黎燕媚，聶影影，劉亞月，周龍建，宋 采，洪鵬志,4，張永平，胡雪瓊，張 翼,,4

羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性油脂成分的提取優(yōu)化

黎燕媚1，聶影影2,3，劉亞月1，周龍建1，宋 采1，洪鵬志1,4，張永平1，胡雪瓊1，張 翼1,2,3,4

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 / 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室 / 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心 / 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心 / 湛江市腦健康海洋藥物與營養(yǎng)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 海洋藥物研究所，廣東 湛江 524088 ；2. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院海洋醫(yī)藥研發(fā)中心，廣東 深圳 518120 ；3. 大連工業(yè)大學(xué)海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；4. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江市），廣東 湛江 524006）

【】建立藥食同源海藻羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）活性油脂成分的優(yōu)化提取工藝，探明其主要活性組分的具體化學(xué)成分。以提取物質(zhì)量濃度1 mg/mL下的乙酰膽堿酯酶抑制率× 提取物質(zhì)量為指標(biāo)，比較各個(gè)溶劑比、料液質(zhì)量體積比、超聲時(shí)間和提取次數(shù)等四個(gè)單因素水平下的抑制AChE活性成分提取效果，確定各個(gè)單因素中的最優(yōu)水平范圍，進(jìn)而設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件；按最優(yōu)提取工藝條件下提取制備粗浸膏，運(yùn)用硅膠柱色譜法、薄層層析等方法對粗浸膏進(jìn)行分離純化并追蹤其活性組分，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用GC-MS進(jìn)行成分分離與鑒定。羊棲菜抑制AChE活性成分的最優(yōu)提取條件為：溶劑乙酸乙酯、石油醚體積比為5∶5，料液質(zhì)量（g）體積（mL）比為1∶10，超聲時(shí)間30 min，提取次數(shù)3次。此條件下對應(yīng)的提取物質(zhì)量濃度1 mg/mL下乙酰膽堿酯酶抑制率（%） × 提取物質(zhì)量（g）的值為7.078 ± 1.038。從該粗提物中分離得到兩個(gè)具有抑制AChE活性的組分Fr2和Fr3，主要成分為花生四烯酸、亞油酸、油酸等脂肪酸，F(xiàn)r3還含有十四烷等多種烷烴。其抑制IC50值分別為2.69 mg/mL和5.31 mg/mL。本研究確定的基于石油醚-乙酸乙酯混合溶劑的超聲提取工藝可得到較高產(chǎn)量的羊棲菜抑制AChE活性成分，其主要成分為脂肪酸，可能在改善記憶方面具有一定應(yīng)用價(jià)值。

羊棲菜；正交實(shí)驗(yàn)；阿爾茨海默癥；抑制乙酰膽堿酯酶活性；脂肪酸

阿爾茨海默病（Alzheimer?s Disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征是神經(jīng)元的破壞性改變，包括神經(jīng)纖維纏結(jié)和淀粉樣斑塊，導(dǎo)致認(rèn)知障礙。發(fā)病機(jī)制包括膽堿能缺失假說、基因?qū)W說、氧化應(yīng)激與自由基損傷學(xué)說、炎性免疫學(xué)說、Aβ異常沉積、Tau蛋白異常磷酸化、神經(jīng)血管假說以及細(xì)胞周期假說等多種假說[1, 2]。其中膽堿能缺失學(xué)說是目前治療AD藥物研發(fā)的主要機(jī)制。膽堿能缺失假說認(rèn)為神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）的缺失在AD病理學(xué)中起關(guān)鍵作用，ACh是處理記憶和學(xué)習(xí)過程必不可少的一種神經(jīng)遞質(zhì)[3]。ACh存儲在神經(jīng)元的突觸囊泡中，當(dāng)突觸囊泡發(fā)生胞外作用時(shí)，ACh被釋放到突觸間隙并與ACh受體結(jié)合產(chǎn)生信號傳導(dǎo)作用[4]，乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）可將ACh分解為膽堿和醋酸鹽從而終止神經(jīng)傳導(dǎo)信號的發(fā)生[5]。

羊棲菜（，也稱），別名鹿角尖、海菜芽、羊奶子、海大麥等，屬褐藻類馬尾藻科，食用和藥用價(jià)值越來越受到重視[6]。目前對羊棲菜的功能活性成分的研究主要集中在抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、治療心血管疾病和提高免疫力方面[9]。研究表明，羊棲菜中多種提取成分與治療AD也具有密切關(guān)系。羊棲菜多糖可能通過調(diào)控和基因的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡從而可以干預(yù)AD的發(fā)生[10]；羊棲菜多酚通過增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力，減少氧化產(chǎn)物的堆積以降低腦組織的損傷來預(yù)防AD的發(fā)生[11]；羊棲菜中甾醇24(S)-Saringosterol的抗炎作用可能有助于預(yù)防認(rèn)知能力下降[12]。可見羊棲菜在開發(fā)改善記憶、防治阿爾茨海默癥的功能食品或藥物方面也具有較好應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)室前期從產(chǎn)自浙江洞頭的食用海藻羊棲菜中發(fā)現(xiàn)了一種功能性油脂HFFO（functional oil），其具有較強(qiáng)的抑制AChE活性，且主要的活性化合物為花生四烯酸和11,14,17-二十碳三烯酸[13]。但前期研究采用的溶劑系統(tǒng)（氯仿-甲醇）對功能食品的溶劑使用許可及實(shí)際生產(chǎn)中可能會造成的殘留等問題考慮不足，且提取工藝也未經(jīng)優(yōu)化?；诖?，本研究考慮到今后可能的功能食品用途，采用沒有足夠毒性資料的第四類溶劑[14]石油醚和對人類風(fēng)險(xiǎn)較低的第三類溶劑[15]乙酸乙酯作為溶劑體系，通過考察溶劑比、料液質(zhì)量體積比、超聲提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素對羊棲菜中HFFO提取效果的影響，優(yōu)化HFFO粗品提取的工藝條件，對在此條件下進(jìn)一步純化分離得到的HFFO進(jìn)行抑制AChE活性評價(jià)和具體成分的分析，旨在為大規(guī)模制備HFFO成分用于深入的動物模型功效研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊棲菜，2020年08月購自浙江省溫州市洞頭金海水產(chǎn)，為養(yǎng)殖產(chǎn)品；HFFO（作為本研究提取物的抑制AChE活性的對照，實(shí)驗(yàn)室原保存），采用氯仿甲醇混合溶液提取，經(jīng)過柱層析分離純化，詳細(xì)制備方法見文獻(xiàn)[13]；石油醚（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20200620）；乙酸乙酯（分析純，廣東光華科技股份有限公司，批號20200516）；正己烷（分析純，廣東光華科技股份有限公司，批號20200509）；溴甲酚綠（天津市北辰方正試劑廠）；乙酰膽堿酯酶（AChE）（Sigma-Aldrich公司，批號C3389）；碘化硫代乙酰膽堿（ATCI）（Sigma-Aldrich公司，批號A0048）；5,5-二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）（Sigma-Aldrich公司，批號D8130）；牛血清白蛋白（BSA）（上海源葉生物科技有限公司，批號L27M11S113313）；GF254硅膠高效薄層層析板，購自德國默克公司；酶標(biāo)板（NEST?品牌96孔平孔板-300 μL，無錫耐思生命科技股份有限公司）。

1.2 儀器

400Y型粉碎機(jī)（鉑歐五金制品有限公司）；KH-300ZDE型超聲波清洗機(jī)（昆山禾創(chuàng)有限公司）；SB-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；WFH-201B型多功能紫外透射儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；HPX-9082MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；Biotek Epoch2型酶標(biāo)儀（美國博騰有限公司）；GCMS-QP2010 Ultra型氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）。

2 方法

2.1 樣品預(yù)處理

將羊棲菜除去雜質(zhì)后，置于烘箱內(nèi)40 ℃干燥1 h，放入粉碎機(jī)中粉碎（粉末粒度約1 mm），4 ℃下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 羊棲菜中抑制乙酰膽堿酯酶活性樣品成分的提取工藝條件

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 稱取羊棲菜粉末每份25 g于500 mL錐形瓶中，加入一定比例的乙酸乙酯和石油醚混合溶液后靜置常溫浸泡12 h后，固定超聲功率360 W。考慮到樣品活性強(qiáng)度和得率均為重要目標(biāo)，故以1 mg/mL劑量下的AChE抑制率×提取物質(zhì)量為指標(biāo)，分別考察提取溶劑比（石油醚、乙酸乙酯體積比10∶0，石油醚、乙酸乙酯體積比8∶2，石油醚、乙酸乙酯體積比5∶5，石油醚、乙酸乙酯體積比3∶7，石油醚、乙酸乙酯體積比0∶10），料液質(zhì)量（g）體積（mL）比（1∶8、1∶10、1∶12、1∶16），超聲時(shí)間（0、10、20、30、40 min），提取次數(shù)（1、2、3、4）對羊棲菜中抑制AChE活性油脂成分的提取效果的影響。每個(gè)考察因素均設(shè)4 ～ 5個(gè)水平，3個(gè)平行。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 通過單因素實(shí)驗(yàn)確定溶劑比、料液質(zhì)量體積比、超聲時(shí)間、提取次數(shù)各因素的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)范圍，因素水平表見表1。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用四因素三水平L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。由于考慮到正交表L9（34）各列均被因素排滿，表中未留下空列，也無歷史資料提供經(jīng)驗(yàn)誤差，為了避免增加試驗(yàn)次數(shù)，不使用更大的正交表，故參照文獻(xiàn)[16]設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)，估算實(shí)驗(yàn)誤差，以進(jìn)行方差分析。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，以1 mg/mL劑量下的AChE抑制率（%）×提取物質(zhì)量（g）為指標(biāo)，確定羊棲菜中抑制AChE活性油脂成分的最佳提取條件。按最佳提取條件進(jìn)行提取，評定提取效果。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2.2.3 羊棲菜粗浸膏得率的測定方法 稱取25 g羊棲菜粉末于500 mL錐形瓶中，按照一定的條件進(jìn)行提取，提取結(jié)束后進(jìn)行常壓過濾，將濾液在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行濃縮后，得羊棲菜粗浸膏。然后根據(jù)以下公式計(jì)算羊棲菜粗浸膏的質(zhì)量。

羊棲菜粗浸膏的質(zhì)量 =2–1，

式中，2為濃縮樣品后瓶子的總質(zhì)量，1為空旋蒸瓶質(zhì)量。

2.2.4 羊棲菜粗浸膏薄層層析及生物自顯影分析 參照文獻(xiàn)[17]，略有改動。對各因素水平下獲得的羊棲菜粗浸膏以石油醚、乙酸乙酯體積比4∶1為展開劑進(jìn)行薄層層析（Thin Layer Chromatography，TLC）展開，記錄254 nm紫外圖像、365 nm熒光圖像、乙酰膽堿酯酶抑制活性自顯影圖像和溴甲酚綠顯色圖像。溴甲酚綠顯色實(shí)驗(yàn)步驟：0.1 g溴甲酚綠溶于500 mL乙醇中，緩慢加入0.1 mol/L NaOH溶液，至剛好出現(xiàn)藍(lán)色沉淀。用配制好的溴甲酚綠顯色劑均勻噴在GF254板子上，脂肪酸類物質(zhì)會在藍(lán)色背景產(chǎn)生黃色斑點(diǎn)，然后拍照記錄即時(shí)圖像。

2.2.5 羊棲菜粗浸膏中抑制AChE活性的測定 參照文獻(xiàn)[17]，略有改動。每孔的反應(yīng)體系均為100 μL，先將各因素水平下獲得的羊棲菜粗浸膏樣品用DMSO配制成100 mg/mL溶液，設(shè)置四個(gè)組，樣品組（A1）：加入配好的待測樣品1 μL + 49 μL 磷酸鹽緩沖液PBS（100 mmol/L）+ 10 μL AChE溶液（0.2 U/mL）+ 20 μL DTNB（5 mmol/L），將板子置于控溫培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育10 min，然后加入20 μL底物ATCI（10 mmol/L），再放入37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫孵育20 min ；樣品對照組（A2）將AChE溶液換成BSA（1 mg/mL），其它操作同樣品組；空白組（A3）：不加入樣品，其它同樣品組；空白對照組（A4）：不加入樣品，其它同樣品對照組。全部孵育完成，將96孔板置于酶標(biāo)儀，測定其在405 nm波長下的光密度值，根據(jù)公式計(jì)算AChE抑制率（%）：

AChE抑制率 = [（A3A4）-（A1A2）]/（A3A4），

式中，A1為樣品組溶液的光密度；A2為樣品對照組溶液的光密度；A3為空白組溶液的光密度；A4為空白對照組溶液的光密度。

2.3 羊棲菜粗浸膏中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的分離純化

2.3.1 常壓正相硅膠柱（硅膠粒徑為0.048 mm ～ 0.075 mm）分離活性組分 稱取200 g羊棲菜粉末按照2.2.2節(jié)的步驟得到的最佳提取條件進(jìn)行提取得到粗浸膏。運(yùn)用硅膠柱色譜方法，將粗浸膏進(jìn)行初步分離純化以除去色素。分離純化步驟如下：依次用石油醚、98%（體積分?jǐn)?shù)，本節(jié)同）石油醚、95%石油醚、90%石油醚、85%石油醚、80%石油醚、70%石油醚、100 %乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，得到8個(gè)組分Fr1 ～ Fr8。采用2.2.4節(jié)方法確定活性組分。

2.3.2 活性組分抑制乙酰膽堿酯酶活性IC50的測定 活性組分溶解于DMSO中并配成系列濃度（1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3、0.015 6 mg/mL），測定步驟同2.2.5節(jié)，在酶標(biāo)板中分別測定活性組分系列濃度的AChE抑制率，鹽酸多奈哌齊作為陽性對照。IC50值是化合物對AChE抑制率為50%所對應(yīng)的濃度。以抑制率為縱坐標(biāo)和濃度對數(shù)（ln）為橫坐標(biāo)導(dǎo)入Origin 8.0軟件。通過3次多項(xiàng)式回歸方程擬合得到濃度對數(shù)曲線，并計(jì)算得到ln（IC50）和IC50。

2.4 羊棲菜粗浸膏中抑制乙酰膽堿酯酶活性組分的氣質(zhì)聯(lián)用分析

2.4.1 樣品前處理（甲酯化） 根據(jù)活性結(jié)果，分別稱取抑制AChE抑活性最強(qiáng)的組分Fr2和組分Fr3各40 mg，用1 mL的正己烷溶解，加入1 mL 0.4 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液，充分振蕩，置于70 ℃水浴中超聲1 h。靜置后，取出上層清液，加入飽和食鹽水至9 mL，于5 000 r/min條件下離心10 min。靜置后，樣品分3層（上層為甲酯化產(chǎn)物，中層為未甲酯產(chǎn)物，下層為水層），取出上層溶液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮干燥后稱其質(zhì)量，用正己烷配成1 mg/mL溶液，過孔徑0.22 μm有機(jī)濾膜，備用。

2.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用GC-MS條件 柱溫箱80 ℃，進(jìn)樣口溫度280 ℃，分流比為5，載氣為He，升溫程序如下：0 ～ 2 min，80 ℃；2 ～ 6 min，80 ～ 120 ℃；6 ～ 11 min，120 ℃；11 ～ 16 min，120 ～ 180 ℃；16 ～ 22 min，180 ℃；22 ～ 32 min，180 ～ 280 ℃；32 ～ 60 min，280 ℃。離子源溫度為250 ℃，接口溫度為280 ℃，質(zhì)荷比m/z范圍為50 ～ 500。通過與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜圖庫和中國科學(xué)院南海海洋研究所的GC-MS 系統(tǒng)譜圖庫比對來確定化合物的成分。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

本研究中所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析均用Graphpad Prism 8.0作圖，采用One-way ANOVA和Dunnett′s post hoc檢驗(yàn)評價(jià)每個(gè)因素中不同水平之間的差異。正交試驗(yàn)的方差分析用軟件SPSS 25進(jìn)行分析處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同提取條件羊棲菜粗浸膏中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分比較

如圖1(A3～D3)所示，著色背景上的空白斑點(diǎn)為抑制AChE活性成分所在，結(jié)果表明各單因素的不同水平下羊棲菜粗浸膏抑制AChE活性均較強(qiáng)，活性組分均分布在f（活性組分的遷移距離與展開劑的遷移距離之比）為0.5左右，相應(yīng)活性位置的溴甲酚綠顯色均為黃色（圖1(A4-D4)），可初步判定此位置上的活性物質(zhì)為具有抑制AChE活性的脂肪酸類物質(zhì)，可見不同提取條件對活性產(chǎn)物的成分種類可能影響不大，但從抑制斑點(diǎn)面積看主要影響其產(chǎn)率，故進(jìn)一步通過定量評價(jià)提取效果的單因素分析和正交試驗(yàn)。

A1 ～ D1: 254 nm紫外圖像；A2 ～ D2: 365 nm熒光圖像；A3 ～ D3: 抑制AChE活性自顯影；A4 ～ D4: 溴甲酚綠顯色。

3.2 不同條件對羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性成分提取的影響（單因素實(shí)驗(yàn)）

3.2.1 溶劑比對羊棲菜抑制AChE活性成分提取的影響 結(jié)果如圖2所示，隨著乙酸乙酯比例的增大，1 mg/mL 劑量下AChE抑制率×粗浸膏質(zhì)量的值隨之增大，當(dāng)溶劑石油醚、乙酸乙酯體積比為0∶10時(shí)達(dá)到最大的值。因此選取溶劑石油醚、乙酸乙酯體積比為5∶5、3∶7、0∶10為正交實(shí)驗(yàn)的水平范圍值。

料液質(zhì)量（g）體積（mL）比為1∶10，超聲時(shí)間20 min，提取1次。與溶劑體積比10∶0 比較，*表示P ＜ 0.05，**表示P ＜0.01，***表示P ＜ 0.001。

3.2.2 料液質(zhì)量體積比對羊棲菜抑制AChE活性成分的影響 結(jié)果如圖3所示，當(dāng)料液質(zhì)量（g）體積（mL）比為1∶10時(shí)，1 mg/mL劑量下AChE 抑制率×粗浸膏質(zhì)量的值達(dá)到最大。因此，選取料液質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶8、1∶10、1∶12為正交實(shí)驗(yàn)的水平范圍值。

3.2.3 超聲時(shí)間對羊棲菜抑制AChE活性成分提取的影響 結(jié)果如圖4所示，隨著超聲時(shí)間的增加，1 mg/mL 劑量下AChE抑制率×粗浸膏質(zhì)量的值隨之增大，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，達(dá)到最大值。因此，選取超聲時(shí)間20、30、40 min作為正交實(shí)驗(yàn)的水平范圍值。

3.2.4 提取次數(shù)對羊棲菜抑制AChE活性成分提取的影響 結(jié)果如圖5所示，隨著提取次數(shù)的增加，1 mg/mL 劑量下AChE 抑制率×粗浸膏質(zhì)量的值隨之增大。當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí)，達(dá)到最大值。因此，選取提取次數(shù)2、3、4次作為正交實(shí)驗(yàn)的水平范圍值。

溶劑體積比為5∶5，超聲時(shí)間20 min，提取1次。與料液質(zhì)量比1∶12 比較，**表示P ＜ 0.01。

溶劑體積比為5∶5，料液質(zhì)量體積比為1∶10，提取1次。與超聲時(shí)間0 min比較，*表示P ＜ 0.05。

3.3 不同條件對羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性成分提取的影響（正交實(shí)驗(yàn)）

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2、3。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果值可知，以1 mg/mL 劑量下AChE抑制率×粗浸膏質(zhì)量的值為指標(biāo)考察羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的最佳提取條件為1222，即溶劑石油醚、乙酸乙酯體積比為5∶5，料液質(zhì)量（g）體積（mL）比為1∶10，超聲時(shí)間為30 min，提取次數(shù)3次。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果值和方差分析結(jié)果可知，四個(gè)因素對結(jié)果的影響順序依次為：溶劑比（）＞超聲時(shí)間（）＞提取次數(shù)（）＞料液比（）。

按照確定的最佳提取工藝1222，即溶劑石油醚、乙酸乙酯體積比為5∶5，料液質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶10，超聲時(shí)間30 min，提取次數(shù)3次，此提取條件下羊棲菜粗浸膏質(zhì)量為（0.240±0.014）g，1 mg/mL粗浸膏的AChE抑制率為（25.251±1.157）%，1 mg/mL粗浸膏的AChE抑制率×粗浸膏質(zhì)量的值為6.061±0.414，指標(biāo)值高于正交實(shí)驗(yàn)中其他試驗(yàn)號，說明該工藝可靠、穩(wěn)定。

溶劑體積比為5∶5，料液質(zhì)量體積比為1∶10，超聲時(shí)間20 min。

表2 羊棲菜中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 羊棲菜中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分提取工藝正交實(shí)驗(yàn)方差分析

注Note: ***表示差異極顯著highly significant difference（< 0.001）。

3.4 羊棲菜粗浸膏中抑制乙酰膽堿酯酶活性組分分離純化

由圖6(C、D)可知，羊棲菜抑制AChE活性成分可能存在于 Fr2 ～ Fr4組分中，但是組分Fr4已經(jīng)有比較重的色素成分（圖6(B)），為避免色澤對后續(xù)保健功能食品開發(fā)的影響，暫不對Fr4組分進(jìn)行下一步的研究。由表4可知，組分Fr2的抑制AChE的IC50值為2.69 mg/mL，組分Fr3的抑制AChE的IC50值為5.31 mg/mL，兩者均有一定的AChE抑制活性，因此后續(xù)的分析主要集中在組分Fr2和Fr3中。

A：254nm紫外圖像；B：365nm熒光圖像；C：乙酰膽堿酯酶抑制活性自顯影；D：溴甲酚綠顯色

表4 各組分的抑制AChE活性

3.5 羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性組分分析

3.5.1 亞組分Fr2的氣質(zhì)聯(lián)用分析 經(jīng)過活性引導(dǎo)分離得到一個(gè)具有一定抑制AChE活性的亞組分Fr2，對其進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果見表5。其不飽和脂肪酸占比為64.54%，其成分主要有亞油酸（23.08%）、油酸（31.73%）、花生四烯酸（7.04%）、二十碳五烯酸（2.69%）。飽和脂肪酸中，棕櫚酸成分最大，占比17.37%。

表5 GC-MS分析揭示經(jīng)過甲酯化處理的Fr2主要成分

3.5.2 亞組分Fr3的氣質(zhì)聯(lián)用分析 活性亞組分Fr3的主要成分中，不飽和脂肪酸占比為8.92%，其中花生四烯酸占主要成分，占比5.25%。其余組分為烷烴類（30.49%）、2,4-（1,1-二甲基乙基）-苯酚（3.42%）、1-丁基-2-（8-甲基壬基）-鄰苯二甲酸酯（2.18%）、6,6?-雙（2-叔丁基-3-甲基苯酚）甲烷（3.16%）等（表6）。

表6 GC-MS分析揭示經(jīng)過甲酯化處理的Fr3組分主要成分

4 討論與結(jié)論

本研究表明，羊棲菜抑制AChE活性油脂成分的最優(yōu)提取條件：溶劑石油醚、乙酸乙酯體積比為5∶5，料液質(zhì)量（g）體積（mL）比為1∶10，超聲時(shí)間為30 min，提取次數(shù)3次。周佩佩等[18]研究表明，超聲結(jié)合溶劑浸提法能夠更好提取海藻中的總脂成分。常用的溶劑有石油醚、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等兩種或多種溶劑的組合等，本實(shí)驗(yàn)考慮到后續(xù)功能食品等方面的應(yīng)用，未采用本實(shí)驗(yàn)前期HFFO提取方法中的氯仿、甲醇等溶劑，而改用了相對安全的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑[14,15]。在基于石油醚-乙酸乙酯的溶劑提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析中，隨著乙酸乙酯用量的增加，1 mg/mL下的乙酰膽堿酯酶抑制率×提取物質(zhì)量值隨之增加，這可能是因?yàn)橐宜嵋阴ケ仁兔迅幽苋芙庋驐酥械挠椭煞帧埿阊械萚19]研究表明，乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，油脂產(chǎn)率比石油醚的高。本研究中，當(dāng)料液質(zhì)量（g）體積（mL）比在1∶10時(shí)，1 mg/mL下的乙酰膽堿酯酶抑制率×提取物質(zhì)量值達(dá)到最大值，隨著料液比的增大，其值反而下降。通常適當(dāng)?shù)牧弦罕瓤墒乖辖莞映浞?，達(dá)到更好的分離效果，當(dāng)溶劑量達(dá)到一定程度后，物料與溶劑之間會趨于平衡[20]。夏夢露等[21]在對影響銅藻（）多不飽和脂肪酸的提取因素的研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)牧弦罕瓤稍黾鱼~藻中多不飽和脂肪酸的提取量，而料液比過大，銅藻中多不飽和脂肪酸的提取量反而減少。而且，在保證能達(dá)到足夠得率后，采用更高的料液比也會造成實(shí)際生產(chǎn)中成本的增加，故本研究中最終采用1∶10的料液比。在本研究中，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，1 mg/mL下的乙酰膽堿酯酶抑制率×提取物質(zhì)量值達(dá)到最大值，之后隨著超聲時(shí)間的增加，其值反而下降，出現(xiàn)下降的原因可能是由于油脂中存在一些揮發(fā)性成分[22]，在提取時(shí)間過長，超聲熱效應(yīng)過大，溫度過高時(shí)，揮發(fā)性成分會損失，導(dǎo)致油脂提取率下降。且超聲過長不僅增加成本，還可能會使油脂的成分受到影響。超聲的空泡效應(yīng)可能導(dǎo)致羥基自由基的產(chǎn)生，過強(qiáng)的超聲處理會導(dǎo)致多酚等易氧化植物活性成分的破壞[23]。在脂質(zhì)提取中也有類似現(xiàn)象報(bào)道，Hadiyanto等[24]在研究超聲輔助滲透壓沖擊法提取鈍頂螺旋藻中脂質(zhì)組分中發(fā)現(xiàn)，隨著超聲時(shí)間的延長，脂質(zhì)提取率增大，當(dāng)超聲時(shí)間35 min時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著超聲時(shí)間延長，脂質(zhì)提取率下降。夏夢露等[21]也發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)某曁崛r(shí)間可提高銅藻中多不飽和脂肪酸的提取率，而超聲時(shí)間過長反而導(dǎo)致多不飽和脂肪酸提取率的下降。

本研究分離得到亞組分Fr2和Fr3的成分主要包括棕櫚酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸等，前期實(shí)驗(yàn)室分離得到的HFFO樣品主要含有花生四烯酸、11,14,17-二十碳三烯酸、棕櫚酸和植物醇等[13]。兩者在成分上有一定的差異，出現(xiàn)這種差異的原因可能有：1）很多研究表明[25-27]，海藻中的脂肪酸種類和含量會隨著生長地域、環(huán)境、季節(jié)等變化而呈現(xiàn)顯著差異。2）考慮到實(shí)驗(yàn)室前期研究所用的溶劑體系與本研究不同，這也可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室HFFO樣品成分與亞組分Fr2和Fr3在成分上有較大的差異。前期實(shí)驗(yàn)室分離得到的HFFO抑制AChE的IC50值為1.09 mg/mL，且生物活性追蹤證實(shí)AChE抑制活性主要來自花生四烯酸和11,14,17-二十碳三烯酸。亞組分Fr2和Fr3的AChE抑制IC50值分別為2.69 mg/mL、5.31mg/mL，F(xiàn)r3的AChE抑制IC50值擬合方程2距離1有較大偏離，可能是因?yàn)镕r3的AChE抑制活性比較弱，測量誤差較大導(dǎo)致的。亞組分Fr2和Fr3主要的活性來源也可能是花生四烯酸。另外Fr2組分中油酸、亞油酸也為主要的成分，它們不僅是構(gòu)成人體組織的重要組成成分，還具有預(yù)防心血管疾病的作用，也曾被報(bào)道過具有溫和的抑制AChE活性，其抑制AChE的IC50值分別為12.01 μg/mL和18.17 μg/mL[28]。

相對于前人關(guān)于羊棲菜的多糖、多酚、甾醇等抗AD成分研究開發(fā)[10-12]，本研究更注重其不飽和脂肪酸的利用，且本研究在安全提取溶劑方面進(jìn)行了有益探索。季節(jié)對活性成分化學(xué)組成差異的影響有待進(jìn)一步研究，其確切體內(nèi)功效還有待深入的動物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究建立了一種藥食同源海藻羊棲菜中抑制AChE活性組分HFFO的優(yōu)化提取與純化制備工藝，驗(yàn)證了優(yōu)化工藝下提取產(chǎn)物的抑制AChE活性，發(fā)現(xiàn)基于石油醚-乙酸乙酯超聲提取羊棲菜中抑制AChE活性組分HFFO的最優(yōu)提取條件為溶劑乙酸乙酯、石油醚體積比5∶5，料液質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶10，超聲時(shí)間30 min，提取次數(shù)3次，將此提取條件下提取得到的羊棲菜粗浸膏結(jié)合柱層析法分離純化制備得到了兩個(gè)活性油脂組分Fr2和Fr3，其抑制AChE的IC50值分別為2.69 mg/mL和5.31 mg/mL，并通過GC-MS揭示了Fr2和Fr3活性組分主要富含花生四烯酸、油酸、亞油酸等成分，在制備輔助改善記憶的功能食品方面可能具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

[1] 余茂強(qiáng), 吳紹長, 楊華. 阿爾茨海默病的病機(jī)相關(guān)性研究概況[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生, 2020, 58(17): 183-187.

[2] AZIZI G, MIRSHAFIEY A. The potential role of proinflammatory and antiinflammatory cytokines in Alzheimer disease pathogenesis[J]. Immunopharmacology and Immunotoxicology, 2012, 34(6): 881-895.

[3] FRANCIS P T. The interplay of neurotransmitters in Alzheimer's disease[J]. CNS Spectrums, 2005, 10(11 Suppl 18): 6-9.

[4] RUFF R L. Neurophysiology of the neuromuscular junction: overview[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2003, 998(1): 1-10.

[5] NEKOEINIA M, YOUSEFINEJAD S. QSAR analysis of the acetylcholinesterase inhibitory activity of some tertiary amine derivatives of cinnamic acid[J]. Structural Chemistry, 2021, 32(3): 1123-1132.

[6] 李時(shí)珍. 本草綱目[M]. 北京: 燕山出版社, 2007: 1718-1721.

[7] 丁浩淼, 洪嘉瑤, 陳雪佳, 等. 羊棲菜多糖抗腫瘤及其作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué), 2020, 44(3): 129-137.

[8] 何丹, 張旭, 肖保衡, 等. 羊棲菜多糖的提取和抗氧化活性研究[J]. 海洋科學(xué), 2016, 40(12): 24-29.

[9] 阮積惠. 羊棲菜的藥用功能研究現(xiàn)狀[J]. 中國野生植物資源, 2001, 20(6): 8-10.

[10] 湯從容, 曹高忠, 葉曉蘭. 羊棲菜多糖對老年癡呆模型大鼠和基因表達(dá)的分析[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2012, 30(8): 1832-1834.

[11] 曠明麗, 張駿. 羊棲菜褐藻多酚對D-半乳糖致小鼠老年癡呆模型的干預(yù)作用[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2014, 35(13): 1984-1986.

[12] MARTENS N, SCHEPERS M, ZHAN N, et al. 24(S)-saringosterol prevents cognitive decline in a mouse model for Alzheimer's disease[J]. Marine Drugs, 2021, 19(4): 190.

[13] YANG W C, ZHANG Y Y, LI Y J, et al. Chemical composition and anti-Alzheimer's disease-related activities of a functional oil from the edible seaweed[J]. Chemistry & Biodiversity, 2020, 17(8): e2000055.

[14] 李平, 遲穎紅, 陳東英. 藥物中石油醚殘留量的氣相色譜檢測方法學(xué)探討[J]. 藥物分析雜志, 2008, 28(3): 427-430.

[15] LEE J M, MICHAEL Z, THAO T, et al. Headspace gas chromatography-flame ionization detector method for organic solvent residue analysis in dietary supplements[J]. Journal of AOAC International, 2006, 89(6): 1475-1482.

[16] 湯明輝, 寇俊萍, 朱丹妮. 正交設(shè)計(jì)-重復(fù)試驗(yàn)法優(yōu)選當(dāng)歸芍藥散的提取工藝[J]. 中國中藥雜志, 2000, 25(11): 668.

[17] 張翼, 鮑海燕, 聶影影, 等. 海洋真菌抗老年癡呆相關(guān)活性成分的篩選與追蹤研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2016, 32(11): 63-71.

[18] 周佩佩. 海藻中脂肪酸的提取和分析方法研究[D]. 溫州: 溫州大學(xué), 2016.

[19] 張秀妍. 海鞘油脂提取工藝及其氧化穩(wěn)定性的研究[D]. 大連: 大連理工大學(xué), 2004.

[20] SICAIRE A G, VIAN M A, FINE F, et al. Ultrasound induced green solvent extraction of oil from oleaginous seeds[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2016, 31:319-329.

[21] 夏夢露. 銅藻中多不飽和脂肪酸的提取和純化方法研究[D]. 杭州: 浙江工商大學(xué), 2020.

[22] 張敏. 五種經(jīng)濟(jì)海藻代謝成分及代謝機(jī)制的初步研究[D]. 蘇州: 蘇州大學(xué), 2011.

[23] 姬長舟, 任建武. 超聲空化效應(yīng)及其對植物活性成分抗氧化性的影響[J]. 綠色科技, 2017(4): 148-151.

[24] HADIYANTO H, ADETYA N P. Response surface optimization of lipid and protein extractions fromusing ultrasound assisted osmotic shock method[J]. Food Science and Biotechnology, 2018, 27(5): 1361-1368.

[25] DA COSTA E, DOMINGUES P, MELO T, et al. Lipidomic signatures reveal seasonal shifts on the relative abundance of high-valued lipids from the brown algae[J]. Marine Drugs, 2019, 17(6): 335.

[26] MOREIRA A S P, DA COSTA E, MELO T, et al. Seasonal plasticity of the polar lipidome ofcultivated in a sustainable integrated multi-trophic aquaculture[J]. Algal Research, 2020, 49: 101958.

[27] MOHY EL-DIN S M. Temporal variation in chemical composition ofand[J]. International Journal of Environmental Science and Technology, 2019, 16(10): 5783-5796.

[28] 吳青. 酸棗仁中乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選研究[D]. 長沙: 湖南師范大學(xué), 2013.

Extraction Optimization of Acetylcholinesterase Inhibitory Active Oils from

LI Yan-mei1, NIE Ying-ying2,3, LIU Ya-yue1, ZHOU Long-jian1, SONG Cai1, HONG Peng-zhi1,4, ZHANG Yong-ping1, HU Xue-qiong1, ZHANG Yi1,2,3,4

（1.,,,,,,,,,,524088,; 2.,,518120,; 3.,,116034,; 4.(),524006,）

【】To establish an optimized extraction process for acetylcholinesterase (AChE) inhibitory components fromand to analyze and identify the chemical constituents. 【】Taking the product of inhibition rate to AChE at the dose of 1 mg/mL and extract mass (PIREM) as indicator, the optimal level range of each single factor was determined by comparing the extraction effects under different ratios of solvents, ratios of solid to liquid, ultrasonic times, and extraction times. Then, the extraction process was optimized by orthogonal experiment design. Under the optimal extraction condition,was extracted to obtain the crude extract, which was separated and purified to trace the active components by silica gel column chromatography and thin layer chromatography. Finally, the constituents of the product was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. 【】The results showed that the optimal extraction condition was, volume ratio of ethyl acetate topetroleum ether is 5∶5 as solvent, solid-liquid ratio = 1∶10 (g/mL), ultrasonical extraction for 30 min and three times. The PIREM value was 7.078 ± 1.038 for the crude extract obtained under this condition. From this extract, two main active components Fr2 and Fr3 were prepared with inhibitory IC50values of 2.69 mg/mL and 5.31 mg/mL, respectively. Their main constituents were revealed to be fatty acids like arachidonic acid, linoleic acid, oleic acid and also rich alkanes like tetradecane in Fr3. 【】By the supersonic extraction process based on mixed solvent of petroleum ether and ethyl acetate in this study, high yield of AChE inhibitory components can be prepared from. This product mainly contains fatty acids and may be applicable for improving memory.

; orthogonal experiment; Alzheimer's disease; acetycholinesterase inhibition; fatty acid

黎燕媚，聶影影，劉亞月，等. 羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性油脂成分的提取優(yōu)化[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，42（3）：97-106.

Q547

A

1673-9159（2022）03-0097-10

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.03.013

2021-12-30

廣東省科技專項(xiàng)資金-基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究專題（2021A05240）；廣東省普通高校重點(diǎn)領(lǐng)域?qū)ｍ?xiàng)（生物醫(yī)藥與健康）（2021ZDZX2064）；深圳市大鵬新區(qū)科技研發(fā)項(xiàng)目（KJYF202001-07）；深圳市科創(chuàng)委基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（JCYJ20190813105005619）；深圳市大鵬新區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展資金（KY20180203）；國家自然科學(xué)基金（21807015）；廣東省揚(yáng)帆計(jì)劃引進(jìn)緊缺拔尖人才項(xiàng)目（201433009）；湛江市海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展示范市建設(shè)項(xiàng)目（湛海創(chuàng)XM-202008-01B1）；廣東省高等學(xué)校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2021KCXTD021）。

黎燕媚（1994―）女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ筇烊划a(chǎn)物。E-mail：guangdongliyanmei@163.com

張翼（1978―），男，博士，教授，研究方向?yàn)楹Ｑ筇烊划a(chǎn)物。E-mail：hubeizhangyi@163.com

（責(zé)任編輯：劉朏）