尹東杰，陳蕾，董明盛*

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)2(徐州市檢驗(yàn)檢測中心，江蘇 徐州，221000)

與常溫酸奶不同，低溫酸奶沒有殺菌工序，因此需要低溫儲運(yùn)和銷售。低溫酸奶中含有大量活的乳酸菌，且發(fā)酵作用使得酸奶比純鮮奶更易被消化、吸收，因此特別適合乳糖不耐癥患者飲用。酸奶因受到消費(fèi)者的喜愛，成為乳品企業(yè)競相研發(fā)的發(fā)酵乳品類之一[1]。然而，酸奶在加工、運(yùn)輸、儲藏、銷售等過程中極易被微生物污染，導(dǎo)致其在保質(zhì)期內(nèi)產(chǎn)生脹包、鼓蓋、發(fā)霉、口味改變等現(xiàn)象，其中微生物中霉菌的污染最為頻繁嚴(yán)重[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，真菌造成了發(fā)展中國家所有食物浪費(fèi)和損失的5%～10%，其中乳制品如奶酪和酸奶更易受到真菌腐敗的影響[3-4]。因此，研發(fā)安全高效抑制腐敗真菌生長的抑菌劑至關(guān)重要。

然而，使用化學(xué)防腐劑如山梨酸鉀等會引發(fā)消費(fèi)者對健康的擔(dān)憂從而使消費(fèi)者對酸奶的“天然”吸引力降低[5]。乳酸菌代謝物作為天然生物防腐劑具有無毒、無害、抗菌性強(qiáng)、作用廣等優(yōu)點(diǎn)，因而受到越來越多的關(guān)注[4,6]。MORADI等[7]研究表明乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物能夠顯著抑制李斯特菌生長；PILOTE-FORTIN等[8]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生的羅氏菌素(reuterin)對膠紅酵母、黑曲霉、青霉和毛霉菌有強(qiáng)烈抑制作用，其抑制能力與納他霉素相當(dāng)。此外，丙酸桿菌產(chǎn)生的發(fā)酵液提取物能夠抑制腐敗微生物，且其作為防腐劑已應(yīng)用到肉制品中[9-10]。發(fā)酵乳清粉是以植物乳桿菌為主混合發(fā)酵乳清粉，再經(jīng)噴霧干燥等加工工序制成的新型食品防腐保鮮劑。目前發(fā)酵乳清粉在鮮濕面、糕點(diǎn)、肉制品的防腐保鮮應(yīng)用中效果較好，其對細(xì)菌的抑制作用已經(jīng)得到確認(rèn)，但迄今為止未見其對酸奶中霉菌抑制作用的報(bào)道。本研究從126份市售低溫酸奶中分離優(yōu)勢霉菌，研究發(fā)酵乳清粉對它們的抑制作用，并進(jìn)一步將其應(yīng)用到酸奶中測試抑菌效果，為發(fā)酵乳清粉作為生物防霉劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳清粉，河南麥瑞克有限公司。據(jù)該公司自述，發(fā)酵乳清粉是利用自有發(fā)明專利技術(shù)(專利號為：ZLCN201911112283.8)，利用植物乳桿菌為主的混合菌種發(fā)酵乳清粉制成，主要發(fā)酵產(chǎn)物為混合有機(jī)酸和多肽；126份低溫酸奶，市售；虎紅培養(yǎng)基、乳酸酚棉藍(lán)染色液，南京翼飛雪生物科技有限公司。

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(potato detrose agar,PDA)(g/L)：土豆200、葡萄糖20、瓊脂15。121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯肉湯培養(yǎng)基(potato detrose broth,PDB)(g/L)：土豆200，葡萄糖20。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40AI型立式電熱壓力滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；AUY-120型分析天平，日本島津公司；YT-CJ-1D型超凈工作臺，北京亞太科隆儀器技術(shù)有限公司；LRH-150系列生化培養(yǎng)箱，上海益恒科學(xué)儀器有限公司；QK-1536型電子數(shù)顯卡尺，奇亦克尺業(yè)有限公司；THZ-Q型臺式冷凍恒溫振蕩器，太倉市華美生化儀器廠；AIPHAPPHOT-2 YS2型光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司；GZX-9140 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SU8010型電子掃描顯微鏡，日本HITACHI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酸奶中污染霉菌的分離與純化

市售低溫酸奶購買后立即無菌分裝于培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)7～10 d。待酸奶表面長出霉菌菌落后挑取其中少許菌絲，點(diǎn)植法接種到PDA培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基中，純化2～3次，并移接至斜面試管中，4 ℃保存[11]。

1.3.2 酸奶中污染霉菌的形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定

28 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落的大小、顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征，染色制片，在顯微鏡下觀察菌株的菌絲及分生孢子頭等形態(tài)特征。純化霉菌菌株送至上海生工生物工程有限公司測序，以ITS1(5′-TCCGTAGGTAACCTGCGG-3′)為正向引物，ITS4(5′-TCCTCGCTTATTGATATGC-3′)為反向引物擴(kuò)增菌株序列，所得序列提交到GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行注冊并獲得序列登錄號，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行blast比對，確定種屬。

1.3.3 發(fā)酵乳清粉對污染霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用

1.3.3.1 孢子懸浮液的制備

用無菌生理鹽水洗下斜面培養(yǎng)的霉菌孢子，通過4層紗網(wǎng)過濾到50 mL滅菌的三角瓶中，得到孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察，按照公式(1)計(jì)算孢子數(shù)[12]：

(1)

式中：N，孢子總數(shù)，CFU/mL；N1，血球計(jì)數(shù)板中5個(gè)大方格孢子總數(shù)，CFU/mL；D，稀釋倍數(shù)。

1.3.3.2 孢子萌發(fā)抑制率的測定

將發(fā)酵乳清粉添加到PDB培養(yǎng)基中，使其質(zhì)量濃度為1、3、5、8、10 g/L，調(diào)整pH為10.0, 121 ℃，滅菌20 min；將2 mL霉菌的孢子懸浮液(107CFU/mL)接種到培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，每隔2 h顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況[13]，以不添加發(fā)酵乳清粉的PDB作為對照組。

1.3.4 發(fā)酵乳清粉對菌落生長及生物量的抑制作用

1.3.4.1 發(fā)酵乳清粉對霉菌菌落生長抑制作用

參考的任苗苗等[14]的方法，并稍做修改。將菌絲接種到發(fā)酵乳清粉質(zhì)量濃度為1、3、5、8、10 g/L的PDA平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，通過游標(biāo)卡尺十字交叉法，每24 h測定菌落的直徑，按照公式(2)計(jì)算抑制率，以不添加發(fā)酵乳清粉的PDA作為空白對照組。

(2)

式中：dc，對照組菌落直徑，mm；dt，試驗(yàn)組菌落直徑，mm。

1.3.4.2 發(fā)酵乳清粉對菌絲生物量的影響

參考SHARMA等[15]的方法，并稍作修改。將100 μL霉菌的孢子懸浮液(107CFU/mL)接種到發(fā)酵乳清粉質(zhì)量濃度為1、3、5、8、10 g/L的20 mL PDB培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，過濾、收集菌絲、稱量并置于烘箱中干燥至恒重。

1.3.5 發(fā)酵乳清粉對霉菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

將菌絲接種到10 g/L發(fā)酵乳清粉的PDA培養(yǎng)基上，以不加發(fā)酵乳清粉的PDA培養(yǎng)基為對照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，取菌絲體制作樣本用透射電鏡和掃描電鏡觀察霉菌菌絲體細(xì)胞形態(tài)[16]。

1.3.6 發(fā)酵乳清粉在酸奶防霉中的應(yīng)用

將霉菌孢子懸浮液(104CFU/g)與商業(yè)酸奶發(fā)酵劑同時(shí)接種巴氏消毒牛奶，42 ℃恒溫發(fā)酵6～8 h后，添加發(fā)酵乳清粉使其質(zhì)量濃度為1、3、5、8、10 g/L，置于4 ℃冰箱后熟過夜，在28 ℃恒溫箱中儲藏21 d，觀察其長霉情況，并以不添加發(fā)酵乳清粉的酸奶為對照組[17]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

發(fā)酵乳清粉的抑霉試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel處理，Origin 2018繪圖，SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素ANOVA判斷(鄧肯檢驗(yàn))，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫酸奶中霉菌的分離鑒定及優(yōu)勢污染菌的確定

從市售126份低溫酸奶中共分離到43株霉菌。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析鑒定為22株曲霉菌(Aspergillus)，占分離株的51.16%，其中9株鑒定為雜色曲霉(A.versicolor)，5株為肉色曲霉(A.carneus)，4株為假灰綠曲霉(A.pseudoglaucus)，3株為甘曲霉(A.jensenii)，1株為薛氏曲霉(A.chevalieri);15株青霉菌(Penicillium)，占分離株的34.88%，其中8株為桔青霉(P.citrinum)，4株為鮮紅青霉(P.chermesinum)，3株為斜臥青霉(P.decumbens)；此外，4株為枝狀枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)和2株白囊耙齒菌(Irpexlacteus)，其分離的頻率分別為9.30%和4.65%。上述10個(gè)種(共計(jì)13株)霉菌的菌落及顯微形態(tài)見圖1，其分子序列分析結(jié)果見表1。

圖1 低溫酸奶污染霉菌的菌落和顯微形態(tài)圖Fig.1 Colony and microscopic morphology of the contaminated molds from low-temperature yogurt

表1 十三株污染霉菌的序列分析結(jié)果Table 1 Sequence analysis of 13 the contaminated mold

由表1可知，曲霉屬(51.16%)和青霉屬(34.88%)分離頻率占比大，與文獻(xiàn)報(bào)道的青霉和曲霉屬是乳制品中最常見的腐敗微生物結(jié)果一致[18]，其中分離頻率最高的雜色曲霉(20.93%)和桔青霉(18.60%)也曾在酸奶中被分離出來[17]?？挡┭郲19]對乳品生產(chǎn)環(huán)境中微生物的調(diào)查與分析中發(fā)現(xiàn)酸奶中的曲霉和青霉很可能是以孢子形式漂浮在加工環(huán)境的空氣中，從而進(jìn)入原料，污染酸奶。除此，枝孢霉屬作為酸奶加工廠空氣中最常見的分離物種也在酸奶中分離出來[4]，而且很大可能是生產(chǎn)加工過程中由空氣代入[18]。首次在酸奶中分離得到的耙齒菌屬，也曾在臭豆腐和鹵水樣品等食品中分離得到[20]。由此可知，霉菌是整個(gè)供應(yīng)鏈、食品行業(yè)中最常見的食品腐敗微生物，甚至與高度加工、高穩(wěn)定性產(chǎn)品的腐敗(如酸奶)有關(guān)。然而，導(dǎo)致原料或成品變質(zhì)的微生物的特性取決于物理和化學(xué)環(huán)境因素的組合[3]。本文選擇污染頻率高而且產(chǎn)生孢子的4株優(yōu)勢霉菌(雜色曲霉B2qing、肉色曲霉J2、桔青霉E和枝孢霉D)作為試驗(yàn)菌株，研究發(fā)酵乳清粉對它們的影響。

2.2 發(fā)酵乳清粉對霉菌孢子萌發(fā)的影響

孢子萌發(fā)是所有絲狀真菌生命周期中必不可少的發(fā)育階段，為了防止真菌感染和食品中產(chǎn)生霉菌毒素，則需限制孢子萌發(fā)[21]。在不添加發(fā)酵乳清粉的空白對照組中：桔青霉、枝孢霉、雜色曲霉、肉色曲霉的萌發(fā)率分別為(23.12±3.19)%、(30.01±3.14)%、(21.45±2.50)%、(13.48±4.04)%；不同菌株孢子的萌發(fā)具有顯著性差異(P<0.05)；與對照組相比，菌株孢子萌發(fā)率隨著發(fā)酵乳清粉質(zhì)量濃度的增加而顯著降低(P<0.05)，當(dāng)質(zhì)量濃度為8～10 g/L時(shí)，抑制率為100%，表明孢子萌發(fā)受到完全的抑制(圖2)。對于肉色曲霉，發(fā)酵乳清粉在低質(zhì)量濃度(1 g/L)下孢子萌發(fā)率為(16.12±0.10)%，高于空白對照組，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異并不顯著(P>0.05);在發(fā)酵乳清粉≥3 g/L時(shí)受到顯著抑制(P<0.05)。TAO等[13]在萜烯檸檬烯對青霉孢子的誘導(dǎo)作用研究中也有類似現(xiàn)象：低濃度(0.125～0.50 μL/mL)的萜烯檸檬烯對青霉孢子的萌發(fā)有誘導(dǎo)促進(jìn)作用，而高濃度(1 μL/mL)對孢子萌發(fā)有抑制作用。綜上所述，發(fā)酵乳清粉對桔青霉、枝孢霉、雜色曲霉、肉色曲霉的最小抑菌濃度分別為1、1、1和3 g/L，且抑制效果與發(fā)酵乳清粉的濃度呈正相關(guān)。

圖2 發(fā)酵乳清粉對4株酸奶優(yōu)勢污染霉菌孢子 萌發(fā)的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of the FWP on spore germination of 4 dominant contaminated molds strains from yogurt

2.3 發(fā)酵乳清粉對霉菌菌絲生長的影響

添加發(fā)酵乳清粉1 g/L時(shí)，肉色曲霉菌落直徑大于空白對照組(P<0.05),可能是因?yàn)榘l(fā)酵乳清粉中有機(jī)酸等小分子營養(yǎng)物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)了肉色曲霉孢子的萌發(fā)。當(dāng)發(fā)酵乳清粉質(zhì)量濃度≥3 g/L時(shí)，菌落直徑顯著減小(P<0.05)，這與孢子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。其他菌株的菌落直徑均顯著低于空白對照組(P<0.05)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各濃度下的抑制率在不斷地減小(圖3-b)。WANG等[22]在對沙糖桔果皮所產(chǎn)生的揮發(fā)性精油的抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，精油(≥0.5 μL/mL)對擴(kuò)展青霉和核盤青霉有強(qiáng)烈的抑制作用，而對意大利青霉和指狀青霉只有在高濃度下才有抑制作用，在低濃度(≤2.5 μL/mL)下則有促進(jìn)作用。這與本文低濃度(≤1 g/L)促進(jìn)肉色曲霉生長，高濃度抑制生長的結(jié)果一致。由此可見，不同菌株對抑菌物質(zhì)的敏感度不同[11]，因此抑菌物質(zhì)對菌株的最小抑菌濃度也不同。

a-發(fā)酵乳清粉質(zhì)量濃度；b-培養(yǎng)時(shí)間圖3 發(fā)酵乳清粉對4株酸奶優(yōu)勢污染霉菌菌絲生長的影響Fig.3 Effects of the FWP on the mycelial growth of four dominant contaminated molds from yogurt

2.4 發(fā)酵乳清粉對霉菌菌絲生物量的影響

從表2可知，各菌株的生物量在不同濃度的發(fā)酵乳清粉處理后有顯著性差異(P<0.05)。發(fā)酵乳清粉對肉色曲霉、枝孢霉、桔青霉和雜色曲霉的抑制率分別在8、8、8和5 g/L處達(dá)到最大值，為(60.38±2.73)%、(79.14±1.07)%、(69.88±0.14)%和(49.58±0.71)%；當(dāng)質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，抑制率出現(xiàn)了降低的情況，可能是因?yàn)楦邼舛鹊陌l(fā)酵乳清粉對菌絲的形態(tài)造成嚴(yán)重的破壞、變形，無法形成完整的菌絲球，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損傷，增加了菌絲干重，使得抑菌結(jié)果偏低。整體來看，發(fā)酵乳清粉的濃度與其對菌絲生物量的抑制作用呈正相關(guān)，各菌株的抑制率均有顯著性差異(P<0.05)。

表2 發(fā)酵乳清粉對4株酸奶優(yōu)勢污染霉菌生物量的影響Table 2 Effect of the FWP on the biomass of four 4 dominant contaminated molds strains from yogurt

2.5 發(fā)酵乳清粉對霉菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

發(fā)酵乳清粉對霉菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果如圖4所示。未經(jīng)發(fā)酵乳清粉處理的菌株分生孢子頭飽滿，孢子梗呈輻射狀排列(圖4-a-1)；菌絲體發(fā)達(dá)，飽滿挺直(圖4-a-2)；細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整，清晰可見的線粒體、液泡，內(nèi)容物豐富(圖4-a-3)。經(jīng)10 g/L發(fā)酵乳清粉處理的菌株，孢子頭干癟，孢子梗排列疏松、不緊密(圖4-b-1)；菌絲體發(fā)生嚴(yán)重變形，空菌絲褶皺變平(圖4-b-2)；細(xì)胞內(nèi)部質(zhì)壁分離嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)容物流失，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器丟失[16](圖4-b-3)。LEYVA等[23]認(rèn)為這可能是由于抑菌物質(zhì)或有機(jī)酸以其未解離的形式通過微生物膜擴(kuò)散，并在細(xì)胞內(nèi)解離，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值降低。有毒離子的累積與膜破壞、基本代謝反應(yīng)的抑制或細(xì)胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)中的應(yīng)激相結(jié)合，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

a-對照組；b-實(shí)驗(yàn)組；1-孢子頭形態(tài)(1 500×)； 2-菌絲形態(tài)(800×)；3-細(xì)胞結(jié)構(gòu)(5 000×)圖4 發(fā)酵乳清粉對雜色曲霉B2qing的孢子頭、 菌絲體形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of the FWP on the spores, mycelium morphology and cellular structure of A.versicolor B2qing

2.6 發(fā)酵乳清粉應(yīng)用與酸奶儲存中防霉效果

將發(fā)酵乳清粉添加到接種雜色曲霉孢子懸浮液的發(fā)酵乳中，使其終含量為0、1、3、5、8、10 g/L，28 ℃培養(yǎng)，分別于第1、3、5、7、10、15、21天觀察霉菌菌落形成，結(jié)果見圖5。

圖5 發(fā)酵乳清粉添加對雜色曲霉在酸奶儲藏期的生長影響Fig.5 Effect of FWP addition on growth of A.versicolor in yogurt during storage

在儲藏第5天時(shí)，空白對照組出現(xiàn)了白色的霉菌菌落，此時(shí)添加發(fā)酵乳清粉的試驗(yàn)組沒有霉菌菌落形成；在儲藏第12天時(shí)，1 g/L發(fā)酵乳清粉的樣品出現(xiàn)了霉菌斑點(diǎn)(圖中未顯示)；在儲藏第15天時(shí)，對照組樣品表面已經(jīng)長滿了霉菌，試驗(yàn)組中，除添加濃度為1 g/L發(fā)酵乳清粉的樣品中有霉斑，其他添加量的樣品仍未出現(xiàn)長霉的現(xiàn)象。結(jié)果表明：發(fā)酵乳清粉質(zhì)量濃度≥1 g/L時(shí)，對酸奶中接種的霉菌有顯著抑制作用，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵乳的低pH使發(fā)酵乳清粉在低酸環(huán)境下的抑菌活性更高[12]。此外，隨著發(fā)酵乳清粉濃度的增加，抑菌效果在加強(qiáng)的同時(shí)，也對發(fā)酵乳表觀產(chǎn)生了一些影響，如乳清析出，顏色變暗的現(xiàn)象(圖5)，這與VIMONT等[17]對乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的羅氏菌素抑菌能力及其在酸奶中應(yīng)用的研究結(jié)果類似。這表明在抑制霉菌生長的同時(shí)，也要考慮對食品本身基本指標(biāo)的影響。

3 結(jié)論

本文首先對市售低溫發(fā)酵乳中絲狀真菌的污染情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，在126份市售發(fā)酵乳中共分離出43株霉菌，經(jīng)鑒定為形態(tài)不同的13株污染霉菌，其中主要的優(yōu)勢菌為曲霉屬，占比高達(dá)51.16%；其次從菌株的孢子萌發(fā)、菌落直徑、菌絲生物量、細(xì)胞結(jié)構(gòu)4個(gè)方面發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵乳清粉對霉菌有顯著的抑制作用，且不同菌株對發(fā)酵乳清粉的敏感性不同，使最小抑菌濃度也不同；最后將其添加到食品基質(zhì)的發(fā)酵乳中，觀察在儲藏期間它對發(fā)酵乳中霉菌的抑制作用，結(jié)果表明添加1 g/L的發(fā)酵乳清粉能很好地抑制發(fā)酵乳中霉菌的生長，這表明發(fā)酵乳清粉有望成為生物防霉劑用于抑制低溫發(fā)酵乳的霉菌污染。然而，在抑菌效果與發(fā)酵乳清粉添加量呈正相關(guān)的情況下，隨著添加量的增加，發(fā)酵乳的一些基本指標(biāo)也出現(xiàn)不良影響，如乳清析出、顏色變暗，這表明評價(jià)發(fā)酵乳清粉抑菌的同時(shí)還要考慮其對食品本身的影響。因此，接下來研究可側(cè)重于探究不同添加量的發(fā)酵乳清粉對酸奶持水力、酸度、流變學(xué)特性、感官等指標(biāo)的影響。