黎江溪 張世梅 王玉鑫 趙 躍

(大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000)

引言

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一種常見且復(fù)雜的遺傳性心臟疾病，常引發(fā)青少年及年輕運(yùn)動(dòng)員的心源性猝死[1]。正常心肌細(xì)胞規(guī)則地組裝成平行排列的肌纖維，但HCM患者的肌纖維短寬肥厚，彌漫性肥大，排列紊亂，會(huì)引起舒張期功能障礙。眾多證據(jù)表明，突變的心臟肌節(jié)蛋白能增加肌絲對(duì)Ca2+的誘捕，導(dǎo)致Ca2+循環(huán)紊亂[2]，其結(jié)果是產(chǎn)生代償性的心肌細(xì)胞肥大。

肌鈣蛋白位于肌動(dòng)蛋白絲上，是橫紋肌收縮的中央調(diào)節(jié)蛋白，包括肌鈣蛋白T2、肌鈣蛋白I3 及肌鈣蛋白C1(cardiac troponin C1，TNNC1)3 個(gè)亞基[3]。TNNC1 作為編碼與Ca2+誘捕敏感蛋白的最重要基因之一，代表了心臟肌小節(jié)的Ca2+敏感元件。因此，TNNC1 基因結(jié)構(gòu)和功能是否正常，決定著粗細(xì)肌絲能否正?；衃4]。有關(guān)TNNC1 基因突變與HCM 發(fā)病的分子遺傳學(xué)研究較少，在dbSNP 數(shù)據(jù)庫中僅發(fā)現(xiàn)A8V、A31S、E134D、C84Y 和D145E 與HCM 發(fā)病相關(guān)[5-6]，該基因尚存在的其他非同義單核苷酸多態(tài)性(non-synonymous single nucleotide polymorphisms，nsSNPs)與HCM 疾病表型的關(guān)系還有待挖掘。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法，對(duì)dbSNP 數(shù)據(jù)庫中TNNC1 基因的1 559 個(gè)SNPs 位點(diǎn)進(jìn)行整合分析，篩選出18 個(gè)與疾病關(guān)聯(lián)的有害nsSNPs。該研究以TNNC1 基因?yàn)槭痉?，分析了其nsSNPs 與疾病表型的關(guān)系，這對(duì)HCM 的基因突變篩查、輔助臨床診斷及有效藥物的研發(fā)，有著十分重要的理論指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 基因數(shù)據(jù)收集和篩選

TNNC1 的基因序列(NG＿008963.1)、蛋白質(zhì)序列(NP＿003271.1)及SNP 位點(diǎn)等信息，均來自于美國國立生物信息中心dbSNP 數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)。在分級(jí)篩選過程中，把TNNC1基因5′和3′UTR、內(nèi)含子及同義突變的SNP 去除，即可得到nsSNPs。

1.2 基因突變位點(diǎn)有害性分析

基于Mutation Taster 和PolyPhen-2 在線軟件，對(duì)初步篩選獲得的nsSNPs 進(jìn)行有害性分析。Mutation Taster 軟件整合了較為權(quán)威的外顯子組和千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫，主要是根據(jù)氨基酸替代矩陣，兼顧氨基酸的物理化學(xué)特征以及氨基酸的差異程度，利用貝葉斯分類算法來預(yù)測突變?cè)斐傻臐撛诩膊7]。結(jié)果可定性描述為 disease causing (致病的)和Polymorphism(多態(tài)性)。預(yù)測評(píng)分可在0.00～215，評(píng)分越高，代表可信程度越高，當(dāng)評(píng)分＞90，認(rèn)為是可信的。PolyPhen-2 軟件則是根據(jù)突變氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和功能等方面，對(duì)被替換的氨基酸進(jìn)行分析[8]，預(yù)測得分范圍在0.00～1.00。當(dāng)評(píng)分為0.00～0.49，預(yù)測為良性(benign)；0.50 ～0.89 分，預(yù)測為可能損傷(possible damaging)，0.90～1.00 分，預(yù)測為很可能損傷(probably damaging)。

在Mutation Taster 及PolyPhen-2 軟件有害性分析的基礎(chǔ)上，運(yùn)用PhD-SNP 及MutPred 軟件，對(duì)nsSNPs 與疾病相關(guān)性做更深入的分析。PhD-SNP軟件基于SVM 算法，主要對(duì)目標(biāo)nsSNPs 中對(duì)應(yīng)的氨基酸突變位置及突變前后的數(shù)據(jù)集進(jìn)行疾病關(guān)聯(lián)分析，當(dāng)評(píng)分≥0.4 時(shí)認(rèn)為可信度較高，預(yù)測結(jié)果判定為中性(neutral)或疾病(disease)[9]。MutPred是基于機(jī)器學(xué)習(xí)的軟件，通過可能影響表型的特定分子變化排序列表來集成分子數(shù)據(jù)，最后確定氨基酸取代后可能的致病性。結(jié)果可描述為假設(shè)非?？尚?、假設(shè)可信和假設(shè)可操作[10]。

1.3 蛋白三維模型構(gòu)建及分析

基于Swiss Model 數(shù)據(jù)庫(https:/ /swissmodel.expasy.org/interactive/)，對(duì)前期篩選到的與疾病關(guān)聯(lián)的nsSNPs 進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建。最后利用VMD 軟件[11]，對(duì)突變前后蛋白結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 基因突變數(shù)據(jù)收集和篩選

從dbSNP 數(shù)據(jù)庫中獲得TNNC1 基因SNP ID共1 559 個(gè)，經(jīng)過人工分級(jí)篩選后得到102 個(gè)nsSNPs，篩選及預(yù)測流程如圖1所示。

圖1 TNNC1 基因nsSNPs 篩選及預(yù)測流程Fig.1 Screening and prediction process of TNNC1 gene nsSNPs

2.2 突變位點(diǎn)有害性分析

利用Mutation Taster 及PolyPhen-2 有害性分析軟件，對(duì)在dbSNP 平臺(tái)上所篩選到的102 個(gè)nsSNPs進(jìn)行有害性分析。在Mutation Taster 軟件的預(yù)測結(jié)果中，3 個(gè)(I119V、I119T 和I119M)nsSNPs 被預(yù)測為多態(tài)性，2 個(gè)(I112M、E116D)nsSNPs 為未知意義，剩余97 個(gè)為疾病相關(guān)。而在PolyPhen-2 軟件的預(yù)測結(jié)果中，35 個(gè)nsSNPs 被預(yù)測為良性，其余67個(gè)均被預(yù)測為可能有害的。為了提高篩選的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)被Mutation Taster 和PolyPhen-2 同時(shí)預(yù)測為有害的nsSNPs 為64 個(gè)。通過參考國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在64 個(gè)有害的nsSNPs 中，A8V、A31S、E134D、C84Y 和D145E 在文獻(xiàn)中被報(bào)道為有害[5-6]，與HCM 的發(fā)病是相關(guān)的，表明預(yù)測結(jié)果有較高的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白保守序列對(duì)應(yīng)其重要的功能區(qū)域[12]。圖2為Mutation Taster 及PolyPhen-2 軟件對(duì)突變位點(diǎn)有害性及保守性分析，僅以rs897557713和rs1578263838 位點(diǎn)為代表進(jìn)行展示。從圖2(a)可以看出，rs897557713 位點(diǎn)預(yù)測為很可能有害的。從線蟲(celegans)、果蠅(dmelanogaster)、斑馬魚(drerio )、 非洲爪蟾 ( xtropicalis )、 小家鼠(mmusculus)、 原雞( ggallus)、 紅鰭東方鲀(trubripes)、貓(fcatus)、黑猩猩(ptroglodytes)和人類(human)等低等到高等物種間的氨基酸序列保守性分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)均為L(亮氨酸)較為保守，對(duì)維持該蛋白的功能十分重要，不可隨意改變，如圖2(c)所示。而rs1578263838 位點(diǎn)被預(yù)測為良性，從物種間的保守性分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)從低等到高等物種間的對(duì)應(yīng)氨基酸不保守可變，在不同物種間可為不同的氨基酸，如果蠅和紅鰭東方鲀的該基因位點(diǎn)上可為A(丙氨酸)，線蟲上可為F(苯丙氨酸)。值得注意的是，在小家鼠和非洲爪蟾上可為M(甲硫氨酸)，與突變體一致，因此該位點(diǎn)可變。當(dāng)由I(異亮氨酸)變?yōu)镸(甲硫氨酸)后，也能保持蛋白結(jié)構(gòu)和功能的完整性，不影響其生理生化功能。因此，結(jié)果表現(xiàn)為良性，如圖2(b)和(d)所示。

圖2 TNNC1 基因非同義突變位點(diǎn)的有害性(上)及物種間氨基酸保守性(下)分析。(a)rs897557713 位點(diǎn)；(b)rs1578263838 位點(diǎn)Fig.2 Damaging (the top)and amino acid conservation analysis of species (the bottom)were analyzed that non-synonymous mutations in TNNC1 gene. (a)rs897557713； (b)rs1578263838

2.3 突變位點(diǎn)疾病相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步分析前期篩選的nsSNPs 與疾病的相關(guān)性，運(yùn)用疾病關(guān)聯(lián)分析軟件PhD-SNP 和Mutpred，對(duì)前期Mutation Taster 預(yù)測分值＞90(可信的)且PolyPhen-2 預(yù)測分值＞0.9(很可能損傷的)的18 個(gè)(G159D、S69R、P52R、D149G、D3V、G140E、N51K、D151V、M47R、G110C、A23D、G140R、K158 N、C35Y、R147C、L48P、F74C 和V44G)nsSNPs 進(jìn)行下一步的分析。在分析結(jié)果中，18 個(gè)nsSNPs 均被PhD-SNP 軟件預(yù)測為疾病相關(guān)。同時(shí)，MutPred 軟件對(duì)18 個(gè)nsSNPs 預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行顯示:這些突變位點(diǎn)改變了蛋白的理化特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域，其結(jié)果被認(rèn)為是可信或非?？尚诺模绫?所示。此外，對(duì)以上蛋白突變位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域定位發(fā)現(xiàn)，除D3V、K158 N 和G159D 外，剩余15 個(gè)突變位點(diǎn)均位于蛋白質(zhì)PTZ00184 結(jié)構(gòu)域。在疾病相關(guān)性預(yù)測的結(jié)果中，其分?jǐn)?shù)與蛋白功能的重要程度呈正相關(guān)。在研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，PhD-SNP 軟件預(yù)測為疾病且可能性≥0.40 及Mutpred 軟件預(yù)測為非?？尚诺奈稽c(diǎn)有6 個(gè)(G140E、D151V、G110C、K158N、G140R和L48P)，這些位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果與疾病發(fā)生的關(guān)聯(lián)性和可信度是比較高的。如表1所示，G140E 突變導(dǎo)致氨基酸溶劑的可及性喪失，D151V 突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)卷曲結(jié)構(gòu)功能喪失、G110C 突變改變了無序蛋白質(zhì)界面，K158N 突變改變蛋白卷曲結(jié)構(gòu)，G140R突變改變氨基酸結(jié)合位點(diǎn)，L48P 突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)折疊紊亂。以上結(jié)果可以看出，不同的突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)的損傷是不一樣的，有涉及蛋白結(jié)構(gòu)改變，也有結(jié)合位點(diǎn)功能喪失，或改變氨基酸的溶劑可及性。

表1 nsSNPs 有害性及疾病關(guān)聯(lián)性分析Tab.1 Disease associations and harmfulness were analyzed of nsSNPs

2.4 致病相關(guān)突變位點(diǎn)結(jié)果分析及驗(yàn)證

為了進(jìn)一步可視化分析與疾病相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn)，基于Swiss Model 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白三維模型構(gòu)建。在模型構(gòu)建過程中，選擇序列相似性＞99%和重合度＞80%且評(píng)分最高的模板(RCSB PDB NO. 1AJ4)，保證了建模的可信度。模型構(gòu)建完成后，利用VMD 軟件進(jìn)行可視化分析。在此僅展示代表性nsSNPs，圖3(a)表示突變前G(甘氨酸)為非極性脂肪族氨基酸，具有很強(qiáng)的親水性，溶于極性溶劑，多埋藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部。圖3(b)表示突變后為E(谷氨酸)，E 為不帶電荷的極性兼酸性氨基酸。氨基酸的極性與非極性、疏水性與親水性等性質(zhì)，能影響氨基酸側(cè)鏈R 基團(tuán)的功能。

因此，G140E 突變位點(diǎn)對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響無明顯變化，但能影響蛋白質(zhì)氨基酸的溶劑可及性；圖3(c)和(d)為L48P 突變，L(亮氨酸)和P(脯氨酸)均為非極性氨基酸，但P 多藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部。從圖中可以看出，突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)內(nèi)部折疊發(fā)生紊亂，三維建模與Mutpred 軟件預(yù)測結(jié)果一致。

圖3 TNNC1 基因疾病關(guān)聯(lián)nsSNPs 位點(diǎn)野生型和突變型結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(突變位點(diǎn)用黃色框標(biāo)注，并進(jìn)行放大)。(a)和(b)分別代表第140 位野生型G (甘氨酸)和突變型E (谷氨酸)；(c)和(d)分別代表第48 位野生型L (亮氨酸)和突變型P(脯氨酸)Fig.3 The structure modeling of predicted pathogenic nsSNPs with wild-type and mutated in TNNC1 gene(Mutated site are emphasized by a yellow box and are locally zoomed). (a)and (b)indicates the position of 140 wild-type G ( glycine )and mutation E(glutamicacid)，respectively； (c)and (d)indicates the position of 48 wild-type L (leucine)and mutation P (proline)，respectively

3 討論

人類遺傳學(xué)領(lǐng)域的巨大挑戰(zhàn)之一，是明確SNPs與疾病之間的關(guān)系。在基因組中發(fā)現(xiàn)了超過1 000萬個(gè)SNPs，并且發(fā)現(xiàn)數(shù)量還在持續(xù)增加。因此，區(qū)分這些SNPs 對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響，篩選出與疾病發(fā)生有關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)，是實(shí)施精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和分子診斷的關(guān)鍵[13]。但結(jié)合臨床樣本，在實(shí)驗(yàn)室對(duì)大規(guī)模的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行功能分析，工作量巨大，且價(jià)格昂貴。因此，可以使用計(jì)算機(jī)分析工具，結(jié)合生物信息學(xué)手段，對(duì)可能有害的nsSNPs 進(jìn)行優(yōu)先級(jí)排序，找出可能與遺傳疾病發(fā)生相關(guān)的nsSNPs 位點(diǎn)，縮小研究范圍，降低研究成本，這是一種理想的研究策略[8]。

肥厚型心肌病是最常見的遺傳性心臟病，大部分發(fā)患者群常與肌節(jié)蛋白變異有關(guān)。TNNC1 作為編碼與Ca2+誘捕敏感蛋白的最重要基因之一，當(dāng)相關(guān)位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，導(dǎo)致Ca2+循環(huán)紊亂，產(chǎn)生代償性的心肌細(xì)胞肥大，從而引發(fā)HCM[2]。生物信息學(xué)工具本身基于不同的數(shù)據(jù)庫和算法，靈敏度和準(zhǔn)確性有差異。在本研究的初級(jí)篩選過程中，使用到Mutation Taster 和PolyPhen-2 軟件聯(lián)合分級(jí)篩選，保證了致病相關(guān)位點(diǎn)預(yù)測的準(zhǔn)確性。Schwarz 等[14]的研究顯示，MutationTaster 軟件集成了來自不同生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫的信息，并使用了已建立的分析工具，分析了包括物種進(jìn)化保守性和蛋白質(zhì)特征喪失等，能較好地預(yù)測出潛在的有害變異位點(diǎn)。PolyPhen-2軟件集成了UCSC Genome Browser 的人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫，能預(yù)測氨基酸改變后對(duì)人類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能的可能存在影響[9]。在初級(jí)篩選的過程中發(fā)現(xiàn)的64 個(gè)有害性nsSNPs 中，包括了5 個(gè)已報(bào)道的nsSNP 位點(diǎn)(A8V、A31S、E134D、C84Y 和D145E)。Parvatiyar 等[6]在HCM 患者中發(fā)現(xiàn)了TNNC1 基因的A31S 突變，該突變?cè)黾恿薈a2+的敏感性，促使心律失常，導(dǎo)致HCM 的發(fā)生。此外，Venter 等[15]用MutPred 軟件，成功預(yù)測了線粒體DNA 與復(fù)雜心血管疾病之間的關(guān)系。為了進(jìn)一步提高預(yù)測可靠性，在預(yù)測分析突變位點(diǎn)與疾病的相關(guān)性時(shí)，還聯(lián)合運(yùn)用了PhD-SNP 和Mutpred 預(yù)測分析軟件，首次篩選出18 個(gè)致病相關(guān)的nsSNPs，這些位點(diǎn)從蛋白的理化特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域等方面影響了蛋白質(zhì)的功能。需要指出的是，各nsSNPs 具體的生物學(xué)功能及可能的疾病機(jī)制，還有待進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)深入研究。

4 結(jié)論

本研究基于多種生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫及平臺(tái)，以TNNC1 基因?yàn)槭痉?，利用生物信息學(xué)方法，成功挖掘出TNNC1 基因中18 個(gè)與疾病相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)nsSNPs，為進(jìn)一步研究TNNC1 基因突變與HCM 的疾病表型關(guān)系打下理論研究基礎(chǔ)。同時(shí)，該方法也對(duì)其他遺傳疾病致病基因nsSNPs 與疾病關(guān)聯(lián)突變篩查具有重要的參考價(jià)值。