張雷，朱衛(wèi)，黃豫，蔣潔君

昆山市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 昆山 215300

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19，簡稱新冠肺炎)是一種急性呼吸道傳染病，而中藥在改善發(fā)熱、咳嗽，避免或緩解炎癥風暴，促進肺部炎癥吸收、減輕并發(fā)癥等方面獨具療效[1-2]，而Akt1則是治療和預(yù)防COVID-19導(dǎo)致的肺組織損傷、消除病毒感染的潛在靶標[3]。因此，從藥味組方角度闡明中藥配伍規(guī)律的現(xiàn)代科學內(nèi)涵，可以為充分發(fā)揮方劑藥效提供思路[4]。

達原飲始載于《溫疫論》，作為治療“濕濁”的抗疫古方，有開達膜原，辟穢化濁，清熱解毒之功，可使穢濁得化，熱毒得清，陰津得復(fù)，為治療新冠肺炎的代表性方劑[5]，能改善患者的臨床癥狀和體征，縮短病程[6]。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學研究預(yù)測了達原飲治療新冠肺炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和機制特點，有效成分檢測方法也得以建立[7-9]，但要進一步探究其深層次的方劑配伍內(nèi)涵與確切作用機制，有必要結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測和實驗驗證方法[10]。

本研究建立藥物、蛋白質(zhì)和通路之間的聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)，分析達原飲破結(jié)逐邪組(檳榔、厚樸、草果)、清熱滋陰組(知母、白芍、黃芩)和甘草組(甘草)等不同組分的靶標和通路之間的關(guān)系。通過構(gòu)建大鼠急性肺炎模型[11]，以脾臟中白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α含量以及PI3K、Akt蛋白及其磷酸化表達水平為指標，探討達原飲方劑配伍對藥效的影響，進一步揭示達原飲治療COVID-19引起的急性肺炎作用機制，闡釋其科學配伍內(nèi)涵[12]。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑達原飲由檳榔9 g，厚樸6 g，草果3 g，知母6 g，白芍6 g，黃芩6 g，甘草3 g組成，購自昆山市中醫(yī)院，煎煮濃縮至含生藥量濃度為1 g·mL-1，放涼，置于4 ℃冰箱備用。脂多糖(批號 L2880，sigma中國公司)；IL-2 、TNF-α ELISA試劑盒(批號20210302112、20210307245，上海信帆生物公司)；PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白抗體分別由Bioss、Gene Tex、CST中國公司提供。RIPA 裂解液(批號 P1010，北京索來寶公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(批號SH30809.01B，美國Hyclone公司)。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

1.2.1 目標化合物的選取以達原飲中7味藥材的各結(jié)構(gòu)類型代表性成分為主，結(jié)合Pubchem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中收錄的7味藥材的化學成分，共選取25個化合物為實驗研究對象，其中包括檳榔中4個成分(檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿、去甲基檳榔次堿)；厚樸中3個成分(厚樸酚、和厚樸酚、β-桉葉醇)；草果中3個成分(1，8-桉油素、檸檬醛、香葉醇)；知母中4個成分(知母皂苷、芒果苷、異芒果苷、淫羊藿苷)；白芍中3個成分(芍藥苷、白芍苷、沒食子酸)；黃芩中3個成分(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素)；甘草中5個成分(甘草苷、異甘草素、甘草酸、甘草酸二銨、甘草次酸)。

1.2.2 目標化合物作用靶點的預(yù)測通過Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得化合物的3D結(jié)構(gòu)后利用反向分子對接數(shù)據(jù)庫 PharmMapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)和Swisstargets數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)進行靶點預(yù)測，將兩個數(shù)據(jù)庫中得分最高的前10個靶點篩選出來，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/)，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction,PPI)，以此分析各拆方組化合物的藥理作用異同點。

1.2.3 作用通路的預(yù)測與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將篩選后的靶點投入STRING數(shù)據(jù)庫，得到所有靶點蛋白的官方命名，進行靶點通路富集；結(jié)合文獻查閱等手段，將相關(guān)化合物、靶點和通路導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，利用Adobe Illustrator CS5繪制達原飲化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)藥理圖，探究達原飲治療急性肺炎的多靶點、多通路協(xié)同治療特點，闡釋其配伍合理性。

1.3 動物驗證實驗

1.3.1 動物模型構(gòu)建與給藥選用雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量(200±10) g，購自卡文斯百格(蘇州)模式動物研究有限公司，合格證號：SCXK(蘇)2018-0002。將36只大鼠隨機分為空白組、模型組、破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組、甘草組和全方組，每組6只。除空白組外，其余5組大鼠分別腹腔注射 5 mg·kg-1脂多糖(1 g·L-1)溶液建立急性肺炎模型，空白組和模型組按10 mL·kg-1灌胃生理鹽水，其余4組分別灌胃給藥達原飲提取液2 mL，連續(xù)3 d。所有大鼠造模前禁食12 h，自由飲水。

1.3.2 細胞懸液的培養(yǎng)于末次給藥2 h后，將各組大鼠脫頸處死后浸泡在體積分數(shù)75%酒精中，超凈臺下，平衡達到室溫，刻度吸管吸取大鼠淋巴細胞分離液，加入在培養(yǎng)皿中，將無菌尼龍網(wǎng)放置于培養(yǎng)皿上，無菌取出大鼠脾臟，放置于尼龍網(wǎng)上，研磨脾臟，使脾淋巴細胞經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾后浸入淋巴細胞分離液中。隨后將培養(yǎng)皿內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至離心管中，加入RPMI-1640培養(yǎng)液形成界面，離心后可見上層為RPMI-1640培養(yǎng)液，中層為絮狀分布的淋巴細胞，下層為紅細胞沉淀，吸取淋巴細胞，轉(zhuǎn)移至另一個離心管中，并加入RPMI-1640培養(yǎng)液，吹打均勻，離心后可見白色沉淀即為淋巴細胞，棄上清液，加入RPMI-1640培養(yǎng)液吹勻重懸，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測IL-2、TNF-α含量取培養(yǎng)好的細胞懸液，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，分別標記收集于離心管中，待胰蛋白酶消化細胞后收集沉淀，離心后收集上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，于酶標儀上選擇450 nm波長測定OD值，并根據(jù)試劑盒中提供的標準品濃度繪制標準曲線，計算IL-2和 TNF-α 質(zhì)量濃度。

1.3.4 蛋白免疫印跡法(western blot，WB)檢測PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達取培養(yǎng)好的細胞懸液并調(diào)整濃度，取適量加入RIPA裂解液，離心后取上清液，蛋白質(zhì)定量后存于-80 ℃冰箱備用。BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取適量的蛋白質(zhì)樣品在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，并使用半干式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至NC膜上。轉(zhuǎn)移后，膜用TBST沖洗3次，后經(jīng)PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt 一抗在4 ℃下孵育過夜。全蛋白以GAPDH為內(nèi)參照。次日，用熒光標記的山羊抗兔HRP(11 000 Licor)室溫避光孵育1 h，再TBST 沖洗3次，后加ECL顯色劑入暗室進行曝光、掃描，以Image J 統(tǒng)計條帶灰度值[13]。

2 結(jié)果

2.1 破結(jié)逐邪組作用特點通過篩選得到該組10個代表性化合物的49個作用靶點，其中草果有3個化合物，26個作用靶點；厚樸3個化合物，17個作用靶點；檳榔4個化合物，31個作用靶點。利用Cytoscape 3.6.0軟件得到化合物-靶點作用關(guān)系圖，通過STRING數(shù)據(jù)庫分析靶點蛋白的PPI圖，整合得到該組藥理作用特點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。

圖1 破結(jié)逐邪組作用特點網(wǎng)絡(luò)圖

通過功能分析，49個靶點蛋白主要與神經(jīng)活動配體-受體相互作用、鈣信號通路、膽堿能突觸、PI3K-Akt信號通路、代謝途徑和5-羥色胺能突觸等過程相關(guān)。

2.2 清熱滋陰組作用特點通過篩選，得到了該組10個化合物的44個作用靶點，其中，知母有4個化合物，18個作用靶點；黃芩有3個化合物，28個作用靶點；白芍有3個化合物，12個作用靶點。利用Cytoscape 3.6.0軟件得到化合物-靶點作用關(guān)系圖，通過STRING數(shù)據(jù)庫分析了靶點蛋白的PPI 圖，整合得到該組藥理作用特點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 清熱滋陰組作用特點網(wǎng)絡(luò)圖

通過功能分析，44個靶點蛋白主要與PI3K-Akt信號通路、Th17細胞分化、IL-17信號通路、MAPK信號通路、代謝途徑和cGMP-PKG信號通路等過程相關(guān)。

2.3 甘草組作用特點通過篩選，得到了甘草中有5個化合物，32個作用靶點。利用Cytoscape 3.6.0 軟件，得到化合物-靶點作用關(guān)系圖，通過STRING數(shù)據(jù)庫分析了靶點蛋白的PPI圖，整合得到甘草組藥理作用特點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

圖3 甘草組作用特點網(wǎng)絡(luò)圖

通過功能分析，32個靶點蛋白主要與代謝途徑、內(nèi)分泌抵抗、松弛素信號通路、HIF-1信號通路、JAK-STAT信號通路、cAMP信號通路等生理過程相關(guān)。

2.4 達原飲配伍規(guī)律通過將達原飲的破結(jié)逐邪組、 清熱滋陰組和甘草組所有代表性化合物的作用靶點、作用通路整合，獲得147條有關(guān)作用特點的通路。將前30條通路(FDR<1×10-5)及其156個靶點，見表1、表2。利用Cystoscap 3.6.0軟件得到化合物-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。分析發(fā)現(xiàn)，破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組和甘草組既有共同的作用靶點群及通路群，又各有偏重，作用靶點涉及代謝途徑、PI3K-Akt信號通路、膽堿能突觸、IL-17信號通路、HIF-1信號通路等各個環(huán)節(jié)，各通路群間通過共有靶點連接，顯示出不同成分間的多靶點、多途徑的協(xié)同作用[4]。針對實驗?zāi)康模x擇細胞因子 IL-2、TNF-α的表達以及PI3K-Akt通路進行驗證。

表1 達原飲涉及的前30條通路信息

表2 達原飲涉及的156個靶點信息

注：藍色菱形為活性成分，綠色橢圓為靶點，紫色箭頭代表前30條通路

2.5 達原飲對大鼠脾淋巴細胞IL-2、TNF-α含量的影響與空白組比較，模型組大鼠IL-2、TNF-α含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明造模成功；與模型組比較，破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組、甘草組和全方組大鼠IL-2含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組、甘草組IL-2、TNF-α水平與全方組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 達原飲對大鼠脾淋巴細胞IL-2、TNF-α含量的影響

2.6 達原飲對大鼠脾淋巴細胞PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表達的影響與空白組比較，模型組大鼠PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，全方組、清熱滋陰組和破結(jié)逐邪組大鼠p-PI3K、p-Akt 的表達均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，甘草組僅顯著降低p-Akt含量，清熱滋陰組顯著降低PI3K蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。全方組PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達與各拆方組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4、圖5。

表4 達原飲對大鼠脾淋巴細胞PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表達的影響

注：1為空白組；2為模型組；3為破結(jié)逐邪組；4為清熱滋陰組；5為甘草組：6為全方組

3 討論

冠狀病毒的實驗研究和臨床治療助推了該病潛在機制的揭示，但為冠狀病毒感染患者提供安全有效的藥物方案仍在不斷優(yōu)化中。中醫(yī)方劑達原飲是治療疫病的公認有效藥物，但其抗新冠病毒引起的急性肺炎的配伍內(nèi)涵及潛在機制尚不清楚。本研究中，先通過拆方分析，構(gòu)建了相關(guān)的藥物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測了其交叉協(xié)同的作用特點，再通過細胞實驗驗證了可能的機制，從藥效學角度揭示了達原飲治療COVID-19引起的急性肺炎配伍科學內(nèi)涵。

已有研究發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒感染在宿主細胞中通過激活PI3K-Akt通路或提高蛋白激酶磷酸化水平進而激活ERK-MAPK信號通路，進而完成病毒的復(fù)制和組裝，通過激活細胞因子和化學趨化因子導(dǎo)致免疫過度應(yīng)答而引發(fā)機體炎癥和細胞因子風暴可能是主要致病機制[13]，在感染后可能通過降低自身活性以躲避宿主的免疫防御[14]。但中藥可能通過降低炎性反應(yīng)、調(diào)控PI3K-Akt通路干擾病毒入侵宿主及進行復(fù)制的過程，降低表達的同時進一步抑制病毒復(fù)制，從而發(fā)揮治療呼吸道病毒感染的作用[15]。IL-2發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，既促進T細胞的增殖與分化，又限制其反應(yīng)以增強機體免疫耐受，TNF-α是細胞因子網(wǎng)絡(luò)的啟動因子，能誘導(dǎo)其他細胞因子如IL-6、IL-1β 等的釋放，共同對組織造成損傷，又可以抑制病毒介導(dǎo)的細胞病變并降低病毒數(shù)量[16-17]；脾臟是免疫細胞居住、增殖并進行免疫應(yīng)答和產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)的基地，內(nèi)毒素(脂多糖)可以觸發(fā)機體炎癥反應(yīng)與細胞損害，而脾切除后，脂多糖大鼠肺組織炎癥反應(yīng)和細胞損害明顯加重[18]，間接證實脾臟在炎癥調(diào)控過程中的重要作用。故通過分析脾淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)功能，可以對急性肺炎在內(nèi)的相關(guān)肺損傷的臨床治療提供新思路。

網(wǎng)絡(luò)藥理學分析發(fā)現(xiàn)，達原飲中的25個化合物與156個(前30條通路)潛在的藥物靶點相匹配，其藥物可作用于PI3K-Akt信號通路的IL-2和MAPK信號通路的TNF等靶點發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[16]。故本研究以炎癥因子IL-2、TNF和PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表達水平為目標，以此探究達原飲配伍規(guī)律和作用機制是可行的。實驗結(jié)果表明，模型組較空白組大鼠脾淋巴細胞中IL-2、TNF含量及PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達均顯著升高；治療后，除清熱滋陰組外，達原飲其余各組IL-2、TNF水平均明顯降低；但在降低PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt表達上，除全方組外，破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組、甘草組作用均不全面，不能有效降低Akt 表達，只能顯著降低p-Akt表達，表明在LPS誘導(dǎo)急性肺炎后，抑制Akt的磷酸化確實是達原飲發(fā)揮作用的機制，從而證實了預(yù)測的結(jié)果。從作用效果角度看，在降低IL-2、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達上，破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組、甘草組效果均不及全方組(P<0.05)，這也說明達原飲中各藥味通過協(xié)同配合，從炎癥因子IL-2、TNF和PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表達方面起到治療COVID-19的作用。

綜上，本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法初步闡述了達原飲各組藥材間協(xié)同配伍特點，并從PI3K-Akt信號通路關(guān)鍵基因及其磷酸化蛋白表達水平驗證了預(yù)測的機制，揭示了達原飲治療COVID-19引起的急性肺炎的科學內(nèi)涵，并通過各項指標進一步展示了該藥可能的作用靶標及途徑。但這項研究有一定的局限性，只是針對網(wǎng)絡(luò)藥理學的一般性質(zhì)，選取了部分靶點和通路進行了分析，需要更全面的研究[12]。