顧加雨 張 超 史樂樂 夏 炎

(江蘇省計量科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)所，南京 210046)

引言

聚合物微球是通過單體聚合而形成的球形聚合物顆粒，易于制備、調(diào)控及復(fù)合，廣泛應(yīng)用于藥物緩釋遞送等多個領(lǐng)域[1]。微球是粒徑尺寸為1 ～250 μm 的球狀實體[2]，具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、單分散性、多樣性及穩(wěn)定性，將其與磁性納米顆粒結(jié)合，制成兼具磁性納米顆粒和高分子微球特性的復(fù)合型磁性聚合物的研究越來越活躍。磁性聚合物復(fù)合微球具有易加工、成本低、比表面積大、易于吸附、較好的生物相容性及磁響應(yīng)性等優(yōu)點(diǎn)，可作為負(fù)載藥物的優(yōu)良載體，并且可在外加恒磁場的作用下實現(xiàn)分離純化與定向操縱，在外加交變磁場作用實現(xiàn)快速升溫，為構(gòu)建兼具磁感應(yīng)熱療與磁控藥物釋放的多功能載體提供了有效手段。同時，磁性聚合物微球可以方便地進(jìn)行基團(tuán)表面改性(如-NH2、-OH、-COOH、-SH 等)和進(jìn)一步功能化修飾，如連接藥物、熒光分子、特異性抗體等[3]，賦予磁性聚合物微球更廣泛的應(yīng)用前景。目前，聚合物磁性微球已經(jīng)在細(xì)胞分離、藥物負(fù)載、固定化酶、熱療栓塞等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用研究[4]。

近年來，具有優(yōu)良的生物可降解特性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]作為FDA 批準(zhǔn)的可用于人體的藥物載體材料，受到學(xué)術(shù)界越來越多的關(guān)注[5]。PLGA 是由乳酸(lactic acid，LA)和羥基乙酸(glycolic acid，GA)按照一定比例聚合而成，同時具有兩種材料的優(yōu)勢。PLGA 作為一種可降解聚合物，在體內(nèi)可以進(jìn)一步代謝，最終降解生成CO2和H2O，并無毒副作用，因此成為多種藥物的緩釋載體[6]。

磁性納米材料具有優(yōu)異的磁學(xué)性能和獨(dú)特的生物相容性，普遍用于磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、靶向藥物遞送、磁熱療、生物標(biāo)記與分離、生物催化、生物傳感器等生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域[4]。而Fe3O4納米顆粒作為最早被FDA批準(zhǔn)的臨床使用的納米材料，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域有廣泛研究[7]。

本研究采用簡單易于實現(xiàn)的溶劑揮發(fā)法制備包載油溶性Fe3O4納米顆粒的PLGA 磁性微球，同時溶劑揮發(fā)還導(dǎo)致微球具有多孔結(jié)構(gòu)，易于通過簡單吸附而實現(xiàn)CT 造影劑、熒光分子等的復(fù)合，并對微球的形貌結(jié)構(gòu)、藥物吸收與釋放行為以及磁感應(yīng)熱性能進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及儀器

主要試劑包括:聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，50:50，5000，山東省醫(yī)療器械研究所，中國)，吐溫80(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國)，二氯甲烷(DCM，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國)，聚乙烯醇(PVA，31000，Aladdin 公司Aladdin 公司)，F(xiàn)e3O4＠OA(南京東納生物有限公司，中國)，碘海醇(100 mL:30 g，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，中國)，羅丹明B(479.01，Aladdin 公司Aladdin 公司)。實驗所用試劑均為分析純，所用水為超純水。

主要儀器包括:高速剪切乳化器(FA25，德國Fluko 公司)；超聲波儀(RQ45，上海聲儀有限公司，中國)；機(jī)械攪拌器(D2 004 W，上海梅穎浦儀儀器儀表制造有限公司Aladdin 公司)；高速離心機(jī)(Cebtrifuge 5430R，德國Eppendoff 公司)；電子分析天平(XS105DU，瑞士梅特勒托利公司)；光學(xué)顯微鏡(ECLIPSE E200，日本尼康株式會社)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Ultra Plus，德國Zeiss 公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(SP8，德國Leica 公司)；紫外分光光度計(UV-3600日本Shimadzu 公司)；振動樣品磁強(qiáng)計(VSM 7407，美國Lakeshore 公司)；交變磁場(SPG-60-II/III； 深圳雙平磁感應(yīng)儀器有限公司，中國)。

1.2 PLGA-Fe3O4＠OA 微球的制備

PLGA-Fe3O4＠ OA 微球的制備采用溶劑揮發(fā)法。首先，配制1%及0.3%濃度的PVA 水溶液(外水相)；其次，將120 mg PLGA 溶于5 mL 二氯甲烷中，超聲震蕩溶解，待充分混合后加入Fe3O4＠ OA納米顆粒[(Fe3O4＠OA/PLGA)%=5%]，超聲使其充分混合(油相)；將外水相中加入適量的表面活性劑Tween 80，將混合均勻后的油相置于外水相中，室溫下以500 r/min 低速攪拌過夜，揮發(fā)有機(jī)溶劑使微球固化；最后離心洗滌，冷凍干燥備用。

1.2 磁性微球形貌表征

取適量冷凍干燥后的微球分散于蒸餾水中，然后分別滴加到玻璃片、錫箔紙上，室溫干燥后用光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)分析所制備樣品的外貌及形狀。

1.3 磁性微球表面成分的測定

取少量所制備的材料，將其固定在導(dǎo)電膠上，利用掃描電子顯微鏡中的元素分析儀進(jìn)行碘元素測定( mapping)及能量譜( energy dispersive spectrometer，EDS)測定。

1.4 磁性微球吸附碘釋放情況研究

取一定量的磁性微球加入1 mg/mL 的碘溶液中，室溫下?lián)u床震蕩孵育5 h 洗滌、滴樣以備檢測后，將樣品繼續(xù)在搖床上震蕩孵育。分別取再孵育0.5 和1 h 的樣品進(jìn)行Micro-CT、掃描電子顯微鏡中的元素分析儀進(jìn)行碘元素測定。Micro-CT 值計算時，1/25/50/75/100 分別代表選取第1、25、50、75、100 層進(jìn)行平均數(shù)值計算。

1.5 磁性微球孔結(jié)構(gòu)的研究

取少量制備材料于5 mL 去離子水中復(fù)溶，然后取10 mg 的水溶性熒光染料羅丹明B 加入上述溶液，室溫下?lián)u床震蕩4 h。取少量熒光微球于載玻片，激光共聚焦顯微鏡觀察其結(jié)構(gòu)分布。

1.6 磁性微球吸附羅丹明釋放的研究

取一定量的磁性微球加入1 mg/mL 的羅丹明B的PBS 溶液中，室溫下?lián)u床震蕩孵育，并分別于0.5、1、2、4、6、8 h 磁分離，用純水洗滌后用紫外分光光度計測量。

1.7 磁熱效應(yīng)測試

磁性高分子微球的磁熱效應(yīng)實驗是由交變磁場(alternating current magnetic field，ACMF)發(fā)生裝置完成。取適量的磁性高分子微球(Fe 濃度已知)于EP 管中，放置于磁感熱線圈內(nèi)，插入測溫光纖，設(shè)置參數(shù)后開啟交變磁場及測溫裝置，記錄數(shù)據(jù)。比吸收率(specific absorption rate，SAR)表示每單位材料質(zhì)量在單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的熱量多少，常用于衡量磁性材料在交變磁場的升溫效率，表示為[8]

式中，C表示樣品比熱容，dT/dt為起始斜率，ms 為樣品質(zhì)量，mFe 為樣品中Fe 的質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 PLGA 磁性微球形貌分析

光鏡下微球呈圓形，且分布均勻，如圖1所示。由圖可見，所制備的微球呈球形較圓整，但表面較粗糙，有助于藥物的吸附，往往會引起藥物的高突釋[9]。粒徑為10～15 μm，微球粒徑較小，導(dǎo)致藥物向外流失面積越大，流失越多，包封率下降[10]。

圖1 磁性PLGA 微球的光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡圖像Fig.1 The optical microscope and scanning electron microscope( SEM )imageofmagnetic PLGA microspheres

2.2 PLGA 磁性微球表面成分測定

圖2為磁性微球的SEM 圖像、元素mapping 圖及微球EDS 元素分析圖。如圖2(a)所示，在磁性微球中含有多種元素存在，包括C 元素、O 元素及Fe 元素(圖中虛線框所示)；圖2(b)進(jìn)一步證實了微球中含有一定量的Fe 元素，F(xiàn)e 元素所占原子百分比為0.62 %，證明已成功合成含有Fe3O4＠ OA的磁性聚合物微球。

圖2 磁性 PLGA 微球表征。(a)SEM mapping；(b)EDS 分析Fig.2 Magnetic PLGA microspheres. (a)SEM mapping； (b)EDS analysis

2.3 PLGA 磁性微球碘吸附實驗

2.3.1 不同孵育時間碘的釋放

室溫下與碘海醇溶液震蕩孵育，于不同時間取樣所做mapping 如圖3所示。由圖可見，隨著孵育時間延長，碘元素發(fā)生變化。當(dāng)磁性微球與碘海醇溶液共孵育5 h 后，碘吸附量最多，圖片亮度最大，且此時的碘元素大部分都集中在微球表面，吸附量較多，如圖3(a)所示。而由圖3(b)和(c)中可以明顯看出亮度變暗，碘元素開始向周圍擴(kuò)散。在2 h的時候，磁性微球中碘元素亮度最低。上述結(jié)果說明CT 造影劑碘海醇能夠有效吸附到PLGA 磁性微球內(nèi)部，并且隨著時間增加逐漸釋放，在2 h 之內(nèi)仍然含有較多的碘海醇。

圖3 碘海醇不同孵育時間的SEM 元素映射圖像。(a)0 h；(b)0.5 h；(c)2 hFig.3 The SEM element mapping images of iohexol for different incubation times. (a)0 h； (b)0.5 h；(c)2 h

2.3.2 不同孵育時間Micro-CT 定量結(jié)果分析

將PLGA 磁性微球與碘海醇溶液孵育，待成功吸附碘海醇后用純水洗滌后保存在水溶液中，分別在0、0.5、1 h 時取樣，進(jìn)行Micro-CT 測試。表1中數(shù)據(jù)是未吸附碘海醇的磁性微球以及吸附后不同釋放時間點(diǎn)的樣品的CT 值，按掃描斷層編號選取圖片計算平均值而得，CT 值越大，說明材料吸收越強(qiáng)。從表中可以看出，對于不同的掃描斷層，變化趨勢是一致的，未吸附碘海醇的樣品CT 值明顯小于吸附后的樣品。隨著釋放時間增加，CT 值減小，在1 h 時CT 值仍維持較高水平。

表1 含碘海醇的磁性PLGA 微球在不同釋放時間的平均顯微CT 值Tab.1 Average micro-CT values of magnetic PLGA microspheres with iohexol at different release time

2.4 PLGA 磁性微球羅丹明B 吸附實驗

2.4.1 PLGA 磁性微球孔結(jié)構(gòu)研究

為了證明上述實驗中的碘海醇是通過PLGA 磁性微球的多孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行負(fù)載的，將熒光染料羅丹明B與PLGA 磁性微球進(jìn)行孵育，如果存在孔結(jié)構(gòu)，羅丹明B 則能夠分散在孔道中，利用激光共聚焦顯微鏡可觀察出其分布情況，結(jié)果見圖4，所示為磁性微球不同截面的共聚焦成像。圖中紅色發(fā)光物質(zhì)為羅丹明B，羅丹明B 越多，則圖片越亮?？梢娙軇]發(fā)法制備的PLGA 磁性微球內(nèi)部分布著大小不均一的孔洞，而且聯(lián)通性較高，羅丹明B 通過孔洞進(jìn)入微球，較多吸附在微球孔壁上。微球不同掃描層面上紅色熒光分布不均一，說明微球內(nèi)部孔道分布不均勻。微球在有機(jī)溶劑揮發(fā)固化的過程中，高分子首先在球心凝聚形成1 個核，而后逐漸向外揮發(fā)聚集，此時隨著有機(jī)溶劑的揮發(fā)帶走了部分有機(jī)物，孔道由內(nèi)而外形成。

圖4 含有羅丹明B(紅色)的磁性PLGA 微球在不同掃描層面上的激光共聚焦圖像Fig.4 The laser confocal images of magnetic PLGA microspheres containing rhodamine B ( red)at different scanning levels

2.4.2 PLGA 磁性微球吸附羅丹明B 釋放研究

圖5為不同時間用純水洗滌后的羅丹明B 釋放情況。結(jié)果顯示，羅丹明B 在初始時釋放迅速，4 h后釋放速度開始減緩，在8 h 時釋放達(dá)到飽和，表明可以將磁性微球在使用前與藥物分子簡單混合，吸附后用于介入給藥，從而可實現(xiàn)不同藥物的負(fù)載和釋放。

圖5 羅丹明B 在不同時間的累積釋放Fig.5 Accumulated release of rhodamine B at different times

2.5 PLGA 磁性微球磁學(xué)性能研究

磁性納米材料的磁特性一般受尺寸、形貌等多種因素影響。圖6(a)顯示的磁滯回線為采用振動樣品磁強(qiáng)計(vibrating sample magnetometer，VSM)的測試結(jié)果，說明納米顆粒具有良好的磁學(xué)性能，矯頑力和剩磁幾乎為零，說明具有超順磁性，其飽和磁化強(qiáng)度為33.9 emu/g Fe。飽和磁化強(qiáng)度對材料在交變磁場下的熱升溫能力有重要影響，因此，用光纖測溫器測量了600 s 內(nèi)的升溫情況。其發(fā)熱性能在加交變磁場作用下隨時間的變化如圖6(b)所示。在外加交變磁場作用下600 s 后，最高溫度可達(dá)55.6℃。目前研究表明，腫瘤細(xì)胞對熱比較敏感，當(dāng)溫度達(dá)到或高于42℃時可以更有效地殺死腫瘤細(xì)胞以達(dá)到治療的效果[11]。采用SAR 值來衡量納米顆粒在交變磁場誘導(dǎo)下的熱效率，計算得SAR 值為47.42 W/g Fe。

圖6 PLGA 磁性微球在交變磁場下的性能測試。(a)水相中的磁滯回線；(b)時間－溫度曲線Fig. 6 Performance test of PLGA magnetic microspheres under alternating magnetic field. (a)Hysteresis loop in aqueous phase； (b)Timetemperature curves

3 討論和結(jié)論

本研究的實驗結(jié)果顯示，PLGA 包裹后并不改變其超順磁性。利用激光共聚焦觀察磁性微球孔洞結(jié)構(gòu)，為后續(xù)載藥提供了理論依據(jù)。此外，通過研究碘及羅丹明B 的吸附釋放行為，表明PLGA 磁性微球可以用來持續(xù)時間的CT 造影，并且具有明顯的緩釋功能。上述結(jié)果皆說明PLGA 高分子復(fù)合磁性微球是一種常用的藥物攜帶載體?？赡苡绊戓尫判袨榈闹饕蛴?1)制備PLGA 微球時有部分藥物在微球表面，易形成突釋；2)PLGA 質(zhì)量以及微球制備時儀器選擇等均能影響吸附釋放行為[12]。PLGA 磁性微球具有良好的超順磁特性與磁感應(yīng)熱療能力，為未來構(gòu)建兼具磁感應(yīng)熱療與磁熱藥物控釋的多功能載體奠定了基礎(chǔ)。

本研究采用簡單的溶劑揮發(fā)法制備了包裹Fe3O4＠OA 的PLGA 磁性微球，其直徑約10～15 μm，溶劑揮發(fā)導(dǎo)致微球具有多孔結(jié)構(gòu)。以CT 造影劑碘海醇和熒光分子羅丹明B 作為模型分子進(jìn)行吸附和釋放研究，結(jié)果表明這些分子可以被有效負(fù)載到微球的多孔結(jié)構(gòu)之中，并且具有一定的藥物緩釋特性。CT 造影劑和熒光分子負(fù)載同時為發(fā)展多模態(tài)影像學(xué)指導(dǎo)藥物遞送提供了可視化手段。

(致謝:感謝東南大學(xué)張宇教授的指導(dǎo)；感謝南京東納生物科技有限公司提供的技術(shù)支持)