張國玉

內(nèi)黃縣中醫(yī)院，河南 內(nèi)黃 456300

Graves眼病(graves ophthalmopathy，GO)又稱浸潤性突眼、甲狀腺相關(guān)性眼病，是格雷夫斯病(graves disease，GD)的甲狀腺外并發(fā)癥，占GD的25%～50%[1]。GO患者以眼內(nèi)異物感、脹痛、畏光、流淚、復(fù)視、視力減退為主要癥狀，嚴(yán)重者因眼瞼閉合不全、角膜外露而形成角膜潰瘍、全眼炎，甚至失明，不僅影響患者的生活質(zhì)量，還對外貌及心理狀況產(chǎn)生巨大影響[2]。糖皮質(zhì)激素是治療Graves眼病的主要方法，尤其是對活動性中重度患者。雷公藤素有“中草藥激素”之稱，一項(xiàng)薈萃分析表明，雷公藤有效提取物雷公藤多苷治療該病療效顯著，且不良反應(yīng)較少[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了醫(yī)學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科，實(shí)現(xiàn)從藥物成分到疾病靶點(diǎn)、基因、途徑的綜合網(wǎng)絡(luò)分析，闡述藥物對疾病的作用機(jī)制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析雷公藤治療Graves眼病的作用機(jī)制，希冀為雷公藤制劑治療Graves眼病的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究提供方向和理論。

1 材料與方法

1.1 雷公藤相關(guān)靶點(diǎn)篩選通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺[4]尋找雷公藤化學(xué)組成成分，根據(jù)口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%[5]、類藥性(drug-likeness，DL)≥ 0.18[6]的2個(gè)藥代動力學(xué)屬性值進(jìn)行活性成分初步篩選，以獲得活性化合物及活性成分的預(yù)測蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)將活性成分預(yù)測的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 Graves眼病相關(guān)靶點(diǎn)篩選以“Graves Ophthalmopathy”為疾病名，挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org)中與Graves眼病相關(guān)的基因。在Genecards數(shù)據(jù)庫中，Score值越高，表示該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，多設(shè)定Score大于中位數(shù)的靶點(diǎn)為潛在靶點(diǎn)[7]。在OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.omim.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https：//www.disgenet.org/home/)中以“Graves Ophthalmopathy”為疾病名獲得疾病靶點(diǎn)予以補(bǔ)充。剔除重復(fù)值后，獲得Graves眼病靶點(diǎn)基因。

1.3 靶蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為明確雷公藤相關(guān)靶點(diǎn)與Graves眼病靶蛋白之間的相互作用，利用Venn在線作圖(http：//www.bioinformatics.com.cn/)篩選出二者交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。進(jìn)而將交集靶點(diǎn)在STRING平臺(https：//string-db.org/)構(gòu)建靶蛋白互相作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)模型[8]，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”進(jìn)行操作，最低相互作用閾值設(shè)為“medium confidence=0.4”，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。并通過 CytoScape3.7.2軟件的分析功能進(jìn)行研究[9]。

1.4 基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析為了說明雷公藤活性成分的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用及在信號通路中的作用，本研究采用David 6.8數(shù)據(jù)庫[10-11](https：//david.ncifcrf.gov/)對韋恩圖中的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.5 雷公藤成分-Graves眼病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建運(yùn)用 CytoScape 3.7.2構(gòu)建雷公藤成分-Graves眼病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用CytoScape 3.7.2軟件的“Network Analysis”功能分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closenesss)等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.6 分子對接驗(yàn)證分析雷公藤的主要活性成分和主要靶點(diǎn)，對其進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。查找或者化學(xué)繪圖制作活性成分的mol2文件，查找靶蛋白PDB ID。應(yīng)用SYBYL-X2.0分子對接軟件將靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行對接，根據(jù)Total Score評價(jià)靶點(diǎn)與活性化合物的結(jié)合度。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤活性成分靶點(diǎn)的獲取通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，共檢索到活性成分144個(gè)，根據(jù)藥代動力學(xué)屬性值OB、DL篩選到活性成分51個(gè)，刪除無疾病預(yù)測靶點(diǎn)活性成分23個(gè)，共獲得活性成分28個(gè)，具體見表1。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共獲得靶點(diǎn)143個(gè)。

表1 雷公藤主要成分

2.2 Graves眼病靶點(diǎn)的獲取從Genecards數(shù)據(jù)庫獲得Graves眼病靶點(diǎn)294個(gè)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為其潛在靶點(diǎn)，如通過GeneCards所得Graves眼病靶點(diǎn)Score最大值為55.59，最小值為0.26，中位數(shù)為2.79，故設(shè)定 Score>2.79的靶點(diǎn)為Graves眼病的潛在靶點(diǎn)。結(jié)合OMIM、DisGeNET、TTD數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，合并后刪除重復(fù)值，最終得到150個(gè)Graves眼病靶點(diǎn)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果將篩選的雷公藤活性成分靶點(diǎn)與Graves 靶點(diǎn)成分利用Venn在線作圖繪制韋恩圖，具體見圖1，并得到交集靶點(diǎn)19個(gè)。將19個(gè)交集靶點(diǎn)在STRING平臺，構(gòu)建靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)出TSV文件，導(dǎo)入CytoScape 3.7.2軟件，進(jìn)行無向、無自身網(wǎng)絡(luò)分析：該網(wǎng)絡(luò)共有18個(gè)節(jié)點(diǎn)(1個(gè)未參與)，107條邊，網(wǎng)絡(luò)平均鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為11.889。利用該19個(gè)交集靶點(diǎn)逆向反推雷公藤活性成分，制作xls格式文件，導(dǎo)入CytoScape 3.7.2軟件，得到雷公藤活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖2。根據(jù)度值和介數(shù)指標(biāo)，篩選出關(guān)鍵靶蛋白(PTGS2、ADRB2、NR3C1、PPARG、BCL2)，提示這些蛋白在雷公藤藥理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中PTGS2在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為23，介度為0.301 5，緊密度為0.671 9，預(yù)測PTGS2為雷公藤治療Graves眼病的最主要靶點(diǎn)。

圖1 雷公藤成分-Graves眼病靶點(diǎn)韋恩圖

注：紫色菱形代表雷公藤，粉紅色矩形為雷公藤的活性成分，淺藍(lán)色六邊形為蛋白靶點(diǎn)，深藍(lán)色為Graves眼??；節(jié)點(diǎn)的面積代表其度數(shù)大小

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析應(yīng)用David 6.8數(shù)據(jù)庫對韋恩圖中交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能分析：根據(jù)錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05，共得到分子功能條目2個(gè)，為細(xì)胞因子活性、生長因子活性；細(xì)胞組分條目3個(gè)，為質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞表面；生物過程條目50個(gè)，包含炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、白細(xì)胞黏附、氧化氮生物合成過程正調(diào)控、MAP激酶活性正調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化正調(diào)節(jié)等。KEGG通路富集分析共富集出39條通路與雷公藤改善Graves眼病的功效相關(guān)，根據(jù) FDR<0.05共得到30條通路，主要包括核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路、細(xì)胞黏附分子、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、TGF-β信號通路等，具體可見圖5。Kappa值表示兩個(gè)相關(guān)對象吻合率，在David 6.8數(shù)據(jù)庫中Kappa分0.75～1.00表示相關(guān)性非常高，0.50～0.75表示相關(guān)性高，0.25～0.50表示相關(guān)性中等，小于0.25表示相關(guān)性低，予以舍去。以分子功能細(xì)胞因子活性、生長因子活性、細(xì)胞組成質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞表面與其他GO富集數(shù)據(jù)、KEGG富集數(shù)據(jù)kappa值為依據(jù)，舍去相關(guān)性低的數(shù)據(jù)，取5者交集數(shù)據(jù)，并滿足 FDR<0.05，GO富集分析見圖3，KEGG分析見圖4。

圖3 雷公藤改善Graves眼病的GO富集分析條形圖

圖4 雷公藤改善Graves眼病的KEGG分析氣泡圖

2.5 雷公藤成分-Graves眼病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建運(yùn)用CytoScape 3.7.2構(gòu)建雷公藤成分-Graves眼病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖5。通過 CytoScape 3.7.2分析，得到核心成分和靶點(diǎn)。CytoScape網(wǎng)絡(luò)分析表明，雷公藤甲素連接度(degree)為12，介度(betweenness centrality)為0.1669，緊密度(closeness centrality)為0.5317，預(yù)測雷公藤甲素為雷公藤治療Graves眼病的主要成分，其次為山柰酚、川陳皮素、β-谷甾醇、3-(5，8-二羥基-2-氧代苯并吡喃-7-基)-2-羥基-5-甲基苯并吡喃-4-酮、異落葉松脂素，具體見表2。PTGS2、TNF在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為26，預(yù)測其為雷公藤改善Graves眼病的最主要靶點(diǎn)。IFNG、TGF-β1、CD40、CD86等亦為相對重要的靶點(diǎn)，具體見表3。

表2 雷公藤主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表3 靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

注：粉紅色矩形為雷公藤的活性成分，淺藍(lán)色六邊形為蛋白靶點(diǎn)，綠色三角形為通路；節(jié)點(diǎn)的面積代表其度數(shù)大小

2.6 分子對接SYBYL性能穩(wěn)定、專業(yè)度高，為分子模擬和藥物設(shè)計(jì)的首選工具。SYBYL使用原型分子表示結(jié)合口袋，小分子配體探測蛋白口袋的疏水、氫鍵、靜電，形成蛋白質(zhì)活性口袋的負(fù)像，通過氫鍵受體和供體、疏水位置匹配進(jìn)行打分，分值越大，表示結(jié)合作用越好，一般認(rèn)為，評分≥4分表示存在結(jié)合作用，≥6分有較好活性[12]。雷公藤的主要活性成分為雷公藤甲素、山柰酚、川陳皮素和β-谷甾醇，主要靶點(diǎn)為PTGS2、TNF、IFNG、TGF-β1、CD40、PPARG、ICAM1，對其活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。結(jié)果顯示，評分≥4分者占總數(shù)92.9%，≥6分者占32.1%，即大部分靶點(diǎn)與成分存在結(jié)合活性，分子對接結(jié)果見圖6。

圖6 分子對接結(jié)果

3 討論

中藥材雷公藤為衛(wèi)矛科植物雷公藤的根、葉及花，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛、殺蟲、消炎、解毒的功效。臨床上多種雷公藤制劑，如雷公藤片、雷公藤總萜片、雷公藤雙層片、雷公藤多苷片，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征等自身免疫性疾病中應(yīng)用廣泛。雷公藤成分-靶點(diǎn)-Graves眼病網(wǎng)絡(luò)顯示了引起Graves眼病的靶點(diǎn)眾多，靶點(diǎn)之間關(guān)系復(fù)雜。因此，針對中藥多成分、多靶點(diǎn)和復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制特點(diǎn)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析有利于從分子水平闡明其作用機(jī)制。Graves眼病是免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相互作用，形成交叉的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗TSHR、IGF-1R自身抗體使成纖維細(xì)胞活化并分泌各種細(xì)胞因子，如干擾素γ(interferon，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleuki-6，IL-6)、IL-8、IL-10等，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞進(jìn)一步聚集和活化[13]。雷公藤成分-靶點(diǎn)-Graves眼病網(wǎng)絡(luò)與雷公藤成分-Graves眼病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)均顯示雷公藤甲素、山柰酚、川陳皮素、β-谷甾醇為改善Gravse眼病的主要成分。燕樹勛等[14]實(shí)驗(yàn)證明了雷公藤甲素抑制眼球后成纖維細(xì)胞的增生，抑制IFN-γ誘導(dǎo)的CD40的表達(dá)。NF-κB調(diào)節(jié)著TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β和其他細(xì)胞因子的表達(dá)[15]。雷公藤甲素還可抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性[16]，抑制TNF-α的表達(dá)[17]。山柰酚作為膳食抗感染劑被研究[18]，在嚙齒類動物非特異性急性炎癥中，β-谷甾醇被證明具有較強(qiáng)的抗感染能力[19]，川陳皮素能夠通過抑制TGF-β1來抑制成纖維細(xì)胞的生長和纖維化[20]。因此雷公藤可能主要通過雷公藤甲素、山柰酚、川陳皮素、β-谷甾醇等改善Graves眼病。

本研究結(jié)果表明，雷公藤改善Graves眼病的靶點(diǎn)主要集中在前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase2 PTGS2)、TNF、干擾素γ、TGF-β1、CD40、氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)、 細(xì)胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CAM1)。PTGS2又稱COX2，在正常組織細(xì)胞內(nèi)的活性極低，在炎癥細(xì)胞中的表達(dá)水平較高，引起炎癥部位PEG2含量的增加，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷。Graves眼病患者眼眶組織炎性因子的釋放增多，增加纖維細(xì)胞的浸潤并增加PGE2的釋放，PGE2又可以通過增加血管的通透性而進(jìn)一步加重病情，塞來昔布作為COX2抑制劑，可以抑制PGE2的釋放，改善患者的局部癥狀和體征[21]，同時(shí)也拮抗PPARγ。PPARG與Graves眼病患者眼眶部的脂肪增殖、分化相關(guān)，將PPARγ激動劑噻唑烷二酮類 (羅格列酮)作用于患者部眼眶成纖維細(xì)胞，能刺激脂肪細(xì)胞的分化和TSHR的表達(dá)[22]。而抑制PPARγ途徑則減少人體前脂肪細(xì)胞分化和細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累，減少眼眶部脂肪增殖，延緩病情進(jìn)展[23]。TGF-β能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長，TGF-β1在分子水平上促使Graves眼病患者眼眶組織成倍增多，引起纖維化癥狀[24]，Li等[25]通過抑制TGF-β1而減輕眼眶細(xì)胞的纖維化。眼眶成纖維細(xì)胞受IFN-γ的刺激而上調(diào)表達(dá)CD40，啟動CD40-CD40L信號通路，刺激眼眶成纖維細(xì)胞高表達(dá)ICAM-1，而高表達(dá)ICAM-1的成纖維細(xì)胞因受黏附作用而促進(jìn)炎癥發(fā)生[26]。

由雷公藤成分-Graves眼病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)可知，NF-κB信號通路為主要的信號通路之一，是免疫和炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)[27]。活性氧可以釋放TNF-α、IL-1、TNF-α、IL-6，刺激NF-κB，使病情進(jìn)展[28]，而糖皮質(zhì)激素則抑制NF-κB通路，起到改善病情的作用。

雷公藤改善Graves眼病的KEGG分析顯示，其作用通路與炎癥性腸病通路關(guān)系密切。炎癥性腸病是感染性微生物和免疫系統(tǒng)失調(diào)引起的胃腸道慢性炎癥，腸腔的環(huán)境最為關(guān)鍵，微生物成分如鞭毛蛋白、肽聚糖和脂多糖可被TLR識別觸發(fā)NF-κB的激活，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[29]。而腸腔環(huán)境的變化，與甲狀腺疾病的發(fā)生同樣密切相關(guān)，如甲狀腺功能亢進(jìn)患者的雙歧桿菌和乳桿菌明顯減少，腸球菌增加[30]。炎癥性腸病通路有Th17細(xì)胞參與，Th17細(xì)胞在Graves眼病的發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)ang等[31]研究表明，疾病在活動期時(shí)Th17細(xì)胞數(shù)量增多，伴隨著病情的緩解，Th17細(xì)胞數(shù)量逐漸下降。Graves眼病同樣與TLR信號通路關(guān)系密切，推測Graves眼病的發(fā)病與腸道微生物關(guān)系密切，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

研究結(jié)果表明，雷公藤的一種活性成分可以調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)，而同一靶點(diǎn)可干預(yù)多種生物過程及信號通路，體現(xiàn)了雷公藤多靶點(diǎn)、多通路的聯(lián)合作用。提示雷公藤的活性成分可通過重要靶點(diǎn)對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全部或者局部調(diào)節(jié)，起到改善Graves眼病的作用，同時(shí)預(yù)測了雷公藤通過調(diào)控腸道微生物改善Graves眼病的潛在作用機(jī)制。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性以及中藥成分進(jìn)入人體后反應(yīng)的復(fù)雜性，仍需后續(xù)進(jìn)行動物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。