王建勛，康 鳳，孫 玲，顏 霞，黃麗麗

(1.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100；2.國家旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100; 3.西北農(nóng)林科技大學 植物保護學院，陜西楊凌 712100)

蘋果是中國重要的經(jīng)濟作物，由蘋果樹腐爛病菌Valsamali引起的蘋果樹腐爛病嚴重制約了中國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-3]。目前對于蘋果樹腐爛病主要依賴化學藥劑防治，但是化學藥劑殘留給環(huán)境和人類帶來了巨大的危害[4]。因此，利用環(huán)保型和可持續(xù)的生物菌劑保護果園免受蘋果樹腐爛病菌的侵害勢在必行[5]。目前為止，已有一些用于防治Valsamali的有益微生物被發(fā)現(xiàn)，但防治僅處于初步階段[5-7]。

放線菌是一類革蘭氏陽性細菌，可以產(chǎn)生大量的代謝物和抗生素，能夠?qū)χ参锊≡鸬揭种频淖饔肹8]。放線菌通過降解目標真菌細胞壁、產(chǎn)生抗真菌化合物來阻止病原菌的侵染[9-10]。楊凌糖絲菌(SaccharothrixyanglingeniesHhs.015，Hhs.015)是從黃瓜根部分離出來的一株稀有放線菌[11]，該菌在田間試驗顯示出對番茄葉霉病和蘋果樹腐爛病具有良好的防治效果[12-13]。有研究從Hhs.015發(fā)酵液中提取了活性物質(zhì)異黃酮和戊霉素，以及2個戊烯大環(huán)類脂類物質(zhì)WH01和WH02[14-15]。轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細胞在某個時間或某個狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組可以研究生物在不同環(huán)境、宿主等情況下的基因表達變化，闡述宿主或環(huán)境對生物的影響[16]。Kang等通過轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了生防菌芽孢桿菌CC09在小麥體內(nèi)抗病的分子機制[17]。Kr?ber等[18]利用轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)生防菌BacillusamyloliquefaciensFZB42生物膜形成過程中，抗菌肽LCI基因和多種次級代謝物高效表達，揭示了生物膜的形成對解淀粉芽孢桿菌發(fā)揮生防作用的重要作用。

放線菌作為生防菌已被廣泛研究，但是對于稀有放線菌屬糖絲菌的抗菌機制研究相對較少。本研究對楊凌糖絲菌Hhs.015拮抗蘋果樹腐爛病菌Valsamali的過程進行轉(zhuǎn)錄組分析，試圖探究Hhs.015在抗真菌過程中的分子機制，對闡明楊凌糖絲菌Hhs.015拮抗蘋果樹腐爛病菌的分子機理奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 楊凌糖絲菌Hhs.015和蘋果樹腐爛病菌Valsamali均來自西北農(nóng)林科技大學植物保護學院果樹病害病原生物學及綜合防治實驗室。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：200 g去皮馬鈴薯，切成小塊加水煮沸30 min，然后用4層紗布過濾，在濾液中加入20 g葡萄糖和15 g瓊脂粉，定容至1 L，高壓滅菌后 備用。

黃豆培養(yǎng)基：稱取20 g黃豆，用粉碎機打碎后煮沸30 min，4層紗布過濾，然后在濾液中加入10 g葡萄糖，5 g可溶性淀粉，2 g蛋白胨，2 g酵母膏，2 g NaCl，1 g CaCO3，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KH2PO4，15 g瓊脂粉，定容至1 L，高溫滅菌備用。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 楊凌糖絲菌Hhs.015樣品制備

將保存的楊凌糖絲菌Hhs.015采用劃線法在黃豆培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 28 ℃。Valsamali則利用直徑為10 mm的打孔器打取菌餅在PDA培養(yǎng)基上進行活化，培養(yǎng)溫度為25 ℃。將活化好的Hhs.015直線轉(zhuǎn)接至新鮮黃豆培養(yǎng)基中央28 ℃培養(yǎng)3 d，然后將活化好的Valsamali用無菌手術(shù)刀切成2～3 mm的長條置于Hhs.015兩側(cè)，共培養(yǎng)3 d(圖1)，以空白PDA為對照，設置3個生物學重復。

圖1 Hhs.015拮抗Valsa mali試驗Fig.1 Hhs.015 antagonizes Valsa mali

1.3 楊凌糖絲菌RNA的提取、建庫、數(shù)據(jù)質(zhì)控

使用無菌牙簽分別收集Valsamali拮抗培養(yǎng)和空白PDA處理的Hhs.015菌體，用錫箔紙包裹后立即置于液氮中，利用裝有干冰的冰盒將收集的樣品送至北京諾禾致源生物公司提取RNA、質(zhì)檢、建庫以及轉(zhuǎn)錄組測序。

將質(zhì)量合格的RNA用來構(gòu)建文庫，使用Qubit2.0進行初步定量，再用qRT-PCR對文庫有效濃度進行準確定量，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進行Illumina測序。為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，對原始數(shù)據(jù)進行過濾。同時對Clean data進行Q20、Q30和GC含量計算，后續(xù)所有分析均是基于Clean data進行的高質(zhì)量分析。使用R語言對樣品間基因表達水平相關(guān)性進行Pearson相關(guān)系數(shù)計算，以評估RNA-seq的整體質(zhì)量。相關(guān)系數(shù)越接近1，表明樣品之間表達模式的相似度越高[19]。

1.4 差異表達基因(DEGs)分析

1.5 差異表達基因GO、KEGG注釋

為了明確差異表達基因的生物學功能，闡明Hhs.015的抗菌機制。將差異表達基因進行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析。即以Hhs.015基因組中所有基因的GO和KEGG注釋為背景，使用超幾何分布檢驗對DEG進行GO和KEGG途徑富集分析。GO數(shù)據(jù)庫分為三大類：細胞學組件(Cellular Component，CC)，分子功能(Molecular Function，MF)，生物學途徑(Biological Process，BP)。通過R包軟件GOseq實現(xiàn)差異表達基因的GO富集分析[21]，以校正后P<0.05的GO term作為差異表達基因顯著富集，并繪制成散點圖。

KEGG是一個重要的通路數(shù)據(jù)庫，可以系統(tǒng)的分析基因功能和基因組信息，是生物代謝分析及代謝網(wǎng)絡研究的重要工具[22]。通過KOBAS v2.0軟件分析差異表達基因KEGG富集分析，結(jié)合GraphPad Prism軟件繪制柱狀圖。

1.6 差異表達基因COG注釋

Cluster of Orthologous Groups of Proteins(COG)，是由NCBI創(chuàng)建并維護的蛋白數(shù)據(jù)庫，通過比對可以將某個蛋白序列注釋到某一個COG中，從而推測該序列的功能。將差異表達基因進行COG注釋，可明確差異表達基因所調(diào)節(jié)的生物學功能，從而分析Hhs.015在拮抗Valsamali過程中的差異基因功能分布。

1.7 DEGs中分泌蛋白及碳水化合物活性酶 分析

將差異表達基因利用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM Server v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線工具預測其中的分泌蛋白。

Carbohydrate-Active enzymes Database是碳水化合物酶相關(guān)的專業(yè)數(shù)據(jù)庫[23]，包括能催化碳水化合物降解、修飾、以及生物合成的相關(guān)酶系家族。包含五個主要分類：糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases, GHs)、糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycol Transferases, GTs)、多糖裂解酶(Polysaccharide Lyases, PLs)、糖酯酶(Carbohydrate Esterases, CEs)和氧化還原酶(Auxiliary Activities, AAs)。此外，還包含與碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Carbohydrate-Binding Modules，CBMs)。使用Diamond軟件，將差異表達基因與CAZy數(shù)據(jù)庫進行比對，再結(jié)合分泌蛋白得到注釋結(jié)果。

1.8 抗菌過程的次級代謝產(chǎn)物基因簇分析

利用antiSMASH(5.2.0)(https://antismash.secondarymetabolites.org/)預測Hhs.015中的次級代謝產(chǎn)物，并分析差異表達基因在次級代謝產(chǎn)物中的分布，明確Hhs.015在拮抗Valsamali過程中關(guān)鍵的次級代謝產(chǎn)物。

1.9 qRT-PCR驗證DEGs

為了充分證實測序結(jié)果的可靠性，選取13個基因進行qRT-PCR驗證，并以rpoA[24]作為內(nèi)參基因。使用軟件Primer Premier 5.0設計定量引物(表1)，以RevertAid RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，使用RealStar Green Mixture 進行實時熒光定量PCR檢測?？傮w系為20 μL：cDNA 1 μL、Primer F/R 1 μL、RealStar Green Mixture 10 μL、ddH2O 7 μL。使用Roche lightcycler 96進行反應，反應程序為：95 ℃，10 min；45個循環(huán)(95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s)；溶解：95 ℃，15 s ；65 ℃，60 s；97 ℃，1 s。每組試驗設置3個生物學重復，使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量[25]。

表1 qRT-PCR檢測基因及引物序列Table 1 Gene and primer sequence detected by qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

通過測序獲得raw reads總數(shù)為108 587 756條，過濾后的clean reads總數(shù)為107 410 364條，clean reads的堿基總數(shù)為16.15 Gb(表 2)。樣品誤差率小于0.03%，Q20>97.50%，Q30> 92.88%，GC含量為70.56%～70.79%。從樣本相關(guān)性熱圖(圖2)可以看出，樣本間相關(guān)性較好，取樣合理。因此，本次測序數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)良，可以用于后續(xù)分析研究。

表2 測序結(jié)果與映射比率統(tǒng)計Table 2 Statistics of sequencing production and mapping ratio

橫縱坐標為各樣本相關(guān)系數(shù)的平方

2.2 差異表達基因分析

圖3 差異表達基因火山圖Fig.3 Volcano map of different expression genes

2.3 GO和KEGG富集分析

將GO分析的Term繪制成散點圖(圖 4)，可以看到上調(diào)表達基因主要集中在輔因子結(jié)合、水解酶活性、反轉(zhuǎn)運蛋白活性、碳水化合物代謝等途徑。下調(diào)表達基因主要集中在陽離子結(jié)合、草酸和羧酸代謝、類異戊二烯生物合成和代謝過程、脂質(zhì)生物合成過程、谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程、脂質(zhì)代謝等過程。氧化還原過程及酶活性所涉及的基因一部分上調(diào)一部分下調(diào)。雖然最終表現(xiàn)為Hhs.015成功抑制了Valsamali的生長，但是在此過程中Hhs.015的代謝過程受到了Valsamali極大的影響。

圖4 差異基因GO顯著性富集分析Fig.4 Enrichment analysis of GO in differentially expressed genes

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，ABC轉(zhuǎn)運蛋白、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸的生物合成、代謝途徑、抗生素的生物合成、核糖體等通路基因顯著性上調(diào)表達。同時，ABC轉(zhuǎn)運蛋白、淀粉和蔗糖代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、代謝途徑等通路基因部分下調(diào)表達?？梢钥吹?，Hhs.015的淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因下調(diào)表達，阻礙了能量的供應，但是通過增強部分氨基酸代謝補充一部分能量的供應，滿足Hhs.015生長的基本需求。

圖5 差異基因KEGG分析Fig.5 KEGG analysis of differentially expressed genes

2.4 COG注釋差異基因功能分析

將差異表達基因進行COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)注釋，533個差異基因共有360個注釋到COG數(shù)據(jù)庫，包含241個上調(diào)表達基因，119個下調(diào)表達基因(圖6)。在上調(diào)表達基因中“[Q]次級代謝產(chǎn)物生物合成，運輸和分解代謝(42)”“[G]碳水化合物運輸和代謝(42)”“[R]僅通用功能預測(35)”“[E]氨基酸運輸和代謝(33)”“[I]脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和新陳代謝(19)”這5類最多，占到70.95%。而類別“[E]氨基酸運輸和代謝(16)”“ [T]信號轉(zhuǎn)導機制(16)”“[R]僅通用功能預測(14)”“[K]轉(zhuǎn)錄(11)”“[M]細胞壁、膜包膜生物發(fā)生(10)”在下調(diào)表達基因中所占比例較高，達到56.30%。

圖6 差異表達基因的COG注釋分析Fig.6 Statistics of COG annotation for DEGs

可以進一步發(fā)現(xiàn)，在面對Valsamali的脅迫時，Hhs.015次級代謝產(chǎn)物合成、運輸基因高效表達，起到關(guān)鍵的抗菌作用。同時碳水化合物、氨基酸和脂類的代謝增強，為Hhs.015的生長及次級代謝物的合成提供必要的能量。部分信號轉(zhuǎn)導機制基因顯著性下調(diào)，Valsamali分泌的物質(zhì)破壞了Hhs.015信號的傳遞，還破壞了Hhs.015細胞壁、細胞膜的合成。

基因Hhs.015_007438，在[G]、[E]、[P]、[R]中均有注釋，且為顯著性上調(diào)表達，進一步分析發(fā)現(xiàn)，Hhs.015_007438是一個MFS(major facilitator superfamily)轉(zhuǎn)運蛋白家族基因，還有另外2個顯著性上調(diào)的MFS家族基因，Hhs.015_000830和Hhs.015_002439。

2.5 分泌蛋白及碳水化合物活性酶差異表達基因分析

差異表達基因結(jié)合分泌蛋白分析發(fā)現(xiàn)有16個上調(diào)表達的分泌蛋白編碼基因，10個下調(diào)表達基因(表 3)。在上調(diào)表達的分泌蛋白中，包含α-甘露糖苷酶、ErfK/YbiS/YcfS/YnhG家族蛋白、鐵配合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白、ABC轉(zhuǎn)運蛋白底物結(jié)合蛋白、α-葡萄糖苷酶等等。在下調(diào)表達分泌蛋白中，只有一個含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白，其他均為未知功能的假想蛋白。

表3 差異表達基因中的分泌蛋白及功能Table 3 Secretory proteins and functions in differentially expressed genes

結(jié)合碳水化合物酶數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因中，有36個基因具有碳水化合物注釋，27個基因上調(diào)表達，9個基因下調(diào)表達(圖7)。分泌型的碳水化合物活性酶全部上調(diào)表達，主要集中在碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和糖苷水解酶類。在非分泌型的碳水化合物活性酶中大部分為上調(diào)表達，同樣也主要集中在碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和糖苷水解酶類，部分還有氧化還原酶。下調(diào)表達的基因主要是糖基轉(zhuǎn)移酶，還有部分碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和糖苷水解酶類。

圖7 分泌型碳水化合物活性酶(A)及非分泌性碳水化合物活性酶(B)的表達情況Fig.7 Secreted carbohydrate active enzyme(A) and non-secreted carbohydrate active enzyme(B) expression

2.6 抗菌關(guān)鍵次級代謝產(chǎn)物分析

差異表達基因結(jié)合次級代謝基因簇分析表明，在Hhs.015的28個次級代謝物基因簇中，七個基因簇在抗菌過程中上調(diào)表達的基因較多，分別是基因簇9、10、12、13、17、18、19，上調(diào)表達的基因個數(shù)分別為27、10、14、8、11、8、25(圖8)。

圖8 Hhs.015次級代謝物中的差異表達基因Fig.8 Different expression genes in Hhs.015 secondary metabolites

AntiSMASH[26]分析表明(表 4)，基因簇18與噴他霉素的相似性達到80%，該基因簇在拮抗Valsamali過程中有8個基因上調(diào)表達。噴他霉素屬于多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有較強的抗真菌特性，前期已經(jīng)從Hhs.015中分離鑒定到pentaene macrolides，對Valsamali具有較好的抗性[14]。基因簇19與已知的macrotermycins具有96%的相似性，在拮抗過程中達到25個基因上調(diào)表達。曾有研究表明Macrotermycins A和C對人致病性金黃色葡萄球菌具有抗菌活性，它們還對白蟻真菌園的真菌寄生蟲具有選擇性的抗真菌活性[27]。然而剩下的Cluster 9、10、12、13、17與已知的物質(zhì)相似性都比較低，表明Hhs.015在抗真菌過程中還有許多新物質(zhì)在發(fā)揮作用，可見Hhs.015具有一定的天然抗生素開發(fā)潛力。

表4 上調(diào)表達基因集中的次級代謝物基因簇Table 4 Up-regulated gene in secondary metabolite gene cluster

2.7 qRT-PCR分析

從Hhs.015的差異表達基因中選擇13個基因，利用qRT-PCR驗證測序數(shù)據(jù)的可靠性。圖9表明qRT-PCR檢測結(jié)果與測序數(shù)據(jù)所分析的差異表達基因趨勢一致。這13個基因包括4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、絲氨酸3-脫氫酶、轉(zhuǎn)錄延伸因子GreA、包含CHAP域的蛋白、ATP結(jié)合蛋白、多糖生物合成酪氨酸自身激酶等等。

圖9 qRT-PCR分析部分差異表達基因Fig.9 qRT-PCR analysis of some differentially expressed genes

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)錄組分析在抗菌物質(zhì)對微生物的抗性機制研究方面取得了不少成果，比如高夢莎研究發(fā)現(xiàn)殺菌劑臭氧通過破壞副溶血弧菌細胞膜的通透性、抑制活性氧清除酶的活性等過程殺死副溶血弧菌[28]。高亮等[29]研究殼聚糖處理辣椒疫霉后，通過抑制辣椒疫霉細胞膜、運動及糖代謝相關(guān)功能，從而起到了抑制辣椒疫霉生長的作用。本研究發(fā)現(xiàn)楊凌糖絲菌Hhs.015在拮抗Valsamali的過程中，Hhs.015的能量供應受到一定的阻礙，但是通過增強部分碳水化合物、氨基酸、脂類等物質(zhì)代謝補充一部分能量的供應，為Hhs.015的生長及次級代謝物的合成提供必要的能量。Hhs.015的信號傳遞、細胞壁和細胞膜的合成等功能也受到Valsamali的抑制。與此同時，Hhs.015自身抗菌物質(zhì)的合成和運輸加強，比如一些次級代謝產(chǎn)物。ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族和MFS超家族幾乎占據(jù)了生物所有轉(zhuǎn)運蛋白的一半[30]。MFS轉(zhuǎn)運蛋白具有營養(yǎng)吸收，代謝產(chǎn)物、有害物質(zhì)排出等功能[31-33]，對于Hhs.015產(chǎn)生的抗生素運輸和毒性物質(zhì)排出具有重要作用。在拮抗過程中，ABC和MFS轉(zhuǎn)運蛋白顯著性上調(diào)表達是為了更好的適應環(huán)境而產(chǎn)生的一種自我保護機制，這對于提高產(chǎn)Hhs.015自身抗毒性物質(zhì)和抗生素的運輸具有重要意義。

Hhs.015在受到Valsamali的脅迫時，分泌型和非分泌型的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和糖苷水解酶類絕大部分上調(diào)表達。碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以提高酶的催化效率，為Hhs.015的生長以及抗生素的合成提供必要的能量。真菌細胞壁中多糖成分占到干質(zhì)量的80%[34]，碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以特異性結(jié)合多糖底物，包括纖維素、幾丁質(zhì)、淀粉、糖原類等物質(zhì)，糖苷水解酶的大量上調(diào)表達破壞了Valsamali細胞壁的合成，降低了Valsamali的毒性，同時能夠高效的抑制Valsamali的生長[35]。還預測到在拮抗過程中有5種次級代謝物基因簇的基因大量上調(diào)表達，并且這5種次級代謝物與已知的物質(zhì)相似性較低。糖絲菌屬為稀有放線菌，近幾年也不斷的從糖絲菌屬中發(fā)現(xiàn)了新的抗菌物質(zhì)，比如Tianchimycin[36]、cyanogriside I 和cyanogriside J[37]，說明在Hhs.015抗真菌過程中可能還有新的物質(zhì)在發(fā)揮著重要作用。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了楊凌糖絲菌Hhs.015拮抗Valsamali過程中發(fā)揮主要作用的通路表達情況，還預測到5種新的次級代謝物基因簇的基因在抗菌過程中大量上調(diào)表達。今后可以分離獲得相關(guān)基因簇的次級代謝產(chǎn)物，有望獲得高效的抗菌物質(zhì)，為防治病原真菌提供新的材料。