王 純 張若鴻 王曉芳 李曉然 尹樹仁 楊 洋,* 崔生輝 郭云昌

(1 河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島 066600；2 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；3 國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京 100022)

乳制品在人類飲食結(jié)構(gòu)中占有重要地位，隨著人們生活水平的不斷提高，其消費量也逐漸增大[1]。乳制品營養(yǎng)豐富，為微生物提供了生長繁殖條件[2]。金黃色葡萄球菌廣泛分布于自然環(huán)境中，是一種常見的食源性致病菌。當(dāng)人體攝入金黃色葡萄球菌后，會引起嘔吐、腹瀉和敗血癥等多種疾病，嚴(yán)重威脅人類健康，對公共健康發(fā)展造成不利影響[3-4]。近年來，國內(nèi)外發(fā)生的乳制品安全事件中，大部分是由金黃色葡萄球菌污染導(dǎo)致的食源性疾病暴發(fā)[5]。因此，迫切需要建立一種快速、靈敏準(zhǔn)確的金黃色葡萄球菌檢測方法。

傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)檢測方法是食源性致病菌檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有成本低、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，但步驟繁雜、費力費時[6]。目前已經(jīng)開發(fā)多種用于檢測食源性致病菌的先進(jìn)技術(shù)[7]，如生物傳感器和基因芯片技術(shù)在病原菌檢測方面具有高通量等優(yōu)勢，但這些技術(shù)實施需要專業(yè)的檢測人員和設(shè)備[8-9]。常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)和免疫學(xué)檢測方法通常存在檢測靈敏度相對較低的問題[10]，一般需要對食品樣品進(jìn)行選擇性增菌，待檢細(xì)菌濃度達(dá)到104～105CFU·mL-1才能獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果[11]。乳制品中含有大量的PCR反應(yīng)抑制因子，如脂肪、蛋白質(zhì)和酶等，其基質(zhì)的多樣性和復(fù)雜性限制了PCR檢測方法的靈敏度，對快速、靈敏檢測方法的發(fā)展造成了巨大挑戰(zhàn)[12]。目前，通常在檢測前增菌12～16 h去除PCR反應(yīng)抑制因子，雖然提高了檢測靈敏度，但延長了檢測時間，難以滿足現(xiàn)場檢測的實際需求[13]。因此，本研究將納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯固定在濾紙片上吸附富集樣品中的金黃色葡萄球菌，旨在建立一種高效、靈敏且無需增菌的PCR快速檢測方法，為乳制品中金黃色葡萄球菌的快速檢測提供技術(shù)支撐，進(jìn)而更好地預(yù)防和控制金黃色葡萄球菌相關(guān)的食源性疾病暴發(fā)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

試驗菌株共180株，其中包含97株金黃色葡萄球菌、48株其他葡萄球菌和35株非葡萄球菌，菌株的詳細(xì)信息見表1。上述所有菌株均來自美國模式微生物菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。使用無菌棉簽分別從平板上取所有菌株的新鮮純培養(yǎng)菌落，轉(zhuǎn)移至含有腦心浸液和20%甘油的冷凍儲存管中，混勻，然后在-80℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

各菌種的菌株培養(yǎng)：金黃色葡萄球菌和其他葡萄球菌菌株在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(tryptic soy broth，TSB)中培養(yǎng)(37℃、24 h)；鮑氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌在厭氧條件下的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)(42.5℃、20 h)；甲型和乙型溶血性鏈球菌在含有5%羊血的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(tryptic soy agar，TSA)中培養(yǎng)(37℃、24 h)；蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)(31℃、48 h)；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)(27℃、48 h)；副溶血性弧菌在補充有3% NaCl的TSB中培養(yǎng)(37℃、18 h)；阪崎腸桿菌在無菌緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基(buffered peptone water，BPW)中培養(yǎng)(37℃、20 h)；在微需氧條件(5%氧氣)下，大腸彎曲菌和空腸彎曲菌接種在Bolton肉湯中培養(yǎng)(42℃、24 h)；李斯特氏菌菌株接種在腦心浸液培養(yǎng)基(brain heart infusion，BHI)中培養(yǎng)(37℃、18 h)。

1.2 主要試劑與儀器

TSA、TSB和BPW，美國BD公司；Bolton肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，美國Thermo Fisher Scientific公司；BHI，德國Merck公司；7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、血平板、無水乙醇、石油醚、氨水、乙酸乙酯、二十烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)溶液和Tris-EDTA溶液(分子純)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；納米氫氧化鈦(100～200 nm)和納米氫氧化鋯(50～100 nm)，北京德科島金科技有限公司；牛血清白蛋白(5 mg·mL-1)、鮭魚精DNA(0.05 mg·mL-1)、DNA Marker(100 bp)、Taq酶(5 U·μL-1)、 10×PCR buffer和dNTPs(1 mmol·L-1)，寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖，上海尚寶生物科技有限公司。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

X3R高速離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific公司；DF-101S磁力攪拌器，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；C1000 Touch PCR儀，美國Bio-Rad公司；DYY-7C電泳儀，北京六一儀器廠；BioSpectrum 310凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 加標(biāo)樣品的制備 本試驗總共從本地(河北省秦皇島市)市場收集了4種不同的乳制品，包括奶酪、生牛乳、全脂乳粉和脫脂乳粉。根據(jù)《GB 4789.10-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[14]確認(rèn)所有采集的乳制品均不含有金黃色葡萄球菌。樣品人工污染過程在二級生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

生牛乳樣品：將1 mL不同濃度(10倍系列稀釋濃度：100～108CFU·mL-1)的金黃色葡萄球菌菌懸液人工污染到25 mL的生牛乳中，使樣品中金黃色葡萄球菌的濃度依次為100、101、102、103、104CFU·25mL-1。

全脂和脫脂乳粉樣品：將5 μL一滴不同濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液(共200 μL)分別接種在平鋪的全脂乳粉和脫脂乳粉(各25 g)上。然后將接種的全脂和脫脂乳粉樣品分別在生物安全柜中靜置30 min，使菌液進(jìn)一步吸附在樣品中，再放入無菌均質(zhì)袋內(nèi)，4℃冰箱過夜吸附。隔天采用《GB 4789.10-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[14]的方法對樣品進(jìn)行定量分析以確定目標(biāo)菌濃度。在上述25 g全脂乳粉及25 g脫脂乳粉中分別加入25 mL無菌超純水，磁力攪拌至完全溶解。奶酪樣品：將5 μL一滴不同濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液(共200 μL)均勻地接種在25 g奶酪的正反面，將接種的奶酪放置在4℃的冰箱過夜吸附。隔天，采用《GB 4789.10-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[14]的方法確定樣品中目標(biāo)菌的濃度。然后將90 mL 2%檸檬酸鈉與25 g奶酪混勻制成均質(zhì)液。最后使全脂乳粉、脫脂乳粉及奶酪均質(zhì)液中金黃色葡萄球菌的濃度均為100、101、102、103、104CFU·25 mL-1。

1.3.2 加標(biāo)樣品的去脂肪處理 將1 mL無水乙醇、1 mL氨水和1 mL石油醚分別加入到25 mL人工污染金黃色葡萄球菌的全脂乳粉、脫脂乳粉、奶酪和生牛乳的均質(zhì)液中，混勻[15]。在12 000 r·min-1條件下離心5 min后，棄上清液。然后用1 mL 10 mmol·L-1的Tris-EDTA (TE，pH 值7.8)溶液充分溶解沉淀物。

1.3.3 納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯的固定 首先將納米氫氧化鈦(100～200 nm)和納米氫氧化鋯(50～100 nm)按照5∶1、4∶1、3∶1、2∶1和1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 的比例溶解在含有10% SDS溶液和10 mmol·L-1TE的混合溶液中(pH值7.8)，磁力攪拌30 min(30℃)至完全溶解，然后過濾除菌，備用。之后使用打孔器制備直徑為4.00 mm的濾紙圓片，放入廣口瓶內(nèi)高壓滅菌15 min(121℃)，然后將其按照無菌操作放置在無菌的不同濃度比例的納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯溶液中，并磁力攪拌5 min至完全滲透。將處理過的濾紙圓片放入提前滅菌處理過的生物安全柜內(nèi)，鼓風(fēng)干燥，備用。最后，將固定了納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯的濾紙圓片在無菌超純水中震蕩清洗2次，除去固定不牢固的金屬氫氧化物，將其放到生物安全柜內(nèi)，再次鼓風(fēng)干燥，備用。

1.3.4 濾紙片處理樣品 向1.3.2所得到的1 mL樣品溶液中加入0.25倍體積的乙酸乙酯，均質(zhì)2 min，然后于14 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液。沉淀用100 μL無菌超純水懸浮，再加到固定了納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯的濾紙圓片中。將吸附樣品的濾紙圓片放入生物安全柜進(jìn)行鼓風(fēng)干燥，然后將其放入5 mL滅菌的10% SDS溶液中，渦旋震蕩2 min，隨后將濾紙圓片放入5 mL 10 mmol·L-1的TE(pH 值7.8)溶液中，渦旋震蕩2 min并清洗2次。最后，將清洗后的濾紙圓片再次放到生物安全柜中進(jìn)行鼓風(fēng)干燥，備用。

1.3.5 金黃色葡萄球菌模板DNA的提取 將吸附樣品的納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯固定的濾紙圓片懸浮在0.5 mL混合溶液中，該混合溶液含有50 μL 0.05 mg·mL-1鮭魚精DNA、50 μL 5 mg·mL-1牛血清白蛋白和400 μL無菌超純水。采用快速沸騰裂解法提取金黃色葡萄球菌DNA[16];將含有上述0.5 mL混合溶液的離心管放入沸水中熱裂解10 min。然后將細(xì)胞裂解物于冰上冷卻至室溫，12 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管內(nèi)。在含有沉淀DNA的離心管中加入等量體積冷卻的無水乙醇，12 000 r·min-1再次離心15 min，棄上清液，保留沉淀。最后，向沉淀DNA中加入100 μL無菌超純水，溶解，將DNA樣品分裝，每份10 μL冷凍保存，用作PCR的模板DNA。

1.3.6 PCR體系建立 本研究選取金黃色葡萄球菌的Nuc毒力基因作為目的基因，其特異性引物序列為5′-G C A G A T T T A C G A G A T A G A G G A A CA-3′和5′-T T T A G G T G G T T A T T T C C T G AC-3′，目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為827 bp。

反應(yīng)體系為50 μL：10×PCR緩沖液5 μL，dNTPs混合物4 μL，正、反向引物(40 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，模板DNA 1 μL，無菌超純水38.75 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，100 V電泳1 h，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3.7 特異性試驗 分別提取來自ATCC的180株菌株的DNA作為模板，采用1.3.6的擴(kuò)增體系，利用本研究檢測方法的Nuc引物序列與公開發(fā)表的血漿凝固酶編碼基因Coa引物序列特異性進(jìn)行比較，驗證該方法的特異性。Coa引物序列：Coa1：5′-C G C G G A T C C A G C T T A T T T A C A T G G G AT-3′；Coa2: 5′-C C G C T C G A G T T A T T T T G T T A C T C T A G GC-3′[17]。

1.3.8 靈敏度試驗 將金黃色葡萄球菌菌液用無菌超純水10倍梯度稀釋，再以不同的稀釋濃度分別人工污染乳制品樣品，獲得所需的樣品濃度為100～104CFU·25g-1或CFU·25mL-1。然后從人工污染的樣品均質(zhì)液中提取1 μL DNA模板進(jìn)行PCR，比較各濃度條件下每種模板的擴(kuò)增情況。在進(jìn)行PCR之前，乳制品樣品均利用國標(biāo)法檢測不含有金黃色葡萄球菌，并且每個樣品均進(jìn)行10次重復(fù)試驗來確定該方法的最低檢測限。

1.3.9 PCR方法在實際樣品中的應(yīng)用 采集市售(河北省秦皇島市)的4種乳制品樣品(全脂乳粉、脫脂乳粉、奶酪、生牛乳)各500份。利用本研究建立的快速檢測方法與《GB 4789.10-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[14]對樣品進(jìn)行檢測，比較2種方法的檢測結(jié)果是否一致，從而驗證本研究建立的檢測方法的實用性。

1.3.10 試劑穩(wěn)定性和實用性試驗 試驗中使用的主要試劑包括金屬氫氧化物紙片、各種緩沖液等，試劑的穩(wěn)定性由試劑在不同保存條件下對該方法的靈敏度是否產(chǎn)生影響決定。首先將所用試劑在-20℃的溫度下分別保存3、6、12個月，然后利用該方法對上述加標(biāo)的4種乳制品樣品進(jìn)行檢測，分別進(jìn)行5次重復(fù)試驗。

同樣，試劑的保存條件同上，然后利用該檢測方法對采集的市售4種乳制品樣品(各500份)進(jìn)行檢測，并與《GB 4789.10-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[14]的檢測結(jié)果進(jìn)行比對，確定該方法所用的試劑耗材在長時間冷凍保存條件下的穩(wěn)定性與實用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR方法的特異性

由表1可知，在Nuc引物序列的檢測結(jié)果中，97株金黃色葡萄球菌呈陽性，而48株其他葡萄球菌及35株非葡萄球菌均為陰性。雖然Coa引物可以特異性檢測所有非葡萄球菌，但在檢測乳制品中的金黃色葡萄球菌及其他葡萄球菌時，出現(xiàn)了假陽性和假陰性結(jié)果。其中，共有11株金黃色葡萄球菌(如ATCC 27706、ATCC BAA-2527等)為陰性結(jié)果，產(chǎn)色葡萄球菌ATCC 43764和表皮葡萄球菌ATCC 35984均為陽性結(jié)果。可見，本試驗Nuc引物序列對金黃色葡萄球菌的檢測表現(xiàn)出了良好的特異性。

表1 PCR特異性測試結(jié)果Table 1 Specificity results of the PCR

表1(續(xù))

表1(續(xù))

2.2 PCR方法的靈敏度

根據(jù)試驗條件優(yōu)化，納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯在濾紙片上的固定比例為1∶1時吸附富集金黃色葡萄球菌的效果最好。靈敏度檢測結(jié)果如圖1和表2所示。由圖1可知，當(dāng)初始模板濃度為101CFU·25g-1或101CFU·25mL-1時，可見清晰條帶，呈陽性結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為827 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。由表2可知，當(dāng)濃度低于101CFU·25g-1或101CFU·25mL-1時，該方法檢測加標(biāo)樣品時均獲得陰性結(jié)果；濃度高于101CFU·25mL-1或101CFU·25g-1時，均為陽性結(jié)果。此外，4種加標(biāo)樣品的10次重復(fù)檢測結(jié)果一致，顯示出良好的可重復(fù)性，說明全脂乳粉、脫脂乳粉和奶酪的檢測限為101CFU·25g-1， 生牛乳的檢測限為101CFU·25mL-1。

注：M：100 bp DNA marker；1：陽性對照；2：陰性對照；3～5：101 CFU·25mL-1人工污染生牛乳樣品中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；6～8：101 CFU·25g-1人工污染全脂乳粉樣品中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；9～11：101 CFU·25g-1人工污染脫脂乳粉樣品中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；12～ 15：101 CFU·25g-1 人工污染奶酪樣品中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。Note: M: 100 bp DNA marker. 1: Positive control. 2: Negative control. 3-5: PCR products amplified from 101 CFU·25mL-1 of artificially contaminated raw milk samples. 6-8: PCR products amplified from 101 CFU·25g-1 of artificially contaminated whole milk powder samples. 9-11: PCR products amplified from 101 CFU·25g-1 of artificially contaminated skim milk powder samples. 12-15: PCR products amplified from 101 CFU·25g-1 of artificially contaminated cheese samples.圖1 初始濃度為 101 CFU·25g-1或101 CFU·25mL-1的人工污染樣品的 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products from artificially contaminated samples with an initial concentration of 101 CFU·25g-1 or 101 CFU·25mL-1

2.3 PCR方法的實用性

采用本研究PCR方法與國標(biāo)法對實際乳制品樣品的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如表3所示，該檢測方法的檢出率、符合率及活菌檢測率與傳統(tǒng)檢測方法一致，驗證了該PCR方法的可靠性。本研究采用的檢測方法檢測時間為4 h，而傳統(tǒng)檢測方法需要長達(dá)6 d，表明該檢測方法的實用性較好。

2.4 試劑的穩(wěn)定性與實用性

試劑穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表4，試驗所用試劑在 -20℃ 冷凍條件下保存3、6和12個月，5次重復(fù)檢測結(jié)果一致，靈敏度均為101CFU·25g-1或101CFU·25mL-1。 因此，本方法所用試劑耗材在-20℃條件下可至少保存12個月，其檢測靈敏度不受影響，穩(wěn)定性良好。

本試驗采用的無需增菌的PCR與國標(biāo)法在試劑不同保存條件下對實際乳制品樣品的檢測結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，試劑保存3、6和12個月，2種方法的檢測率、符合率及活菌檢測率均保持一致，表明所用試劑耗材在冷凍條件下可穩(wěn)定保存至少12個月，該檢測方法的實用性較好。

表2 PCR檢測加標(biāo)乳制品樣品靈敏度結(jié)果Table 2 Sensitivity of PCR detection of spiked dairy samples

表3 PCR和常規(guī)方法在實際樣品中檢測金黃色葡萄球菌的比較結(jié)果Table 3 Comparison results of PCR and conventional methods for S. aureus detection in natural samples

表4 PCR試劑在-20℃保存下的穩(wěn)定性檢測結(jié)果Table 4 Stability results of PCR reagents stored at -20℃

3 討論

近年來，金黃色葡萄球菌已成為繼沙門氏菌和副溶血性弧菌之后的第三大食源性致病菌，而且金黃色葡萄球菌也是乳制品中普遍存在的食源性致病菌[18]。乳制品中金黃色葡萄球菌的快速檢測是保障乳制品安全的重要措施之一。因此，基于納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯固定濾紙片的樣品處理方法，建立無需增菌的PCR快速檢測方法對乳制品的食品安全保障具有重要意義。

表5 PCR試劑在-20℃保存下的實用性檢測結(jié)果Table 5 Application of the PCR reagents stored at -20℃

綜合前人對乳制品中金黃色葡萄球菌檢測方法的研究，分子檢測方法針對SEs、Coa和Nuc等毒力基因的檢測較多[19]。由于微生物基因的多樣性，某些靶基因的保守性和特異性均具有一定缺陷，對PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性會造成影響，如編碼腸毒素的基因[20]。不同地區(qū)、不同樣本的金黃色葡萄球菌所攜帶的編碼基因也不同[21]。因此，如果將產(chǎn)腸毒素編碼基因用作靶基因，往往會導(dǎo)致靶細(xì)菌漏檢。與Coa相比，本研究基于Nuc引物序列的檢測并未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，具有較高的特異性。此外，菌株的數(shù)量，包括目標(biāo)菌株和非目標(biāo)菌株，對于特異性結(jié)果的準(zhǔn)確度也很重要。然而，許多研究只測試了有限的菌株數(shù)量[22]，本研究共測試了180株菌株，菌株數(shù)量較為龐大，檢測結(jié)果更具有準(zhǔn)確性和說服力。

乳制品成分復(fù)雜，含有多種PCR反應(yīng)抑制因子，容易導(dǎo)致檢測方法的靈敏度降低。據(jù)報道，Lee等[23]和 Thapa等[24]分別在增菌12 h和6 h后檢測食品中的金黃色葡萄球菌，獲得的檢測限分別為100CFU·mL-1和101CFU·mL-1。這與本研究靈敏度檢測結(jié)果相似，但本研究無需增菌處理即可在4 h內(nèi)獲得低至101CFU·25g-1或101CFU·25mL-1的檢測限。此外，目前已報道多種方法來消除PCR反應(yīng)抑制因子，如較為常用的免疫磁分離(immunomagnetic separation，IMS)等[25-27]。盡管商業(yè)化的IMS平臺可以自動分離和濃縮具有目標(biāo)細(xì)菌的免疫磁珠，但仍具有局限性，如增菌時間較長，需要增菌3～8 h才能獲得較低的檢測限，檢測時間較長等[28]。另外，免疫磁珠的捕獲能力受到特異性免疫反應(yīng)抑制劑的影響。碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等食品成分通常會抑制抗體與靶分子的特異性結(jié)合[29]。相比之下，本研究基于金屬氫氧化物表面的羥基基團(tuán)可與微生物細(xì)胞表面配體結(jié)合的特性[30]，將納米氫氧化鈦和納米氫氧化鋯固定在濾紙片上對金黃色葡萄球菌進(jìn)行吸附富集，可以有效去除食品基質(zhì)中的PCR反應(yīng)抑制因子，無需在乳制品中進(jìn)行前增菌，僅需使用常規(guī)PCR儀即可快速靈敏地檢測大量的乳制品樣品。

本研究采用無需前增菌的PCR快速檢測方法在實際全脂乳粉、脫脂乳粉、奶酪和生牛乳樣品中金黃色葡萄球菌的檢測率分別為7%、5%、0%和13%。此外，國內(nèi)外有研究表明乳制品中金黃色葡萄球菌的污染率較高[31-32]，近年來由食用乳制品導(dǎo)致的疾病暴發(fā)頻率逐年升高，對人類公共健康造成了嚴(yán)重威脅，應(yīng)引起相關(guān)部門和消費者的重視。本研究PCR快速檢測方法可用于快速檢測乳制品中的金黃色葡萄球菌，能夠有效保障我國乳制品產(chǎn)業(yè)的安全發(fā)展及消費者健康。但本研究也存在一定的不足，如該方法無法區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞及受損細(xì)胞的DNA，也難以消除死菌殘留的DNA造成的假陽性結(jié)果。因此，未來可開發(fā)一種能夠有效區(qū)分樣品中活菌與死菌的快速檢測方法，從而進(jìn)一步降低食源性疾病暴發(fā)的風(fēng)險。此外，本研究僅將試劑儲存了12個月以驗證試劑的實用性，無法確定其具體的穩(wěn)定性范圍。未來將這種方法用于試驗時，需要關(guān)注試劑的保存溫度和保存時間。

4 結(jié)論

本研究基于新型的樣品處理建立的PCR快速檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和實用性良好等特點，能夠在4 h內(nèi)快速準(zhǔn)確地檢測乳制品中的金黃色葡萄球菌。該方法操作簡單，有望成為一種用于快速檢測食品樣品中目標(biāo)致病菌的可靠技術(shù)手段，為食品工業(yè)及監(jiān)管部門進(jìn)行乳制品中金黃色葡萄球菌的快速檢測提供了技術(shù)支持。