曲 亮,王星果,郭 軍,竇套存,胡玉萍,馬 猛,李永峰,王克華

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225125)

蛋雞的生產(chǎn)性能直接與其養(yǎng)殖效益掛鉤，一直是蛋雞行業(yè)的重要研究課題[1]，而能量水平對(duì)生產(chǎn)性能的影響是其中一個(gè)重要的研究方向，也越來越受到人們的重視[2-5]，其中包括對(duì)育成期蛋雞進(jìn)行能量調(diào)控，檢測(cè)其對(duì)生產(chǎn)性能的影響。研究表明育成期高能飼喂能明顯提高蛋雞的生產(chǎn)性能，如使用不同能量的飼料飼喂育成蛋雞的研究中發(fā)現(xiàn)，高能飼喂能顯著提高體質(zhì)量、體尺、產(chǎn)蛋率和屠宰性能[6-10]。江蘇省家禽科學(xué)研究所蛋雞研究室(本研究室)前期研究了不同能量水平飼料對(duì)育成期蛋雞的影響，發(fā)現(xiàn)能量水平越高，蛋雞體質(zhì)量越大，開產(chǎn)日齡越早[11]。

肝臟是重要的代謝器官，在雞等家禽中更是物質(zhì)代謝特別是脂質(zhì)代謝的主要器官，對(duì)育成期的能量調(diào)控肯定起著關(guān)鍵作用[12]。同時(shí)，產(chǎn)蛋與肝臟也有十分密切的關(guān)系[13]。由于雞蛋中卵黃的30%由脂質(zhì)構(gòu)成，而這些脂質(zhì)均來源于肝臟。肝臟中合成的大部分脂質(zhì)以脂蛋白的形式運(yùn)輸出肝臟，經(jīng)血液循環(huán)至卵泡，被卵母細(xì)胞吸收儲(chǔ)存，形成卵黃[14]。因此，肝臟脂質(zhì)代謝的快慢影響雞蛋卵黃形成的速度，從而影響產(chǎn)蛋。

近年來，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序逐漸用于研究各種生物過程[15-16]。已有一些轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在雞肝臟中的研究報(bào)道，如對(duì)盧氏綠殼蛋雞產(chǎn)蛋前期和高峰期的肝臟、雌激素處理蛋雞的肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，均發(fā)現(xiàn)基因參與肝臟代謝[17-18]，本研究室成員也運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)LNA-122、GH處理的雞肝臟細(xì)胞中若干基因參與代謝過程，尤其是脂質(zhì)代謝[19-20]。本研究室后期對(duì)高能飼喂的育成期蛋雞進(jìn)行肝臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與低能組相比，有188個(gè)基因差異表達(dá)，對(duì)差異表達(dá)基因的功能和信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝相關(guān)過程富集的基因較多，且顯著富集的信號(hào)通路都和脂質(zhì)代謝相關(guān)[21]。然而在高能組中的雞仍有開產(chǎn)早晚之分，有必要對(duì)其進(jìn)行深入分析。本研究選取高能飼喂育成期蛋雞，并對(duì)其中開產(chǎn)與未開產(chǎn)雞的肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析比較其表達(dá)譜，探明在高能飲食狀態(tài)下肝臟中影響開產(chǎn)的基因，為提高產(chǎn)蛋打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)

選用江蘇省家禽科學(xué)研究所(本單位)培育的C3蛋雞品系，8周齡前常規(guī)飼養(yǎng)，滿8周齡時(shí)選取體質(zhì)量相近母雞80只，分為8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。9～18周齡，定量飼喂代謝能水平為12.14 MJ/kg的高能飼糧，18周齡后自由采食標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)水平的飼糧。整個(gè)試驗(yàn)過程參照NRC(1994)標(biāo)準(zhǔn)配制試驗(yàn)日糧，分9～18周齡和19周齡后兩個(gè)階段配制，配以粉料飼喂。9～16周齡在育成雞舍四層階梯籠內(nèi)飼養(yǎng)(5只/籠)，17周齡起在產(chǎn)蛋雞舍三層階梯籠內(nèi)飼養(yǎng)(1只/籠)。整個(gè)試驗(yàn)期間，所有雞只可以自由飲水，并執(zhí)行常規(guī)光照和免疫等程序。

1.2 RNA-seq高通量測(cè)序

以20周齡作為開產(chǎn)早晚的界限，開產(chǎn)雞均為19周齡開產(chǎn)，未開產(chǎn)雞均在20周齡末仍未開產(chǎn)，20周齡末每個(gè)重復(fù)選取1只開產(chǎn)雞和1只未開產(chǎn)雞，稱體質(zhì)量后各取最接近平均值的3只，未開產(chǎn)雞分別為N1、N2、N3，開產(chǎn)雞分別為R1、R2、R3，屠宰并取出肝臟組織，放入液氮中保存。

使用TRIzol試劑提取肝臟組織總RNA，使用瓊脂糖電泳和Agilent 2100檢測(cè)RNA質(zhì)量。利用rRNA去除試劑盒去除rRNA，并通過離子打斷的方式將RNA打斷成200～300 bp的片段。RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，再經(jīng)PCR富集構(gòu)建cDNA文庫，該文庫通過熒光定量檢測(cè)其大小和濃度，上機(jī)至Illumina Nextseq500平臺(tái)進(jìn)行 測(cè)序。

1.3 序列分析

下機(jī)得到原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過reads數(shù)、Q20、Q30等初步統(tǒng)計(jì)，經(jīng)堿基質(zhì)量分布檢測(cè)后去除接頭，進(jìn)行質(zhì)量過濾，得到clean reads和clean data。這些數(shù)據(jù)使用Tophat2與雞參考基因組進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)比對(duì)到外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)的reads。比對(duì)結(jié)果使用RSeQC進(jìn)行插入片段長度分布、reads重復(fù)率等質(zhì)控分析。

比對(duì)到各基因的reads使用HTSeq統(tǒng)計(jì)，得到各基因的原始表達(dá)量，開產(chǎn)雞和未開產(chǎn)雞的表達(dá)量經(jīng)過RPKM標(biāo)準(zhǔn)化后，再使用DESeq分析其差異性，按照表達(dá)量倍數(shù)差異(fold change)> 2、差異顯著性P<0.05篩選出差異表達(dá)基因。挑選上調(diào)基因和下調(diào)基因各2個(gè)，使用熒光定量PCR(qRT-PCR)進(jìn)行表達(dá)量驗(yàn)證，以ACTB作為內(nèi)參，引物信息見表1。對(duì)差異表達(dá)基因使用超幾何分布進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers for real-time qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋雞肝臟的測(cè)序質(zhì)量

未開產(chǎn)與開產(chǎn)蛋雞的肝臟經(jīng)過RNA-seq測(cè)序，得到轉(zhuǎn)錄組原始序列。表2為測(cè)序數(shù)據(jù)的初步分析，可見，6個(gè)樣品測(cè)得的原始序列經(jīng)質(zhì)量過濾后，純凈序列仍超過80 000 000個(gè)，占原始序列的99%以上，說明低質(zhì)量的序列少，測(cè)序效果較好。開產(chǎn)雞與未開產(chǎn)雞的原始序列和純凈序列數(shù)量均相當(dāng)，說明兩組測(cè)序質(zhì)量相近。

將各樣品的純凈序列與雞參考基因組比對(duì)，由統(tǒng)計(jì)比對(duì)上的序列(表 3)可見，6個(gè)樣品能比對(duì)到基因組的序列均占純凈序列的80%左右，且絕大部分是基因序列，約90%，外顯子序列在基因序列中所占比例也很高，均占80%左右。以上結(jié)果表明6個(gè)樣品測(cè)序結(jié)果均較好，得到的序列基本為有效的基因序列，可進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)初步分析Table 2 Preliminary analysis of RNA-seq data

表3 基因鑒定Table 3 Identification of gene

2.2 肝臟基因差異表達(dá)分析

對(duì)鑒定出的基因進(jìn)行RPKM表達(dá)量分析，并對(duì)開產(chǎn)與未開產(chǎn)樣品的基因表達(dá)量進(jìn)行比較分析，篩選出差異表達(dá)基因(圖1)，共篩選出494個(gè)差異表達(dá)基因(P<0.05)，相比未開產(chǎn)雞，開產(chǎn)雞有285個(gè)基因上調(diào)，209個(gè)基因下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析(圖2)，結(jié)果可見，基因大多匯聚在同一大類，說明它們具有相關(guān)的功能。表達(dá)差異最大的20個(gè)基因(10個(gè)上調(diào)基因，10個(gè)下調(diào)基因)見表4，可以看出，未開產(chǎn)雞有7個(gè)基因未檢出表達(dá)，開產(chǎn)雞有5個(gè)基因未檢出表達(dá)，上調(diào)和下調(diào)差異為10～3 000倍，提示它們可能對(duì)開產(chǎn)性狀具有特殊的重要作用。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes

紅色為高表達(dá)，綠色為低表達(dá) Red means high expression,green means low expression

表4 表達(dá)差異最顯著的20個(gè)基因Table 4 Top 20 differentially expressed genes

挑選部分差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖3)，結(jié)果可見，4個(gè)基因表達(dá)量的qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq結(jié)果基本一致，說明差異表達(dá)基因分析結(jié)果較可靠。

*.P<0.05; **.P<0.01

2.3 肝臟差異表達(dá)基因的功能分析

2.3.1 GO功能富集分析 對(duì)開產(chǎn)雞和未開產(chǎn)雞的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)有60個(gè)顯著富集的GO功能(FDR<0.05)，其中44個(gè)富集在生物過程，11個(gè)富集在細(xì)胞組分、5個(gè)富集在分子功能。圖4顯示富集最顯著的20個(gè)GO功能，除少數(shù)細(xì)胞組分的GO高度富集外，大部分均為脂質(zhì)代謝相關(guān)功能，說明脂質(zhì)代謝對(duì)開產(chǎn)很重要。這些GO功能富集的基因多則53個(gè)，少則5個(gè)。

圖4 差異表達(dá)基因GO富集分析：富集最顯著的20個(gè)GO功能Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed genes: top 20 enriched GO

2.3.2 KEGG信號(hào)通路富集分析 對(duì)開產(chǎn)雞和未開產(chǎn)雞的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)僅有1個(gè)顯著富集的KEGG信號(hào)通路(FDR<0.05)，即非不飽和脂肪酸生物合成(Biosynthesis of unsaturated fatty acids)(表5)。此為脂質(zhì)代謝相關(guān)的信號(hào)通路，包含基因FADS1、FADS2、ACOT7、ACAA1和ELOVL6，說明非不飽和脂肪酸生物合成信號(hào)通路與開產(chǎn)有密切關(guān)系。

表5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Table 5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

3 討論與結(jié)論

高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，現(xiàn)在較常用的RNA-seq數(shù)據(jù)量一般都是千萬級(jí)別的原始序列[22-23]，本研究RNA-seq所得原始序列就在千萬級(jí)別。同時(shí)，各組測(cè)序數(shù)據(jù)能比對(duì)上基因組的序列均在80%左右，而其中比對(duì)上基因的序列均超過80%，結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，后期分析結(jié)果更準(zhǔn)確，更可信。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，證明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果比較可靠。進(jìn)一步分析后，發(fā)現(xiàn)在差異最大的20個(gè)基因中，有7個(gè)(ENPP7、CCKAR、DMC1、GCM2、SYNDIG1L、ENSGALG00000004917、ENSGALG00000036582)和 5個(gè)(GDAP1、ANKEF1、ENSGALG00000039655、ENSGALG00000038668、ENSGALG00000031501)基因分別在低能組和高能組未檢測(cè)出表達(dá)，ENPP7與腫瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[24]，CCKAR與生長和體質(zhì)量相關(guān)[25]，DMC1與減數(shù)分裂相關(guān)[26]，GCM2與維持甲狀旁腺功能相關(guān)[27]，SYNDIG1L與哺乳動(dòng)物乳頭數(shù)相關(guān)[28]，GDAP1與線粒體分裂等相關(guān)[29]，其他基因尚無功能研究報(bào)道。這些基因在肝臟對(duì)能量攝入量的影響中雖然發(fā)揮了重要作用，但是機(jī)理尚不明確，需要進(jìn)行更深入的研究。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的功能在富集程度最高的20個(gè)功能中最多，共有16個(gè)GO，說明脂質(zhì)代謝過程是對(duì)開產(chǎn)影響最大的生物過程。李云雷等[30]對(duì)北京油雞開產(chǎn)前和開產(chǎn)后腹脂與性發(fā)育的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，開產(chǎn)前腹脂質(zhì)量與卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)呈中等正相關(guān)，表明育成期性腺發(fā)育一定程度上受脂肪沉積的影響；開產(chǎn)后腹脂質(zhì)量與卵巢質(zhì)量、卵巢指數(shù)和輸卵管質(zhì)量均呈中等程度負(fù)相關(guān)，且低腹脂率組的開產(chǎn)率高于高腹脂率組，其開產(chǎn)一致性較好，腹脂沉積過量導(dǎo)致北京油雞性成熟和開產(chǎn)延遲。對(duì)盧氏雞青年雞及產(chǎn)蛋雞肝臟轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn)，雞肝臟脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因MTTPL影響蛋雞性成熟[31]。另外，對(duì)白來航雞產(chǎn)蛋前后的肝臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究也發(fā)現(xiàn)RNF186等與脂質(zhì)代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因，提示它們影響蛋雞的產(chǎn)蛋性能[32]，這些研究均表明脂質(zhì)代謝及其相關(guān)基因?qū)Φ半u產(chǎn)蛋有重要影響。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)唯一顯著富集的通路非不飽和脂肪酸生物合成也與脂質(zhì)代謝相關(guān)，通路中差異表達(dá)基因FADS1、FADS2是一類脂肪酸脫氫酶基因，參與多種多不飽和脂肪酸的合成，表達(dá)量與脂肪酸組成顯著相關(guān)[33-34]。ACOT7是脂酰輔酶A硫脂酶7，能將脂酰輔酶A水解成游離脂肪酸，參與調(diào)節(jié)游離脂肪酸含量[35]。ACAA1是乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶1，催化β-氧化途徑的最后一步，參與脂肪酸的延伸和降解[36]。ELOVL6是長連脂肪酸延伸酶6，能催化延長C12-C16的飽和或單不飽和脂肪酸，調(diào)節(jié)脂肪酸組成總體平衡[37]。而李慧鋒等[32]對(duì)高產(chǎn)雞產(chǎn)蛋前后肝臟差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)富集的通路及相關(guān)基因主要與脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝相關(guān)，由此可見，脂質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路確實(shí)影響蛋雞開產(chǎn)。

綜上所述，育成期高能飼喂的蛋雞中，與肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)的一些基因差異表達(dá)會(huì)影響肝脂代謝，最終影響開產(chǎn)時(shí)間。