劉一名, 徐新建, 周姝婧, 姚 丹, 李 寒, 朱晨煜, 李 想,赫昱暢, 周冰峰, 朱翔杰

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002)

溫度是影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子之一，蜜蜂是社會(huì)性昆蟲，其蜂子(卵、幼蟲、蛹的統(tǒng)稱)發(fā)育具有狹溫性且對(duì)發(fā)育溫度敏感。蜜蜂具有調(diào)節(jié)巢溫的能力，蜂巢有蜂子的情況下，蜂群的中心溫度會(huì)穩(wěn)定在35℃(Kronenberg and Heller, 1982; Stabentheineretal., 2010; 周莉等, 2015)。研究證明意大利蜜蜂Apismelliferaligustica工蜂封蓋子的最適發(fā)育溫區(qū)為33～35℃，當(dāng)發(fā)育溫度偏離封蓋子發(fā)育的適溫區(qū)，會(huì)導(dǎo)致蜜蜂發(fā)育畸形或死亡(朱翔杰, 2006; 李月, 2008)。封蓋期溫度的微小變化會(huì)影響成蜂的外部形態(tài)(朱翔杰, 2006)、大腦發(fā)育(Grohetal., 2004)、記憶能力(Tautzetal., 2003; Jonesetal., 2005)、行為(Becheretal., 2009)和抵抗外界環(huán)境壓力的能力(Floresetal., 1996; Medrzyckietal., 2010)。

低溫脅迫會(huì)提高蜜蜂體內(nèi)的抗凍劑和抗氧化酶系統(tǒng)從而提高個(gè)體抗寒性。越冬期蜜蜂工蜂體內(nèi)甘油、海藻糖、甘露醇、山梨醇等抗凍劑物質(zhì)大量積累(徐凱等, 2018; Qinetal., 2019)。越冬期中華蜜蜂Apisceranacerana的總抗氧化能力以及超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶活性增強(qiáng)(夏振宇等, 2019)。低溫脅迫也會(huì)影響昆蟲發(fā)育期昆蟲脂肪、碳水化合物的代謝通路，進(jìn)而影響昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育以及免疫通路(李潔瓊等, 2013; 庫(kù)爾班·吐松等, 2016; Xuetal., 2017; 姚丹等, 2020)。轉(zhuǎn)錄組分析揭示中華蜜蜂低溫脅迫后糖和氨基酸的生物合成、氨基酸合成與代謝通路、鈣離子活性通路相關(guān)基因差異表達(dá)，熱休克蛋白、鋅指蛋白和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等基因可能是中華蜜蜂成蜂越冬期間抗寒能力的關(guān)鍵基因(Xuetal., 2017)。目前，蜂子抗寒能力和響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制還不清楚。

本團(tuán)隊(duì)前期研究了西方蜜蜂Apismellifera不同日齡封蓋子在20℃條件下對(duì)低溫敏感性，封蓋后3 d預(yù)蛹是對(duì)低溫最敏感的發(fā)育階段；封蓋后9 d處于蛹中期，對(duì)低溫最不敏感；封蓋后6 d蛹對(duì)低溫敏感性介于封蓋后3和9 d蛹之間(Wangetal., 2016)。封蓋后3 d預(yù)蛹期封蓋子20℃低溫脅迫后發(fā)現(xiàn)810個(gè)基因顯著上調(diào)和183個(gè)基因顯著下調(diào)，其中胰島素樣肽基因ILP和CREB，結(jié)合蛋白基因CBP均上調(diào)，可能通過(guò)調(diào)控FoxO信號(hào)通路調(diào)控低溫抑制3日齡封蓋子的化蛹(姚丹等, 2020)。在前期研究基礎(chǔ)上，為了探索西方蜜蜂工蜂不同蛹期封蓋子對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，本研究在20℃低溫進(jìn)行短時(shí)4 h脅迫不同階段西方蜜蜂工蜂蛹，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)，根據(jù)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)的功能分類和代謝通路分析，在轉(zhuǎn)錄組水平上探索西方蜜蜂工蜂不同蛹期封蓋子對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣本材料

蜜蜂樣本取自4-6月春季增長(zhǎng)階段的西方蜜蜂蜂群，準(zhǔn)備蜂王產(chǎn)卵力強(qiáng)的產(chǎn)卵群3群和群勢(shì)12足框的哺育群1群。3個(gè)產(chǎn)卵蜂群作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)群。

將空脾置于產(chǎn)卵蜂群進(jìn)行限王產(chǎn)卵，以獲取卵齡一致的蜜蜂卵，再將卵脾放入哺育群哺育。移入哺育群5 d后幼蟲即將封蓋，每2 h檢查一次封蓋情況，獲取2 h以內(nèi)封蓋的封蓋子，割取封蓋巢脾。先在恒溫恒濕箱中[施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司，CTHI-250B]分別培育3, 6和9 d，培育條件35±0.2℃， RH 75%(Wangetal., 2016)。對(duì)照組在該條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，記為CK3, CK6和CK9；低溫處理組則移入溫度20±0.2℃和RH 75%的恒溫恒濕箱中處理4 h，記為T3, T6和T9。所取封蓋子樣本立即用液氮冷凍，放入-80℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)日齡的對(duì)照組和處理組分別從3個(gè)蜂群作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)測(cè)序，每群取10只封蓋子，10只封蓋子混合后作為一個(gè)測(cè)序樣本，共測(cè)序18個(gè)樣本。

1.2 高通量測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

樣本文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序委托廣州基迪奧生物科技有限公司使用Illumina HiSeqTM4000平臺(tái)進(jìn)行。下機(jī)數(shù)據(jù)使用fastp進(jìn)行過(guò)濾，去除含adapter的reads、含N比例大于10%的reads、全部都是A堿基的reads、質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條read 50%以上的reads后得到clean reads(Chenetal., 2018)，對(duì)比到西方蜜蜂的基因組Amel_HAv3.1(NCBI Assembly: GCF_003254395.2)。所得原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(獲取號(hào)：SRR15258477-SRR15258487, SRR15258489-SRR15258493, SRR15258497-SRR15258498)。

1.3 差異表達(dá)基因(DEGs)篩選及功能分析

使用DESeq2軟件對(duì)生物學(xué)重復(fù)的處理組與對(duì)照組間進(jìn)行差異分析(Loveetal., 2014)，DEGs篩選條件為|log2FC|≥1[fold change(FC)=處理組FPKM/對(duì)照組FPKM]，F(xiàn)DR≤0.05。分別對(duì)T3vsCK3, T6vsCK6和T9vsCK9這3組數(shù)據(jù)進(jìn)行DEGs分析，得到3個(gè)發(fā)育階段低溫處理后的DEGs。分別對(duì)每個(gè)發(fā)育階段的DEGs做Venn分析，進(jìn)一步進(jìn)行GO功能分類和KEGG通路分析。

1.4 DEGs的RT-qPCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性，從各比較組T3vsCK3, T6vsCK6和T9vsCK9分別選取8, 6和 5個(gè)DEGs(表1)進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，利用NCBI Primer Blast設(shè)計(jì)引物(表1)。將1.2節(jié)測(cè)序所用的RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA作為模板進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系和程序按全式金生物科技有限公司的PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix說(shuō)明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(10 μL): H2O 3.4 μL, 2×PerfectStartTMSuperMix 5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL, cDNA模板1 μL, Dye Ⅱ 0.2 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 60℃退火和延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線默認(rèn)QuantStudio 5系統(tǒng)程序(95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 95℃ 1 s)。以Actin作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)，每個(gè)目的基因表達(dá)量檢測(cè)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，取平均值。各基因的相對(duì)表達(dá)量在與測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)比時(shí)，先經(jīng)過(guò)log2(平均值)的轉(zhuǎn)換。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers for RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

通過(guò)測(cè)序，CK3, CK6, CK9, T3, T6和 T9分別得到原始讀段平均為90 772 537, 89 198 197, 83 691 883, 95 418 175, 84 371 909和93 973 924，過(guò)濾后得到高質(zhì)量有效讀段平均分別為90 656 963, 89 031 343, 83 586 031, 95 297 370, 84 218 866和93 813 699。所有樣品兩端的平均Q20和Q30分別為97.28%和92.43%。表明本研究測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于進(jìn)一步分析。

2.2 DEGs的篩選

與對(duì)照組(35℃下)相比，受到低溫脅迫后，封蓋后3 d預(yù)蛹,以及封蓋后6和9 d蛹分別有220, 50和26個(gè)DEGs。對(duì)低溫更敏感的封蓋后3 d預(yù)蛹在受低溫脅迫后DEGs數(shù)較多；低溫影響相對(duì)較小的封蓋后6和9 d蛹期DEGs數(shù)量也相對(duì)較少。通過(guò)差異表達(dá)基因篩選及Venn分析，發(fā)現(xiàn)不同日齡的封蓋子存在3個(gè)共同響應(yīng)低溫的基因，分別為上調(diào)表達(dá)的3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1基因(PDK1)(GenBank登錄號(hào): LOC410732)和下調(diào)表達(dá)的Toll樣受體基因(Tollo)(GenBank登錄號(hào): LOC410231)、H+/Cl-交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白7基因(CLCN7)(GenBank登錄號(hào): LOC413069)；封蓋后3 d預(yù)蛹和封蓋后6 d蛹有5個(gè)共有基因，為肌聯(lián)樣蛋白基因(Titin)(GenBank登錄號(hào): LOC107965630)，mab蛋白21基因(mab21)(GenBank登錄號(hào): LOC550677)，胞質(zhì)鐵硫蛋白組裝蛋白Ciao1基因(Ciao1)(GenBank登錄號(hào): LOC551415)，RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄亞基的介體28基因(MED28)(GenBank登錄號(hào): LOC726666)和囊泡抑制性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(VIAAT)(GenBank登錄號(hào): LOC409089)；封蓋后6 d蛹和封蓋后9 d蛹有1個(gè)共有基因，為雙功能精氨酸脫甲基酶和賴氨酰羥化酶基因(PSR, GenBank登錄號(hào)： LOC411069)；封蓋后3 d預(yù)蛹以及封蓋后6和9 d蛹分別有211, 41和21個(gè)特有響應(yīng)低溫脅迫的基因(圖1)。

圖1 西方蜜蜂工蜂蛹響應(yīng)低溫脅迫的差異表達(dá)基因(DEGs)韋恩圖Fig.1 Venn map of differentially expressed genes (DEGs)in Apis mellifera worker pupae in responseto low temperature stressCK3, CK6和CK9分別為35℃培養(yǎng)的封蓋后3 d工蜂預(yù)蛹以及封蓋后6和9 d工蜂蛹對(duì)照組；T3, T6和T9分別為20℃培養(yǎng)的封蓋后3 d工蜂預(yù)蛹以及封蓋后6和9 d工蜂蛹低溫處理組。CK3, CK6 and CK9 were the 3-d-old post-capped prepupae of workers and 6- and 9-d-old post-capped pupae of workers, respectively reared at 35℃ as the control groups, while T3, T6 and T9 were the 3-d-old post-capped prepupae of workers and 6- and 9-d-old post-capped pupae of workers, respectively exposed to 20℃ as the cold treatment groups.下同The same below.

2.3 DEGs的GO功能分類

封蓋后3 d預(yù)蛹響應(yīng)低溫脅迫的DEGs的GO功能分類涉及生物學(xué)進(jìn)程(41個(gè))、分子功能(34個(gè))和細(xì)胞組分(18個(gè))，富集的二級(jí)GO條目多于封蓋后6和9 d蛹的，富集基因數(shù)較多的為生物學(xué)進(jìn)程大類的代謝進(jìn)程(metabolic process)、細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)、單有機(jī)體進(jìn)程(single-organism process)、生物學(xué)進(jìn)程調(diào)控(regulation of biological process)、生物學(xué)調(diào)控(biological regulation)；分子功能大類的催化活性(catalytic activity)、結(jié)合(binding)；細(xì)胞組分大類的細(xì)胞(cell)、細(xì)胞部分(cell part)、細(xì)胞器(organelle)；封蓋后6 d蛹的DEGs富集數(shù)分布為生物學(xué)進(jìn)程(8個(gè))、分子功能(8個(gè))和細(xì)胞組分(6個(gè))；封蓋后9 d蛹的基因富集數(shù)分布為生物學(xué)進(jìn)程(9個(gè))、分子功能(9個(gè))和細(xì)胞組分(2個(gè))(圖2)。

圖2 西方蜜蜂工蜂蛹響應(yīng)低溫脅迫的DEGs的GO功能分類Fig.2 GO functional classification of DEGs in Apis mellifera worker pupae in response to low temperature stress

封蓋后3 d預(yù)蛹的DEGs分別顯著富集生物學(xué)進(jìn)程和分子功能大類的13和9條GO條目，多數(shù)與機(jī)體和細(xì)胞對(duì)激素和刺激的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄活性以及酶活性調(diào)節(jié)和催化活性調(diào)節(jié)相關(guān)(圖3)；封蓋后6 d蛹的DEGs顯著富集7條GO條目，生物學(xué)進(jìn)程大類的4條顯著富集條目均與酚類代謝相關(guān)，分子功能大類的3條顯著富集條目均與氧化還原酶活性相關(guān)(圖4)，下調(diào)DEG酪氨酸羥化酶基因TyHyd均富集在這7條條目上。封蓋后9 d蛹的DEGs顯著富集的條目只有分子功能大類的結(jié)合。

圖3 西方蜜蜂工蜂封蓋后3 d預(yù)蛹響應(yīng)低溫脅迫的DEGs顯著富集的GO條目Fig.3 Significantly enriched GO terms of DEGs in 3-d-old post-capped prepupae of Apis mellifera workersin response to low temperature stress

圖4 西方蜜蜂工蜂封蓋后6 d蛹響應(yīng)低溫脅迫的DEGs顯著富集的GO條目Fig.4 Significantly enriched GO terms of DEGs of 6-d-old post-capped pupae of Apis mellifera workersin response to low temperature stress

2.4 DEGs的KEGG通路富集

KEGG B級(jí)通路富集顯示，受到低溫脅迫后封蓋后3 d預(yù)蛹以及封蓋后6和9 d蛹的DEGs均有在代謝上的整體概述圖(global and overview maps)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)；環(huán)境信息加工的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)；細(xì)胞進(jìn)程的運(yùn)輸和分解代謝(transport and catabolism)有富集(圖5)。3個(gè)不同階段封蓋子的共有DEG 3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1基因PDK1同時(shí)富集在自噬-動(dòng)物、mTOR信號(hào)通路和FoxO信號(hào)通路(表2)。

封蓋后3 d預(yù)蛹響應(yīng)低溫脅迫的DEGs所富集的信號(hào)通路最多，較多地富集在代謝上的碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、脂質(zhì)代謝(lipid metabolism)、糖的生物合成與代謝(glycan biosynthesis and metabolism)等；細(xì)胞進(jìn)程上的細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡(cell growth and death)；且只有封蓋后3 d預(yù)蛹在有機(jī)體系統(tǒng)上的通路有富集(圖5)。封蓋后3 d預(yù)蛹特有的DEG胰島素受體底物1-B基因IRS1-B和雷帕霉素復(fù)合物靶點(diǎn)基因LST8富集在自噬-動(dòng)物和mTOR信號(hào)通路(表2)。

圖5 西方蜜蜂工蜂封蓋后3 d預(yù)蛹以及封蓋后6和9 d蛹響應(yīng)低溫脅迫的DEGs的KEGG通路富集Fig.5 KEGG pathway enrichment of DEGs in 3-d-old post-capped prepupae and 6- and 9-d-old post-capped pupaeof Apis mellifera workers in response to low temperature stressA: 代謝Metabolism; B: 遺傳信息加工Genetic information processing; C: 環(huán)境信息加工Environmental information processing; D: 細(xì)胞進(jìn)程Cellular process; E: 有機(jī)體系統(tǒng)Organismal system.

2.5 DEGs的RT-qPCR驗(yàn)證

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果與RNA測(cè)序結(jié)果的基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致，證實(shí)RNA測(cè)序結(jié)果可信(圖6)。

3 討論

在社會(huì)性進(jìn)化過(guò)程中，蜂子自身適應(yīng)環(huán)境溫度的能力較弱，多個(gè)研究已經(jīng)證實(shí)蜜蜂封蓋子發(fā)育期受低溫或高溫脅迫后影響蜜蜂個(gè)體發(fā)育健康(朱翔杰, 2006; 李月, 2008; Wangetal., 2016)。但低溫脅迫影響蜜蜂個(gè)體發(fā)育的機(jī)制仍未知，因此本研究通過(guò)對(duì)封蓋后3 d預(yù)蛹以及封蓋后6和9 d蛹不同發(fā)育階段的蜂子響應(yīng)低溫脅迫后的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，尋找低溫脅迫影響蜂子發(fā)育的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵通路，為進(jìn)一步探索其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

通過(guò)比較蜜蜂蛹不同發(fā)育階段的差異基因，發(fā)現(xiàn)了這3個(gè)階段共有的差異基因PDK1，根據(jù)該基因所在的3條通路分析，找到了低溫脅迫條件下，F(xiàn)oxO信號(hào)通路是影響自噬、保幼激素和蛻皮激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心。進(jìn)一步結(jié)合封蓋后3 d預(yù)蛹所特有的差異基因分析，找到了更多的參與自噬、保幼激素和蛻皮激素調(diào)控的差異基因(表2)，這不僅進(jìn)一步證明了低溫脅迫會(huì)影響以FoxO信號(hào)通路為核心，涉及到自噬和激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的存在，也很好地解釋了封蓋后3 d預(yù)蛹相對(duì)其他發(fā)育階段對(duì)低溫最敏感的事實(shí)。同時(shí)，在封蓋后6 d的蛹所特有基因中，檢測(cè)到與昆蟲表皮著色和免疫相關(guān)的DEGTyHyd，這與前期研究發(fā)現(xiàn)該時(shí)期蛹低溫處理后出現(xiàn)較高比例的黑色個(gè)體的現(xiàn)象(朱翔杰, 2006; Wangetal., 2016)一致，為進(jìn)一步探索該現(xiàn)象的分子機(jī)制提供了思路。而封蓋后9 d蛹特有的少數(shù)基因中，未檢測(cè)到與預(yù)期目標(biāo)相關(guān)的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵通路，可能因?yàn)樵撾A段對(duì)低溫最不敏感，在同樣長(zhǎng)的低溫脅迫強(qiáng)度下，受到的影響較小。

封蓋后3 d預(yù)蛹以及封蓋后6和9 d蛹響應(yīng)低溫脅迫后，DEGPDK1均顯著上調(diào)表達(dá)(圖6)，可能調(diào)控蜜蜂蛹在低溫脅迫下的細(xì)胞自噬和蛻皮受到抑制。PDK1是蛋白激酶B(PKB)的上游激酶，PDK1具有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，即PH結(jié)構(gòu)域和氨基端激酶結(jié)構(gòu)域，能夠通過(guò)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化一系列激酶保守區(qū)域而激活這些激酶，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、擴(kuò)散、生存和抗凋亡等諸多生理過(guò)程(Biondi, 2004)。KEGG結(jié)果顯示，PDK1同時(shí)富集在mTOR信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路和自噬-動(dòng)物通路(表2)。PDK1是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵因子之一，PDK1會(huì)增強(qiáng)PI3K信號(hào)通路活性并激活mTOR，使自噬過(guò)程受到抑制，細(xì)胞正常的代謝水平受到影響(McManusetal., 2016)。PDK1還可通過(guò)影響FoxO信號(hào)通路抑制蛻皮。PDK1磷酸化Akt使其激活，磷酸化的Akt作用于下游的FoxO， 使 FoxO 磷酸化而不能進(jìn)入細(xì)胞核，滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的FoxO不能與其靶基因結(jié)合，失去轉(zhuǎn)錄功能，無(wú)法完成蛻皮(Cantrell, 2001; Sarbassovetal., 2005; Caietal., 2016; Linetal., 2018)。PDK1上調(diào)表達(dá)可引起的Akt磷酸化和FoxO磷酸化， 結(jié)果使 FoxO 無(wú)法入核啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。這與我們前期發(fā)現(xiàn)的胰島素樣肽基因ILP和CREB結(jié)合蛋白基因CBP抑制FoxO入核啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)果(姚丹等, 2020)一致。這進(jìn)一步證實(shí)了FoxO信號(hào)通路介導(dǎo)低溫脅迫對(duì)蜜蜂蛹發(fā)育的影響。

表2 西方蜜蜂工蜂封蓋后3 d預(yù)蛹響應(yīng)低溫脅迫的DEGs富集數(shù)大于2的KEGG通路Table 2 Number of KEGG pathways with the enrichment number of DEGs more than two in 3-d-old post-cappedprepupae of Apis mellifera workers in response to low temperature stress

圖6 西方蜜蜂工蜂蛹響應(yīng)低溫脅迫的DEGs RNA-Seq測(cè)序結(jié)果的RT-qPCR驗(yàn)證Fig.6 Validation of the RNA-Seq sequencing results of DEGs in Apis mellifera worker pupaein response to low temperature stress by RT-qPCR圖中RT-qPCR數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上星號(hào)代表處理組與對(duì)照組之間基因表達(dá)量差異顯著(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)(非配對(duì)T檢驗(yàn))。RT-qPCR data in the figure are means±SD.Sterisks above bars represent significant difference in the gene expression level between the treatment group and the control group (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)(unpaired T-test).

封蓋后的預(yù)蛹和不同階段的蛹對(duì)低溫的耐受性不同，前期的研究結(jié)果顯示，封蓋后3 d預(yù)蛹因?yàn)樘幱诨茧A段，昆蟲內(nèi)部發(fā)生劇烈組織重組，所以比封蓋后6 d和9 d蛹受低溫影響更大(Wangetal., 2016)。從本研究的結(jié)果推測(cè)，封蓋后3 d預(yù)蛹與后面的蛹期相比，細(xì)胞自噬和蛻皮受到抑制程度更大，因此導(dǎo)致處于化蛹階段蜜蜂對(duì)低溫更敏感。封蓋后3 d預(yù)蛹一方面通過(guò)海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因下調(diào)表達(dá)，自噬受到抑制程度增強(qiáng)。除了主要通過(guò)mTOR途徑調(diào)節(jié)自噬外，海藻糖也是自噬的增強(qiáng)因子(Sarkaretal., 2007)。結(jié)果顯示在預(yù)蛹時(shí)期受到低溫脅迫后，海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1基因Tret1和海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1-2基因Tret1-2顯著下調(diào)表達(dá)。海藻糖進(jìn)出細(xì)胞發(fā)揮其特定的功能，需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的幫助才能完成(於衛(wèi)東等, 2020)，因此這兩個(gè)基因下調(diào)表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致海藻糖的功能發(fā)揮受到抑制，從而使自噬受到限制。另一方面，與PDK1共同屬于胰島素信號(hào)通路的基因IRS1-B在低溫脅迫后上調(diào)表達(dá)，胰島素信號(hào)通路位于PI3K信號(hào)通路上游，胰島素可以促進(jìn)PDK1的表達(dá)(Panetal., 2018)?？赡芡ㄟ^(guò)IRS1-B上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)PDK1的表達(dá)，蛻皮抑制程度增加。除此之外，蜜蜂預(yù)蛹期蛻皮抑制程度增加，還可能是因?yàn)榈蜏貙?dǎo)致激素調(diào)控異常，從而導(dǎo)致蜜蜂致死性蛻皮缺陷。蜜蜂預(yù)蛹期要經(jīng)歷從幼蟲態(tài)到蛹態(tài)的變態(tài)發(fā)育，而昆蟲的變態(tài)發(fā)育主要受到保幼激素和蛻皮激素調(diào)控(Thummel, 2001)。封蓋后3 d的預(yù)蛹在受到低溫脅迫后，檢測(cè)到3個(gè)與激素調(diào)控相關(guān)的DEGs:Kr-h1,Ftz-F1和Eth。在受到低溫脅迫后，檢測(cè)結(jié)果顯示基因Kr-h1的表達(dá)量顯著升高，Kr-h1是位于保幼激素途徑下游的關(guān)鍵因子，具有抑制20E應(yīng)答基因表達(dá)的作用，阻止20E誘導(dǎo)變態(tài)發(fā)生(Minakuchietal., 2011; Belles, 2020)，因此由蛻皮激素誘導(dǎo)的變態(tài)可能被抑制。同時(shí)，還檢測(cè)到在低溫脅迫后，由蛻皮激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子核激素受體Ftz-F1基因Ftz-F1和蛻皮激素誘導(dǎo)激素基因Eth均下調(diào)表達(dá)，這2個(gè)基因均作用于20E下游的，具有激活蛻皮行為的功能(Parketal., 2002; Dubrovskyetal., 2011)，Eth基因缺失還會(huì)導(dǎo)致昆蟲在化蛹時(shí)死亡(Lenaertsetal., 2017)，說(shuō)明蛻皮激素誘導(dǎo)變態(tài)的功能受到抑制，可能導(dǎo)致蜜蜂無(wú)法蛻掉幼蟲皮而化蛹失敗。

封蓋后6 d蛹在受到低溫脅迫時(shí)，檢測(cè)到TyHyd的表達(dá)量顯著降低，可能導(dǎo)致酪氨酸羥化酶活性降低。有研究表明酪氨酸羥化酶是全變態(tài)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育所必需的酶，且與昆蟲角質(zhì)層著色與免疫都有關(guān)系(Qiaoetal., 2016; Zhangetal., 2019; Liuetal., 2020)。低溫脅迫使TH的表達(dá)受阻，可能會(huì)對(duì)封蓋子的表皮著色和免疫反應(yīng)造成影響。