EcoRⅠ單切；3-NotⅠ和EcoRⅠ雙切；4-菌落PCR)； b-重組畢赤酵母電泳驗(yàn)證圖(M-Marker； 1～8-陽性轉(zhuǎn)化子PCR結(jié)果；9-空質(zhì)菌PCR結(jié)果)圖2 重組畢赤酵母的構(gòu)建及驗(yàn)證篩選Fig.2 Construction and validation of recombinant P.pastoris

2.2 重組結(jié)冷膠裂解酶的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

利用ExPASy預(yù)測(cè)本研究中結(jié)冷膠裂解酶分子質(zhì)量約為125 kDa。重組畢赤酵母搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)并測(cè)定酶活力，如圖3-a，篩選得到高酶活力菌株P(guān).pastorisGS115-pPIC9K-nGL1.2酶活力為266.4 U/L。

a-重組結(jié)冷膠裂解酶高酶活菌株篩選 (1～8-陽性轉(zhuǎn)化子；9-空質(zhì)菌)； b-重組結(jié)冷膠裂解酶SDS-PAGE電泳分析(1-空質(zhì)菌上清液； 2、3-重組菌上清；4、5-初步純化后酶液)圖3 重組結(jié)冷膠裂解酶的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定Fig.3 Induced expression and identification of recombinant gellan lyase

用相同方法培養(yǎng)處理空質(zhì)菌P.pastorisGS115-pPIC9K作為空白對(duì)照。分別取適量粗酶液處理進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3-b，P.pastorisGS115-pPIC9K-nGL1.2上清液與空質(zhì)菌對(duì)照相比在分子質(zhì)量75和45 kDa處均有明顯的蛋白表達(dá)帶。進(jìn)一步分離純化重組結(jié)冷膠裂解酶，經(jīng)過SDS-PAGE電泳檢測(cè)，所得純化酶液位置與粗酶液加粗條帶一致，大小正確。但所收集組分未分離開，表現(xiàn)為電泳條帶無單條存在，分析可能是結(jié)冷膠裂解酶發(fā)生降解。

2.3 重組畢赤酵母工程菌的7 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)

對(duì)高酶活力菌株P(guān).pastorisGS115-pPIC9K-nGL1.2進(jìn)行7 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)，結(jié)果如圖4所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，重組畢赤酵母生物量最高達(dá)78.5 g/L，結(jié)冷膠裂解酶酶活力達(dá)954.6 U/L，相比于搖瓶表達(dá)最高酶活力(266.4 U/L)提高了3.58倍。

圖4 重組畢赤酵母7 L發(fā)酵罐發(fā)酵Fig.4 Recombinant P.pastoris fermentation in 7 L bioreactor

2.4 結(jié)冷膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 重組結(jié)冷膠裂解酶反應(yīng)的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

溫度影響酶的空間結(jié)構(gòu)。在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高，酶反應(yīng)速率提高；高溫或低溫都會(huì)降低酶的催化效率，溫度過高甚至引起不可逆的蛋白變性[21]。研究結(jié)果見圖5-a，在30～50 ℃時(shí)，重組結(jié)冷膠裂解酶相對(duì)酶活力超過80%。其中，相對(duì)酶活力在45 ℃時(shí)最高，這與原始菌裂解酶性質(zhì)一致[9]。該重組酶溫度穩(wěn)定性結(jié)果如圖5-b，總體而言，酶活力的降低同保溫時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系；45 ℃下酶活力降低速度相對(duì)較緩，即使放置10 h相對(duì)酶活力依然大于80%。重組酶對(duì)反應(yīng)溫度和保藏溫度要求較高，選擇合適的條件是提高寡糖產(chǎn)量的基礎(chǔ)。

2.4.2 重組結(jié)冷膠裂解酶反應(yīng)的最適pH及pH穩(wěn)定性

pH的改變影響酶分子中具有催化活性的離子基團(tuán)解離程度，從而影響酶的催化能力[22]。由圖5-c可知結(jié)冷膠裂解酶最適pH 7.5，當(dāng)pH值低于7.5時(shí)，酶活力迅速下降，當(dāng)pH值降低到5.0時(shí)相對(duì)酶活力幾近為0。重組酶在弱堿性條件下容易發(fā)揮較大活性，考察重組結(jié)冷膠裂解酶的pH穩(wěn)定性，反應(yīng)結(jié)果如圖5-d所示。從圖中明顯看出結(jié)冷膠裂解酶具有較大的耐堿范圍，這與其最適反應(yīng)pH結(jié)果一致。當(dāng)pH值處于7.0～9.0時(shí)，呈現(xiàn)出較為穩(wěn)定的狀態(tài)，剩余酶活力高于80%，相比于原始菌穩(wěn)定性得到了一定提升[9]?？赡茉蚴钱叧嘟湍傅奶腔δ埽岣吡酥亟M酶的溫度穩(wěn)定性[10]。結(jié)果表明弱堿環(huán)境適合結(jié)冷膠裂解酶降解結(jié)冷膠。

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性；c-最適pH；d-pH穩(wěn)定性；e-金屬離子穩(wěn)定性圖5 重組結(jié)冷膠裂解酶酶學(xué)性質(zhì)Fig.5 Enzymatic properties of recombinant gellan lyase

2.4.3 重組結(jié)冷膠裂解酶反應(yīng)的金屬離子穩(wěn)定性

金屬離子通過與氨基酸殘基結(jié)合，影響酶活力[22]。以不含金屬離子的Tris-HCl緩沖液反應(yīng)體系作為對(duì)照，考察不同金屬離子(K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe3+、Mn2+)對(duì)重組結(jié)冷膠裂解酶酶促反應(yīng)的影響。結(jié)果如圖5-e，K+、Na+對(duì)重組酶酶活力既沒有促進(jìn)作用，也沒有明顯的抑制作用，影響并不大；Zn2+對(duì)重組酶有微弱的促進(jìn)作用，酶活力為對(duì)照組的108.9%；Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe3+和Mn2+對(duì)重組酶則有著不同程度的抑制作用，其中Al3+抑制作用最強(qiáng)，相對(duì)酶活力僅44%。

a-結(jié)冷膠寡糖TLC分析圖(1-葡萄糖標(biāo)品；2-蔗糖標(biāo)品； 3-β-環(huán)糊精標(biāo)品；4～10-30、60、90、120、150、180、0 min 結(jié)冷膠寡糖樣品；11-陰性對(duì)照組)；b-結(jié)冷膠寡糖 MALDI-TOF-MS分析圖圖6 結(jié)冷膠裂解酶降解產(chǎn)物分析Fig.6 Degree of polymerization of gellan oligosaccharide

2.5 結(jié)冷膠裂解酶降解產(chǎn)物分析

應(yīng)用TLC聯(lián)用MALDI-TOF-MS分析結(jié)冷膠裂解酶降解產(chǎn)物。從圖6-a中可以看出，結(jié)冷膠裂解酶降解結(jié)冷膠的產(chǎn)物主要為一種，且隨著時(shí)間的延長，產(chǎn)物的種類沒有明顯的增加。如圖6-b，從降解產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS分析結(jié)果來看，樣品被有效地離子化，得到陽離子化準(zhǔn)分子離子(quasi-molecular ion)峰 [M+Na]+m/z=709.84，與結(jié)冷膠的明顯特征單元?dú)埢呛希袛嘟Y(jié)冷膠的降解產(chǎn)物聚合度大致為4。說明重組結(jié)冷膠裂解酶可以有效降解結(jié)冷膠，具有特異性。根據(jù)結(jié)冷膠分子結(jié)構(gòu)可初步確定該結(jié)冷膠寡糖是非還原端為不飽和葡萄糖醛酸的葡萄糖醛基-葡萄糖基-鼠李糖基-葡萄糖四糖單元，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符[8]。因此，利用畢赤酵母異源表達(dá)的結(jié)冷膠裂解酶可以有效制備聚合度為4的結(jié)冷膠寡糖。

3 結(jié)論

首次成功將經(jīng)優(yōu)化的Bacillussp.GL1來源的結(jié)冷膠裂解酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)，構(gòu)建了重組菌P.pastorisGS115-pPIC9K-nGL1。將重組菌在搖瓶水平誘導(dǎo)表達(dá)，獲得最高酶活力為266.4 U/L。進(jìn)一步在7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度培養(yǎng)，酶活力達(dá)954.6 U/L，較搖瓶水平提高了3.58倍。通過分離純化得到結(jié)冷膠裂解酶純酶并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)展開研究，分析結(jié)果表明結(jié)冷膠裂解酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，當(dāng)溫度大于45 ℃時(shí)酶活力開始迅速下降，在50 ℃以上穩(wěn)定性較差；結(jié)冷膠裂解酶在pH 6.0～7.5內(nèi)酶活力都維持較高的水平，最適反應(yīng)pH 7.5，在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性比較差；Zn2+對(duì)酶活力有促進(jìn)作用，Al3+顯著抑制酶活力。另外，以0.5 g/L結(jié)冷膠為底物，通過酶促降解反應(yīng)生成聚合度為4的結(jié)冷膠寡糖，為其工業(yè)制備提供了一種可行性方案。