周立光，楊明喆，馮會粉，劉藝茹，劉蕊，張欣，葛媛媛， 張旭光，劉佳奇，程坤，于學健，姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京,100015)2(湯臣倍健有限公司，廣東 廣州,510663)

益生菌是一類活的微生物，當攝取足夠數(shù)量時，對宿主健康有益[1]，已廣泛應用于食品、藥品、膳食補充劑、飼料等領域[2]。益生菌的功能具備菌株特異性[3]，且需要攝入足夠的數(shù)量才能達到預期功效，因此在選擇益生菌產(chǎn)品時，其活菌數(shù)量尤為重要。《益生菌類保健食品申報與審評規(guī)定(征求意見稿)》規(guī)定“益生菌類保健食品在其保質(zhì)期內(nèi)活菌數(shù)目不得少于106CFU/mL(g)”。近年來，隨著益生菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，多元化的復合益生菌產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，對復合益生菌產(chǎn)品的菌種水平進行精確鑒定并確認其活菌數(shù)是確保產(chǎn)品質(zhì)量的關鍵。

目前，乳酸菌的檢測主要基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，通過使用選擇性培養(yǎng)基分離益生菌產(chǎn)品中所含的微生物[4]，進而通過BIOLOG[5]、FT-IR以及MALDI-TOF[6]等表型方法和16S rRNA基因[7]、功能基因[8]等基于分子標記基因的遺傳學手段來進行微生物菌種鑒定。盡管基于全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)技術的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)[9]和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析[10]技術可以實現(xiàn)物種的精確鑒定，但仍需要獲得純培養(yǎng)物?；?6S rRNA基因序列的高通量測序，可以揭示產(chǎn)品屬水平的物種組成，并能檢測是否存在污染菌，采用宏基因組分箱方法能在種水平上精確評估益生菌種類，解析產(chǎn)品中的物種組成[11]。

流式細胞分析技術(flow cytometry analysis，F(xiàn)CM)是快速興起的非培養(yǎng)活菌定量技術，通過熒光染料的選擇可以快速區(qū)分活、死細胞，實現(xiàn)樣品中活細胞的定量[12]，但目前該檢測技術很難實現(xiàn)每種菌的活菌計數(shù)。反轉錄熒光定量PCR(reverse transcription qPCR，RT-qPCR)可以實現(xiàn)活菌定量檢測的目的[13]，但RNA易降解，并且需將RNA反轉錄成cDNA后才能進行qPCR，操作過程復雜、容易帶來誤差，因此不適宜復雜樣品中的微生物檢測。疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)是一種常見的活菌染料，其與qPCR結合的技術(propidium monoazide-quantitative PCR，PMA-qPCR)，不僅可以特異性地定量菌株數(shù)量，而且可以區(qū)分活細胞和死細胞[14]，作為靶向方法具有良好的應用潛力，已成為益生菌產(chǎn)品中乳酸菌活菌數(shù)量檢測的有效方法[15]，在腸道環(huán)境益生菌活菌數(shù)檢測[16]的研究中亦有廣泛應用，在其他研究領域，如水環(huán)境[17]、生物膜[18]中活微生物的檢測以及流行病學研究中亦有文獻報道[19]。

本研究以2種市售復合益生菌固體飲料及其添加的5種(6株)益生菌為研究對象，采用宏基因組測序分析方法、ANI分析方法及PMA-qPCR方法，在菌種水平精確鑒定復合益生菌產(chǎn)品的物種組成，并對活菌數(shù)進行快速定量，為復合益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術參考，對促進益生菌在食品行業(yè)更加安全和廣泛的應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 產(chǎn)品選擇

選擇2種市售復合益生菌固體飲料產(chǎn)品：Life·space益倍適?益生菌固體飲料(產(chǎn)品P1)由動物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)Bi-07(簡稱菌株Bi-07)、動物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)HN019(簡稱菌株HN019)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)HN001(簡稱菌株HN001)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)CECT5716(簡稱菌株CECT5716)和短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)M-16V(簡稱菌株M-16V)組成，每袋(1 g)添加活菌75億CFU；Nature’s Bay天然博士?益生菌固體飲料(產(chǎn)品P2)由菌株HN019、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)299v(簡稱菌株299v)、菌株HN001和菌株CECT5716組成，每袋(1 g)添加活菌≥60億CFU。

乳桿菌屬(Lactobacillus)微生物的表型和基因型具有多樣化特征，基于已公布的大量乳桿菌屬菌種的全基因組數(shù)據(jù)分析，原乳桿菌屬被重新劃分為25個屬，乳桿菌屬菌種分類學地位已發(fā)生重要變遷[20]。2020年6月更新的QPS名單已采納了新的分類學名稱，亦認可原分類學名稱的使用?？紤]到新分類單元的使用存在過渡期，本研究仍沿用之前的乳桿菌屬國際分類體系。

1.1.2 主要試劑、儀器及培養(yǎng)基

DNA提取試劑盒(QIAGEN Dneasy Blood & Tissue DNA)，QIAGEN公司；熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus))、pMD-19T TA克隆載體(TaKaRa pMD-19T vector)，寶生物工程(大連)有限公司；PMA，Biotium公司；DNA純化試劑盒(Cycle-pure kit)，OMEGA公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI，NEB公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基、強化梭菌培養(yǎng)基，BD公司。

BD1236核酸蛋白分析儀，Biodrop公司；TRIO48普通PCR儀，Biometra公司；Multiskan FC酶標儀，Thermo Fisher Scientific 公司；PT-H18A LED光敏儀，Biotium公司；Bead Ruptor 12破碎儀，OMNI公司；7500型定量PCR儀，ABI公司；Miseq PE30016Sr RNA基因擴增子測序平臺、Hiseq 3000宏基因組測序平臺，Illumina公司。

1.1.3 菌株及培養(yǎng)方法

產(chǎn)品聲稱添加的菌株：動物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)Bi-07、動物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)HN019、植物乳桿菌(L.plantarum)299v、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)HN001、短雙歧桿菌(B.breve)M-16V和發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)CECT5716分別分離自單一菌株制備而成的商業(yè)化純菌劑，16S rRNA 基因序列和持家基因序列鑒定結果表明6株菌在種(或亞種)水平上的分類學地位與商業(yè)化純菌劑聲稱一致。

5種菌的模式菌株：動物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)CICC 24210T，短雙歧桿菌(B.breve)CICC 6079T，鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)CICC 6135T，植物乳桿菌(L.plantarum)CICC 6240T，發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)CICC 24209T均來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

雙歧桿菌屬菌株和乳桿菌屬菌株分別采用強化梭菌和MRS固體培養(yǎng)基在37 ℃下厭氧、避光培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

用于宏基因組測序的固體飲料樣品微生物總DNA的提取，按照QIAGEN Dneasy Blood & Tissue 提供的說明書進行，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用Biodrop測定DNA濃度和純度。

用于PMA-qPCR檢測的固體飲料樣品微生物總DNA及菌株純培養(yǎng)物的DNA提取，參考SCARIOT等[21]的方法，采用機械破碎生理鹽水菌懸液獲取DNA粗提液的方式進行提取。所有DNA溶液置于-20 ℃ 保存待用。

1.2.2 16S rRNA 基因高通量測序及生物信息分析

1.2.2.1 PCR擴增及Illumina Miseq測序

使用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。將同一樣本的PCR產(chǎn)物(3個平行樣品)混合，以2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒(axygen biosciences AxyPrep DNA gel extraction kit)進行PCR產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收效果。用QuantusTMFluorometer(美國Promega)對回收產(chǎn)物進行定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫，根據(jù)說明書進行操作。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(序列號：SRR15195391、SRR15195390)。

1.2.2.2 數(shù)據(jù)處理及分析

使用fastp[22](https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)軟件對原始測序序列進行質(zhì)控，使用FLASH[23](http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7)軟件進行拼接。使用UPARSE[24]軟件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根據(jù)97%[24]的相似度對序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier[25](http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(v138)，設置比對閾值為70%。

1.2.3 鳥槍法宏基因組文庫構建及測序

使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq(美國，Bioo Scientific)建庫，根據(jù)說明書進行文庫制備。使用Illumina Hiseq 3000(美國Illumina)測序平臺進行宏基因組測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。原始數(shù)據(jù)已提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(序列號：SRR15194982、SRR15194981)。

1.2.3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控及拼接組裝

使用fastp[22](https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)對reads 3′端和5′端的adapter序列進行質(zhì)量剪切，并去除剪切后長度小于50 bp、平均堿基質(zhì)量值低于20以及含N堿基的reads，保留高質(zhì)量的pair-end reads 和single-end reads。

1.2.3.2 基因組重建

采用MetaWRAP宏基因組分析流程對clean reads 進行分箱(Bining)操作。首先，利用read_qc模塊對clean reads進行質(zhì)控；其次，用assembly模塊對質(zhì)控后的宏基因組數(shù)據(jù)進行組裝；再用binning模塊對組裝后的contigs進行分箱操作[26]。利用checkM對分箱后bins的完整度和污染度進行評估[27]。去除完整度<70%和污染度>5%的bin，對分箱結果再次提純優(yōu)化，利用blobology模塊進行可視化分析[26]。

1.2.4 ANI分析

從NCBI genome數(shù)據(jù)庫下載5個種的模式菌株的基因組序列，利用ANI Calculator軟件分別對6個菌株與所在種內(nèi)模式株的基因組序列進行ANI分析。以95%～96%的ANI值作為細菌物種界定的標準[9]，對6個菌株進行物種鑒定。

1.2.5 PMA-qPCR 方法

1.2.5.1 PMA處理條件

參考GOBERT等[28]的方法制作熱致死菌體，略有改動。刮取在37 ℃厭氧條件，固體培養(yǎng)48 h的乳酸菌，用無菌生理鹽水稀釋至108CFU/mL的菌懸液(OD620為0.4左右)，分成2份，一份記為活菌，一份于80 ℃水浴處理20 min，取出立即于冰浴冷卻，記為死菌(利用平板菌落計數(shù)法來檢測無活菌生長)。

分別向500 μL活、死菌菌液中加入PMA溶液，使其終濃度為50 μmol/L，暗孵育5 min，每隔1 min混勻1次，于LED光敏儀曝光15 min。12 000 r/min室溫離心15 min收集菌體，用于純培養(yǎng)物DNA提取。通過qPCR檢測PMA處理條件計算對死菌DNA擴增的抑制率，如公式(1)所示。

(1)

式中：C死菌-PMA(+)，樣品PMA處理的菌濃度，CFU/mL；C死菌-PMA(-)，樣品未經(jīng)PMA處理的菌濃度，CFU/mL。

1.2.5.2 引物篩選及特異性分析

通過文獻檢索5種乳酸菌常用引物，先通過NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)檢索引物特異性，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物合成，以1.1.3中的6株細菌為目標菌株，通過直接熱裂解菌落的方式獲取DNA，PCR 擴增驗證引物特異性。進一步通過qPCR驗證產(chǎn)物是否單一，引物來源及詳細信息見表1。

1.2.5.3 qPCR標準曲線的建立

乳桿菌和雙歧桿菌分別接種于MRS和強化梭菌固體培養(yǎng)基，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h。分別刮取菌株HN001、菌株CECT5716、菌株299v、菌株Bi-07和菌株HN019的菌體，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)OD620至0.4 左右，通過平板菌落計數(shù)法測定初始菌液濃度(CFU/mL)。取500 μL菌液，按照1.2.1的方法提取DNA；獲得的基因組DNA以10倍梯度稀釋至10-7，通過qPCR測定每個稀釋度DNA對應的Cq值，以菌液濃度的對數(shù)值(lg CFU/mL)為x軸，Cq值為y軸，建立基于CFU的qPCR標準曲線。通過公式(2)計算qPCR擴增效率：

E=10-1/s-1

(2)

式中：s為標準曲線斜率。

刮取半環(huán)短雙歧桿菌(B.breve)菌體，提取DNA，用qPCR引物進行PCR擴增獲得目標產(chǎn)物，利用Cycle clean試劑盒純化PCR產(chǎn)物。將純化的片段連接到pMD-19T Vector，連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)細胞Trans 5α，獲得攜帶目的序列的陽性克隆。提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶EcoRI對質(zhì)粒進行線性化，用Cycle clean試劑盒純化酶切產(chǎn)物，測定線性化DNA濃度。通過公式(3)將DNA濃度換算基因拷貝數(shù)濃度。

(3)

式中：NA，阿伏伽德羅常數(shù)，6.02×1023。

對線性質(zhì)粒進行梯度稀釋，選擇10-2～10-9作為模板進行qPCR，根據(jù)每個稀釋度對應的質(zhì)?？截悢?shù)的lg值(橫坐標)和Cq值(縱坐標)繪制標準曲線，計算qPCR擴增效率。

1.2.5.4 qPCR 反應體系及反應條件

qPCR 反應體系：參考SYBR Premix ExTaqTM說明書提供的反應體系：SYBR qPCR Mix 12.5 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、50×Rox 0.5 μL、稀釋的DNA模板5 μL，加無菌ddH2O補足體積至25 μL。

qPCR反應條件：每對引物的反應條件略有不同，詳細信息見表1。循環(huán)結束后進入溶解曲線分析，程序為65 ℃ 逐步升溫至95 ℃，每升溫0.5 ℃檢測一次熒光信號，每次檢測持續(xù)5 s。

1.2.6 PMA-qPCR 定量檢測產(chǎn)品中的活菌數(shù)

根據(jù)產(chǎn)品聲稱的活菌總數(shù)，加入適當體積的生理鹽水，使活菌濃度為108CFU/mL，混勻并充分溶解菌粉；取500 μL菌液于1.5 mL無菌離心管中，12 000 r/min室溫離心15 min收集菌體，去掉上清液；再用500 μL的生理鹽水清洗菌體1次；用500 μL生理鹽水充分懸勻菌體，按照1.2.5進行PMA處理；按照1.2.1的方法提取基因組DNA，通過qPCR定量檢測產(chǎn)品中每種菌的活菌數(shù)。

1.2.7 平板菌落計數(shù)

按照1.2.6的方法溶解菌粉；對菌液進行梯度稀釋，選取2～3個連續(xù)的適宜稀釋度菌液1 mL于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做2個平行實驗，于37 ℃ 厭氧、避光培養(yǎng)72 h后進行菌落計數(shù)。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)品中微生物多樣性分析

通過基于16S rRNA 基因的338～806 nt區(qū)域進行PE300高通量測序，分析產(chǎn)品P1和P2中的微生物組成。過濾后，P1和P2的序列數(shù)分別為61 338和69 853條(表2)。序列平均長度為424 bp，每種產(chǎn)品的有效序列均超過50 000條，且稀釋曲線均趨于平穩(wěn)，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量滿足微生物多樣性分析的要求。

表2 產(chǎn)品16S rRNA基因擴增子測序 信息統(tǒng)計 單位：bp

每個產(chǎn)品的測序結果分析均只產(chǎn)生4個OTU，表明產(chǎn)品P1和P2中均存在4種菌，與P1和P2聲稱添加的菌種組成一致。對獲得的OTU進行注釋，在種水平上，除一種雙歧桿菌注釋至屬(unclassifiedBifidobacterium)水平外，P1中含有的其他3種菌分別注釋為發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、短雙歧桿菌(B.breve)；P2中含有的其他3種菌分別注釋為發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、植物乳桿菌(L.plantarum)，均與產(chǎn)品聲稱的菌種一致。根據(jù)產(chǎn)品說明顯示的物種添加信息，推測是由于動物雙歧桿菌乳亞種的種間相似性高，短片段的16S rRNA 基因無法將其界定到種水平。為了在種水平上精確鑒定產(chǎn)品中的每個物種，同時對產(chǎn)品DNA進行宏基因組測序。

2.2 產(chǎn)品中的物種鑒定

2.2.1 益生菌基因組重建

對基于Illumina Hiseq 3000測序平臺的宏基因組數(shù)據(jù)，采用fastp軟件、堿基質(zhì)量值≥20，對Raw reads進行質(zhì)控，質(zhì)控后產(chǎn)品P1和P2的clean reads 數(shù)分別為98 414 620和99 779 276條，每種產(chǎn)品質(zhì)控后的clean reads均占Raw reads的98.77%以上(表3)。

表3 產(chǎn)品宏基因組測序質(zhì)控后數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 3 Data statistics after metagenomic sequencing and quality-control

采用MetaWRAP宏基因組分析流程，用maxbin2算法對組裝后的contigs進行分箱(binning)，每個產(chǎn)品的contigs數(shù)據(jù)均被分為4個bins(表4)，與OTU數(shù)和產(chǎn)品添加的菌種數(shù)一致。

利用checkM對分箱后bins的完整度和污染度進行評估，結果表明，P1和P2分箱產(chǎn)生的bins的完整度均高于98%，污染度均低于5%(表4)，成功實現(xiàn)了P1和P2宏基因組數(shù)據(jù)的分箱。每個bin分別通過blast與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，初步分析每個bin所代表的物種(圖1)，與16S rRNA基因微生物多樣性一致。宏基因數(shù)據(jù)分箱成功實現(xiàn)4種菌的基因組重建。

表4 宏基因組分箱結果Table 4 The results of metagenomics binning

a-宏基因組分箱分析產(chǎn)品P1 的bins豐度； b-宏基因組分箱分析產(chǎn)品P2 的bins豐度圖1 Bin豐度散點圖Fig.1 Scatter plots of bins abundance

2.2.2 益生菌種水平鑒定

對分箱獲得的bins與NCBI NT數(shù)據(jù)庫進行比對，確定其代表的菌種。進一步通過bins與所代表種內(nèi)的模式菌株的基因組進行ANI分析，每個樣品中的4個bins與模式菌株基因組ANI分析的值均大于96%，表明每個bin代表的菌種與模式菌株為同一個種(表5)。產(chǎn)品P1中的bin 0與B.animalis種內(nèi)的B.animalissubsp.lactisDSM 10140T相似性較高，ANI值為99.99%；產(chǎn)品P2中的bin 2與B.animalis種內(nèi)的B.animalissubsp.lactisDSM 10140T相似性較高，ANI值亦接近99.99%；表明P1中的bin 0和P2中的bin 2代表的均為B.animalissubsp.lactis(表5)，與產(chǎn)品聲稱一致。通過circos v 0.69-8 軟件對產(chǎn)品中的bins進行可視化，每個bin中挑選最長的12條contigs進行作圖(圖2)。

表5 Bins與參考模式菌株基因組ANI 分析結果Table 5 The analysis results of ANI between bins and type strains genomes

圖2 通過宏基因組分箱進行產(chǎn)品菌種基因組重建Fig.2 Re-constructed genomes from probiotic products by means of the metagenomics binning 注：每一個產(chǎn)品的bins 都由橫向排列的遺傳圖譜來表示；相同物種用同一種顏色顯示，綠色“√”表示分箱得到的物種與產(chǎn)品聲稱菌種一致

2.3 建立PMA-qPCR 檢測體系

2.3.1 引物特異性分析

引物的特異性結合是qPCR檢測生物量準確度的關鍵。通過NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫對文獻中篩選的引物特異性進行初步判斷，進而通過普通PCR擴增檢測引物的特異性，最后通過qPCR溶解曲線判斷產(chǎn)物的單一性。如表6所示，發(fā)酵乳桿菌引物(LFer-1/LFer-2)、植物乳桿菌引物(LplantarumF/LplantarumR)、鼠李糖乳桿菌引物(LrhamnosusF/LrhamnosusR)在種間、自身基因組中均具有高特異性，每株菌基因組DNA的PCR擴增條帶的大小與模式菌株(陽性對照)基因組DNA、靶菌株基因組DNA及對應產(chǎn)品總基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物條帶大小一致，并且qPCR溶解曲線為單一峰；短雙歧桿菌引物(BiBRE-1/BiBRE-2)以菌株HN019基因組DNA為模板時，會產(chǎn)生弱的條帶，動物雙歧桿菌乳亞種引物(Bal-talF/Bal-talR)在以菌株299v基因組DNA為模板時，亦會產(chǎn)生弱的條帶，但兩條帶的大小與模式菌株(陽性對照)基因組DNA、靶菌株基因組DNA及對應產(chǎn)品總基因組DNA的PCR擴增條帶大小不一致，并且產(chǎn)品qPCR溶解曲線單一，不影響P1中短雙歧桿菌和P2中動物雙歧桿菌乳亞種的準確定量。

表6 qPCR 引物特異性檢測Table 6 The specificity test of qPCR primers

2.3.2 建立定量PCR 標準曲線

以2種產(chǎn)品中的6株菌為研究對象，分別建立每株菌的qPCR標準曲線。如表7所示，qPCR反應信號Cq值與菌落濃度的對數(shù)值(lg CFU/mL)之間線性關系良好(R2>0.98)；通過優(yōu)化反應體系與條件，擴增效率均達到85%～110%，標準曲線的檢測限為102CFU/mL(表7)。

表7 qPCR標準曲線參數(shù)信息Table 7 The parameter information of standard curves for qPCR

2.3.3 PMA條件確定

因不同微生物對PMA的敏感度不同[33]，采用qPCR方法檢測PMA作用條件對6株乳酸菌死菌DNAqPCR擴增的抑制，以及對活菌DNA qPCR的影響。參考益生菌及致病菌活菌數(shù)定量研究中最常用的PMA作用條件[30]：PMA終濃度為50 μmol/L，暗孵育時間5 min，曝光時間15 min，作為最初的PMA作用條件。

2.3.3.1 PMA處理對活菌qPCR擴增影響

取新鮮的純培養(yǎng)物，調(diào)整菌液濃度至108CFU/mL左右，通過qPCR檢測PMA作用條件對活菌DNA qPCR的影響。通過t檢驗分析不加PMA處理的活菌與加PMA處理的活菌qPCR的Cq值，結果表明，6株菌的活菌在有和無PMA處理后，其qPCR 的Cq 值間均無顯著性差異(P>0.05)(圖3-a)，表明在有、無PMA處理的樣品中可擴增的靶DNA量基本相等，表明此PMA作用條件不影響活菌qPCR擴增。

2.3.3.2 PMA處理對死菌qPCR 抑制

通過1.2.5.1中的公式計算PMA作用條件對死菌DNA 的qPCR 擴增抑制率。結果表明，6株菌的抑制率均高達99.11% 以上(圖3-b)。最終通過qPCR確定，除菌株CECT 5716 PMA作用終濃度為40 μmol/L外，其他5個菌株的PMA作用終濃度均為50 μmol/L；所有菌株PMA處理的暗孵育時間均為5 min，曝光時間均為15 min。

a-50 μmol/L PMA對活菌DNA的PCR擴增影響； b-50 μmol/L PMA對死菌DNA的PCR擴增抑制率圖3 PMA作用條件對活菌和死菌DNA qPCR的影響Fig.3 Effect of PMA treatment on DNA qPCR of viable and non-viable bacteria

2.3.4 PMA-qPCR檢測方法的可靠性評估

調(diào)整純菌株培養(yǎng)物的菌液濃度至108CFU/mL，基于建立的qPCR標準曲線，計算每株菌的活菌數(shù)，并與菌落計數(shù)結果進行比較。如表8所示，t檢驗分析2種活菌計數(shù)方法，結果無顯著性差異(P>0.05)。表明在菌液濃度為108CFU/mL左右時，PMA-qPCR方法具有良好的可靠性。

表8 PMA-qPCR與平板菌落計數(shù)法對6株 菌活菌數(shù)的檢測結果Table 8 Detection results of six strains of viable bacteria by PMA-qPCR and colony counting

2.4 PMA-qPCR檢測方法在產(chǎn)品中的應用

復合益生菌產(chǎn)品是一種由多菌種混合的食品，檢測其活菌數(shù)是判斷產(chǎn)品質(zhì)量的關鍵。在種水平檢測復合益生菌產(chǎn)品中每種菌的含量仍具有一定難度。目前，關于PMA-qPCR方法用于益生菌及致病菌靶菌種的活菌定量檢測的研究較多。本研究亦采用PMA-qPCR檢測法，在種水平上對市售2種固體飲料P1和P2中的6株益生菌的活菌數(shù)進行定量檢測。

如圖4所示，將產(chǎn)品P1中每種菌的PMA-qPCR定量結果相加獲得產(chǎn)品P1的活菌總數(shù)為1.01×1010CFU/g，t檢驗分析其與平板菌落計數(shù)結果1.01×1010CFU/g無顯著性差異(P=0.78>0.05)。產(chǎn)品中B.animalissubsp.lactis和L.rhamnosus含量較高，分別為4.86×109和4.33×109CFU/g；其次為L.fermentum3.95×108CFU/g，3種益生菌活菌數(shù)與產(chǎn)品實際添加數(shù)量基本吻合。B.breve的含量最低，約為6.38×106CFU/g，在純菌株培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌M-16V對環(huán)境敏感，易死亡，PMA-qPCR檢測結果亦顯示短雙歧桿菌活菌數(shù)量低于實際添加量，推測短雙歧桿菌M-16V的不穩(wěn)定性是導致其活菌檢出量低的主要原因。

a-產(chǎn)品P1;b-產(chǎn)品P2圖4 PMA-qPCR 法檢測產(chǎn)品中6 株乳酸菌的含量Fig.4 Quantitative test results of six strains of lactic acid bacteria in products by PMA-qPCR

將產(chǎn)品P2中每種菌的PMA-qPCR 定量結果相加獲得產(chǎn)品P2的活菌總數(shù)為6.00×109CFU/g，t檢驗分析其與平板菌落計數(shù)結果4.35×109CFU/g無顯著性差異(P=0.427>0.05)。產(chǎn)品中L.rhamnosus含量最高，為3.12×109CFU/g；其次為L.plantarum和L.fermentum，活菌數(shù)分別為1.53×109和9.36×108CFU/g；B.animalissubsp.lactis含量最低，約為4.16×108CFU/g，4種益生菌活菌數(shù)量與產(chǎn)品實際添加數(shù)量基本吻合。

3 結論

復合益生菌產(chǎn)品的菌種組成與活菌數(shù)的含量是產(chǎn)品質(zhì)量的關鍵，本研究以2種復合益生菌固體飲料及其添加的5種(6株)益生菌為研究對象，采用高通量測序及組學分析技術實現(xiàn)了2種復合益生菌產(chǎn)品物種組成的精確鑒定；通過PMA-qPCR方法實現(xiàn)了產(chǎn)品中每種乳酸菌活菌數(shù)快速定量檢測。采用多技術聯(lián)用，構建適合益生菌產(chǎn)業(yè)應用的快速、精準的活菌計數(shù)及檢測技術體系已成為益生菌行業(yè)的重要研究方向，本研究為建立和完善復合益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術支撐，有助于提升產(chǎn)品評價、質(zhì)量控制及市場監(jiān)管水平。