高振峰，趙 佳

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院/農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西太谷 030801)

番茄果實采后軟化和病害發(fā)生既是影響番茄采后貯藏、運輸和貨架期的重要因素，也是番茄采后生物學領域研究的熱點問題[1-3]。近年來為實現(xiàn)延緩番茄采后軟化和降低病害發(fā)生的目的，研究者已從番茄采后軟化機制、耐貯品種篩選、采后病害種類以及采后病害和軟化控制措施等方面開展了大量研究，發(fā)現(xiàn)了FIS1[4]、SlGRAS4[5]、SlPP2C3[6]、NAC-NOR[7]、SlHSP17.7A, B[8]、LeACS2,S4[9]、Sl-ARF2a,2b[10]和YFT1[11]等與番茄采后后熟及軟化相關基因；發(fā)現(xiàn)O-?；z氨酸合成[12]、光-生長素-乙烯互作[10]、多聚半乳糖醛酸酶(PG) 和脂氧合酶(LOX)[1]、品種[13]和貯藏溫度[14]等對番茄采后軟化具有較大影響；發(fā)現(xiàn)匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、茄鏈格孢菌(Alternariasolani)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorum)等為番茄采后主要病原[15-16]；發(fā)現(xiàn)使用1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)[17]、二氧化氯(ClO2)[18]、硒[19]、腐植酸鈣[20]和生物涂膜[21]等處理可延緩番茄采后軟化；發(fā)現(xiàn)百里酚+水楊酸處理[22]、富氫水處理[23]、酵母甘露聚糖[24]和諾沃霉素A[25]等對番茄采后匍枝根霉(R.stolonifer)、茄鏈格孢菌(A.solani)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)和灰葡萄孢菌(B.cinerea)等病原真菌具有良好控制效果。雖然這些研究明確了番茄采后軟化關鍵控制基因，明確了番茄采后病害種類，發(fā)現(xiàn)了一些番茄采后軟化和病害控制措施，為番茄耐貯品種選育和采后貯藏保鮮技術開發(fā)奠定了基礎，但品種選育的時間長、基于軟化控制基因的改良品種少、物理措施的高成本與品質下降以及化學措施的安全性問題亦不可忽視[26-27]，因此綠色、安全的番茄采后軟化和病害控制技術開發(fā)顯得尤為重要。另外，雖然目前有關番茄采后的軟化和病害防治的綠色生物技術開發(fā)也已有報道，但相關研究主要集中在植物提取物離體抑菌活性測定、抗性誘導物質篩選和抗病菌株篩選等方面，而有關生防細菌脂肽物質延緩番茄采后軟化和模擬商業(yè)貯藏條件下早疫病害活體防效的研究還較為薄弱。

脂肽物質作為一類具有表面活性和主要由芽孢桿菌產(chǎn)生的小分子抗菌物質，目前不僅已有研究發(fā)現(xiàn)其對稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、灰葡萄孢菌(B.cinerea)、美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)、指狀青霉菌(Penicilliumdigitatum)、甘薯長喙殼菌(Ceratocystisfimbriata)、 匍枝根霉(R.strolonifer)和茄鏈格孢菌(A.solani)等多種病原真菌具有良好抑制效果[28-31]，而且該類物質還在醫(yī)學、工業(yè)和食品等領域中具有較好的抗癌、抗腫瘤、降解原油和抑制食品傳染病原等作用[32-34]。蔣夢曦等[35]研究發(fā)現(xiàn)伊枯草菌素A(Iturin A)與肉桂精油復配能夠有效保持櫻桃番茄品質，延緩硬度下降，延長貯藏時間，但有關該類物質及其與表面活性素混合物對其他番茄品種的采后軟化延緩效果還未見相關報道。農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用課題組前期從梓樹中篩選出1株可產(chǎn)生脂肽類抗菌物質的貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1，該物質對茄鏈格孢菌(A.solani)的抑菌圈直經(jīng)可達24.3 mm，且經(jīng)LC-MS鑒定其主要為伊枯草菌素A(Iturin A)和表面活性素(Surfaction)[36]。因此基于上述研究背景，本研究通過貯藏試驗重點對前期篩選出的對番茄早疫病菌(A.solani)具有良好抑菌活性的B.velezensisZSY-1不同質量濃度脂肽物質的番茄采后軟化及早疫病控制效果進行研究；并在此基礎上對不同質量濃度脂肽物質作用下的番茄采后軟化相關酶活性進行測定，旨在明確脂肽物質的番茄采后軟化及早疫病控制效果，以期為番茄采后保鮮提供一種新型生物保鮮劑開發(fā)源，并為番茄采后軟化和早疫病生物控制技術開發(fā)提供理論依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試番茄與菌株 番茄果實(‘奇番一號’)于2019年6月14日采自太谷陽邑村(東經(jīng)112°67″,北緯37°43″)番茄早疫病發(fā)病大棚。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)ZSY-1由農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用課題組保藏和提供。

1.1.2 試劑與主要儀器 供試培養(yǎng)基及試劑，NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5；BPY培養(yǎng)液：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉 5 g，葡萄糖5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

主要試劑包括：無水甲醇(AR分析純，天津市大茂化學試劑廠)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性檢測試劑盒(Solarbio；貨號:BC2660；可見分光光度法)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性檢測試劑盒(Solarbio；貨號:BC2580；可見分光光度法)、纖維素酶(CL)活性檢測試劑盒(Solarbio；貨號:BC2540；可見分光光度法)和植物中脂氧合酶 (LOX)活性檢測試劑盒(Solarbio；貨號:BC0320；紫外分光光度法)。

主要儀器包括：超凈工作臺(SW-CJ-1FD，浙江蘇凈凈化)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津市通利信達儀器廠)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱(DHZ-D，上海培因實驗儀器有限公司)、冷凍干燥機(SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技股份有限公司)、高速冷凍離心機(Allegra X-30R，Beckman)、紫外可見分光光度計(SP-UV 2500，上海光譜儀器有限公司)、氣相色譜儀(Trace GC，Thermo Fisher)、質構儀(ta-xt plus，英國/Stable Micro System)。

1.2 貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1脂肽物質制備

1.2.1 菌株ZSY-1活化及發(fā)酵培養(yǎng) 菌株ZSY-1活化:采用接種環(huán)挑取1環(huán)菌株ZSY-1 20%甘油-80℃保藏菌種于新鮮NA平板上劃線，并于(26±0.5)℃恒溫培養(yǎng)24 h。

菌株ZSY-1種子發(fā)酵液制備:采用接種環(huán)挑取1環(huán)活化后的菌株ZSY-1接種至裝有100 mL BPY發(fā)酵液的250 mL三角瓶中，并于(28± 0.5)℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后獲得種子發(fā)酵液。

菌株ZSY-1發(fā)酵培養(yǎng):按照φ=1%接種量，將菌株ZSY-1種子發(fā)酵液接種至裝有800 mL BPY發(fā)酵液的1 000 mL三角瓶中，并于(28± 0.5)℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)96 h后終止發(fā)酵。共接種3瓶。

1.2.2 脂肽物質制備 參照文獻[36]從2.4 L BPY發(fā)酵液中提取脂肽物質，并經(jīng)冷凍干燥后使用無菌水配制成質量濃度分別為20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL和800 μg/mL的脂肽物質溶液，用于后續(xù)試驗。

1.3 番茄采前和采后脂肽物質處理

1.3.1 采前噴霧處理 于番茄采收前6 h每隔 2 h使用100 mL小噴壺噴霧不同濃度脂肽物質溶液，共噴霧3次，每處理處理6行，每次以果實表面不形成液滴滴落為宜。待最后一次噴霧處理果實表面干燥后進行采收，使用塑料周轉箱運回實驗室，剔除畸形果、機械損傷果，并挑選成熟度接近的紅熟果于20℃進行貯藏試驗。以無菌水為對照(CK)，每個處理10 kg果實，重復3次。

1.3.2 采后浸泡處理 采收未經(jīng)采前處理的紅熟番茄，同樣使用塑料周轉箱運回實驗室，剔除畸形果、機械損傷果，并挑選成熟度接近的紅熟果進行試驗。每個處理10 kg果實，重復3次，并分別用不同濃度脂肽物質溶液浸泡處理1 h，室溫風干后置于套有PE保鮮袋的塑料框中，于(20± 0.5)℃開展貯藏試驗。以無菌水為對照(CK)，分別測定其0 d、3 d、6 d、9 d和12 d各項指標(病果率、果肉平均硬度、乙烯釋放量及多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、纖維素酶和脂氧合酶活性)。

1.4 番茄貯藏期早疫病發(fā)生統(tǒng)計

在番茄采后貯藏期間分別于貯藏3 d、6 d、 9 d和12 d時統(tǒng)計采前噴霧處理組和采后浸泡處理組中各處理的病果數(shù)，并計算病果率。

病果率(%)=(各處理病果數(shù)量/各處理果實總數(shù))×100

1.5 番茄貯藏期果實硬度和乙烯釋放量測定

使用質構儀(ta-xt plus)圍繞番茄果實赤道部(避開腔室隔)等距離取4個點測定(探頭直徑 2 mm)果實硬度[13]，每處理測定5個果實。乙烯釋放量參照李艷嬌等[37]的方法采用氣相色譜儀(Thermo Fisher，Trace GC)進行測定。

1.6 番茄貯藏期軟化相關酶活性測定

從5個果實中取果肉30 g，采用購自索萊寶的試劑盒(規(guī)格見“1.1.2”)按照說明書分別對番茄果實的多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、纖維素酶和脂氧合酶活性進行測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理處理，Sigmaplot 10.0軟件制作折線圖，SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 采前噴霧處理對番茄采后早疫病控制效果

由圖1可知，脂肽物質不同濃度間番茄采后早疫病害防治效果存在一定差異；隨著貯藏時間的延長各處理病果率均呈現(xiàn)升高趨勢，貯藏9 d后病果率增長最快；同一貯藏時期，脂肽質量濃度越高，病果率越低；貯藏至12 d，脂肽物質質量濃度為800 μg/mL和600 μg/mL時，番茄早疫病病果率明顯低于其他處理，病果率分別為(15.27±4.43)%和(11.43±1.51)%；脂肽物質質量濃度≤100 μg/mL時，番茄采后病果率均達20%以上。另外，圖1和圖2顯示，同其他處理相比雖然脂肽物質質量濃度為800 μg/mL和600 μg/mL時可較好控制番茄采后早疫病發(fā)生，但貯藏12 d時病果率高于10%同樣造成較大損失，說明采前噴霧處理對番茄采后早疫病控制效果不佳。

圖1 不同質量濃度貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1脂肽物質采前噴霧處理對番茄采后貯藏期早疫病控制效果的影響Fig.1 Control effect on tomato early blight during postharvest storage under pre-harvest spraying treatment with different mass concentrations of B.velezensis ZSY-1 lipopeptides

A～G依次為20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL，圖4同

2.2 采后浸泡處理對番茄采后早疫病控制效果

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長各處理病果率均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，其中以脂肽物質質量濃度在200～800 μg/mL范圍內病果率較低，均低于10%，且在貯藏前9 d無病果出現(xiàn)；脂肽物質質量濃度為100 μg/mL時，雖對番茄采后早疫病有一定控制效果，且貯藏3～12 d病果率均顯著低于對照(圖4)，但貯藏12 d后果實表面開始有淺褐色病斑出現(xiàn)，病果率達10%；脂肽物質質量濃度低于100 μg/mL時，處理組病果率雖低于對照，但病果率從貯藏至第9天開始便高于10%。說明浸泡處理脂肽物質質量濃度高于 200μg/mL方可使番茄在采后20 ℃有效貯藏12 d，早疫病病果率控制在10%以下。

圖3 不同質量濃度貝萊斯芽孢桿菌 ZSY-1脂肽物質采后浸泡處理對番茄采后貯藏期早疫病控制效果的影響Fig.3 Control effect of tomato early blight during postharvest storage under postharvest soaking treatment with different mass concentrations ofB.velezensis ZSY-1 lipopeptides

圖4 不同質量濃度貝萊斯芽孢桿菌 ZSY-1脂肽物質采后浸泡處理對番茄采后貯藏12 d早疫病控制效果的影響Fig.4 Control effect of tomato early blight after storage 12 d under postharvest soaking treatment with different

2.3 貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1脂肽物質對番茄采后硬度變化的影響

由圖5-A可知，不同質量濃度脂肽物質采前噴霧處理后的番茄貯藏期果肉平均硬度同對照相比差異不顯著，說明采前噴霧處理對番茄采后軟化無明顯作用。圖5-B顯示，一定質量濃度脂肽物質采后浸泡處理對延緩番茄采后貯藏期軟化具有明顯作用，其中以脂肽物質質量濃度為200 μg/mL和400 μg/mL時延緩效果較好，貯藏 12 d時番茄果肉平均硬度分別為對照的1.48倍和1.55倍；脂肽物質質量濃度為800 μg/mL和600 μg/mL時，浸泡處理對番茄采后軟化則無明顯延緩作用，貯藏12 d后的番茄果肉平均硬度同對照相比差異不顯著，說明浸泡處理方式下高質量濃度和低質量濃度的脂肽物質均對番茄采后軟化無明顯延緩作用。

A.采前噴霧處理；B.采后浸泡處理

2.4 采后浸泡處理對番茄采后軟化相關酶活性的影響

由圖6可知，不同處理下的番茄果實多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶和脂氧合酶活性均隨著貯藏時間的延長而呈現(xiàn)逐漸升高趨勢；纖維素酶活性在整個貯藏期均高于初始值，呈現(xiàn)先升高后下降再升高趨勢；脂肽物質質量濃度為200 μg/mL和400 μg/mL時，雖然2處理對4種酶活性影響差異不顯著，但2處理組下的4種酶活性明顯低于對照和其他處理組，說明脂肽物質質量濃度在 200～400 μg/mL范圍內對延緩4種酶活性升高具有一定作用，同時進一步說明4種酶活性同番茄采后軟化密切相關。

A.多聚半乳糖醛酸酶；B.β-半乳糖苷酶；C.纖維素酶；D.脂氧合酶

2.5 采后浸泡處理對番茄貯藏期乙烯釋放量的影響

由圖7可知，各處理均在貯藏3～6 d期間乙烯釋放量迅速上升，斜率明顯高于其他時間段。整個貯藏期，脂肽物質質量濃度除400 μg/mL和200 μg/mL外，其余各處理乙烯釋放量呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，并于貯藏9 d時達峰值；貯藏0～ 9 d期間，脂肽質量濃度為400 μg/mL和200 μg/mL時番茄乙烯釋放量低于其他處理，貯藏至 12 d時乙烯釋放量與其他處理差異不顯著，但高于第9天，說明脂肽質量濃度為200～400 μg/mL時可有效降低番茄貯藏期間的乙烯釋放量，推遲乙烯釋放高峰，對延長其貯藏期具有較好作用。

圖7 不同質量濃度貝萊斯芽孢桿菌 ZSY-1脂肽物質對貯藏期番茄乙烯釋放量的影響Fig.7 Ethylene release of tomato during storage with different mass concentrations of B.velezensis ZSY-1 lipopeptides

3 討論與結論

番茄早疫病作為番茄采后常見的真菌病害之一，其病原孢子在低溫下亦可萌發(fā)導致病害發(fā)生，對番茄采后貯藏、貨架供應及食品安全具有重要影響[16,38-39]。雖然目前為有效防治該采后病害發(fā)生，研究者從采收時期(綠熟到初熟)、采前化學防治、拮抗微生物篩選和誘導抗性等角度進行了大量探究[40]，然而綠熟到初熟期采收導致番茄風味降低與不易軟化、化學防治的病原菌抗藥性與藥劑殘留、拮抗微生物低溫下活性下降以及誘導抗性技術的生產(chǎn)實踐應用研究薄弱等問題亦不可忽視，因此模擬商業(yè)貯藏模式下的生物防治技術研究顯得尤為重要。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)iturin A與肉桂精油復配不僅對番茄采后軟腐病菌(Rhizopusstolonifer)具有良好抑制作用，而且可有效降低櫻桃番茄貯藏期腐爛率和延緩軟化[35]，說明脂肽物質在病害防治和保持櫻桃番茄品質方面均具有積極作用。然而，有關脂肽物質對模擬貯藏條件下的番茄采后早疫病發(fā)生和采后軟化的控制效果還不清楚，因此本研究從生產(chǎn)實際出發(fā)，模擬番茄商業(yè)貯藏條件，對菌株ZSY-1脂肽物質的番茄果實采后早疫病發(fā)生的控制和軟化延緩效果進行測定，旨在為番茄果實采后生物貯藏保鮮技術和產(chǎn)品開發(fā)奠定理論基礎。

本研究以目前常用的2種處理方式(采前噴霧和采后浸泡處理)模擬商業(yè)貯藏模式考察了菌株ZSY-1不同質量濃度脂肽物質對紅熟番茄果實采后早疫病發(fā)生的控制和軟化延緩效果，結果表明：2種處理方式中以浸泡處理效果較優(yōu)；浸泡處理方式下高質量濃度的脂肽物質(800 μg/mL和600 μg/mL)雖然對番茄采后早疫病害發(fā)生具有較好控制效果，但加速了番茄采后軟化，推測這種現(xiàn)象可能與脂肽物質的強表面活性作用有關；脂肽物質在質量濃度為200 μg/mL和400 μg/mL時不僅可有效控制番茄采后早疫病病發(fā)生，而且可有效延緩番茄采后軟化，研究結果與蔣夢曦等[35]相同，進一步證明脂肽物質在延緩番茄果實采后軟化方面具有積極作用。另外，在番茄采后早疫病控制方面，菌株ZSY-1脂肽物質同赤霉素與蕓苔素內酯[41]、酵母甘露聚糖[24]、殼聚糖[42]、植物精油[43]以及解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)004抗菌物質與異菌脲[40]等具有相似效果，說明菌株ZSY-1脂肽物質是一種控制番茄采后早疫病發(fā)生和延緩軟化的優(yōu)良生物保鮮劑候選開發(fā)源。

隨后為進一步驗證脂肽物質對番茄果實采后軟化延緩效果，本研究還對目前已證實的與番茄采后軟化密切相關的酶活性和乙烯釋放量進行了測定，結果表明：脂肽質量濃度200 μg/mL和400 μg/mL可有效延緩番茄采后軟化且貯藏第3天起，不僅2個處理下的多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、纖維素酶、脂氧合酶活性和乙烯釋放量均顯著低于對照組，而且乙烯釋放量在整個貯藏期均呈現(xiàn)上升趨勢，未出現(xiàn)下降。研究結果與葉面噴施維生素A和鈣混劑[44]、一氧化氮(NO)[37]及乙醇新型固體緩釋劑[45]等處理具有明顯相似性。王文雅等[46]研究發(fā)現(xiàn)貯藏期Ca2+處理番茄乙烯釋放量呈現(xiàn)先升高后下降再升高趨勢；LOX酶活性呈現(xiàn)先下降后升高再下降又升高趨勢；生吉萍等[1]發(fā)現(xiàn)貯藏期番茄果實PG和LOX酶活性呈現(xiàn)先升高后趨于穩(wěn)定；陳少陽[47]用1-MCP與紫外以及檸檬醛組合處理番茄果實，發(fā)現(xiàn)纖維素酶活性在貯藏期前3d急劇下降，隨后變化趨勢則相對平緩；王沙沙[48]用H2S和D/L-CD處理后發(fā)現(xiàn)番茄纖維素酶活性在貯藏至第3天時最高；多聚半乳糖醛酸酶活性呈波動下降趨勢；硬度呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，與本研究有差異，這可能與處理方式、采收時期、貯藏條件、番茄品種以及處理藥劑不同有關。

綜上，雖然本研究發(fā)現(xiàn)菌株ZSY-1脂肽物質質量濃度為200 μg/mL和400 μg/mL時可有效延緩番茄采后硬度下降和控制番茄采后早疫病發(fā)生，降低番茄軟化相關酶活性，推遲乙烯釋放高峰與降低乙烯釋放量，但在后期還需進一步擴大試驗規(guī)模(加大貯藏試驗量和增加試驗品種)，并通過實時熒光定量PCR(qPCR)驗證相關基因表達量來進一步確定菌株ZSY-1脂肽物質延緩軟化的效果，旨在明確脂肽物質在番茄采后貯藏保鮮中的應用潛力，為新型生物保鮮產(chǎn)品和技術開發(fā)提供參考。