楊子怡，曹驥，唐艷萍，黃瑜，李學(xué)宇，容敏華

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部，廣西 南寧 530021

肝癌作為臨床常見的惡性腫瘤之一嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計，肝癌發(fā)病率在全球惡性腫瘤中位居第五位，在男性中死亡率位居第二位[1]。我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)之一，且臨床的發(fā)病率和死亡率有逐年上升的趨勢。近年來，我國在肝癌的診療方面取得了長足的進(jìn)步，但肝癌患者5 年生存率仍未令人滿意。肝癌的發(fā)生、發(fā)展是一個長期的多因素、多階段參與的過程，因此，尋找肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子，對提高肝癌的療效具有重要的現(xiàn)實意義和理論價值。

三磷酸腺苷(ATP)依賴的染色體重塑復(fù)合物在染色體重塑過程中發(fā)揮著重要作用，可利用ATP水解產(chǎn)生的能量重構(gòu)核小體從而調(diào)控染色質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)[2]。其中，SWI/SNF 復(fù)合物屬于ATP 依賴的染色體重塑復(fù)合物五大亞家族的成員。研究表明，哺乳動物SWI/SNF復(fù)合物參與基因表達(dá)的調(diào)控過程，發(fā)揮抑制或激活作用[3-4]，當(dāng)SWI/SNF復(fù)合物亞單位發(fā)生異常時，SWI/SNF 復(fù)合物功能受到影響，可能就導(dǎo)致腫瘤的形成。SMARCA4(又叫ΒRG1)作為SWI/SNF 復(fù)合物的核心關(guān)鍵基團(tuán)，可催化ATP水解和為整個SWI/SNF復(fù)合物提供能量。由此可見SMARCA4在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起到重要作用，然而SMARCA4 與肝癌相關(guān)的研究報道甚少。

因此，本實驗研究SMARCA4 基因和蛋白在肝癌中的表達(dá)情況，并結(jié)合病理特征分析其臨床意義，為肝癌的診斷及治療提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1～12月期間于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科住院手術(shù)的原發(fā)性肝細(xì)胞型肝癌患者40例，其中男性35例，女性5例；年齡31～76歲，平均(51.5±12.8)歲；按照2018年歐洲肝病協(xié)會最新版本指南制定的巴塞羅那(ΒCLC)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，A 期19 例，Β 期6 例，C 期11 例，D 期4 例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；病理分級：Ⅰ～Ⅱ級20 例，Ⅲ～Ⅳ級20 例。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者在參與研究前均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本 收集肝癌患者術(shù)后新鮮肝癌組織及癌旁組織，經(jīng)液氮速凍后并于15 min 內(nèi)放于-80℃冰箱中保存待檢。

1.2.2 主要試劑 TRIzol(Servicebio 公司，貨號：G3.13)；FastStart Universal SYΒR Green Master (Rox)(Servicebio 公司，貨號：G3008)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo 公司，貨號：#K1622)；兔抗 人SMARCA4 抗 體(Cell Signaling Technology，貨號：72026)；兔抗人β-Actin 抗體(Cell Signaling Technology，貨號：4970)；二抗羊抗兔抗體(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：A0277)；引物由生工生物工程股份有限公司(上海)合成。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測SMARCA4 mRNA的表達(dá) 取100 mg組織進(jìn)行勻漿，利用TRIzol提取組織總RNA，將其逆轉(zhuǎn)成cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴增。引物序列如下，SMARCA4：上游5'-TGCGAACCAAAGCGACCAT-3'，下游5'-GCCTTAGCAT TGAGGGCTGTCT-3'。GAPDH：上游5'-GGAAGCT TGTCATCAATGGAAATC-3'，下游5'-T GATGACCC TTTTGGCTCCC-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s 循環(huán)40 次；72℃延伸8 min。所得結(jié)果采用2-△△Ct法計算樣本中SMARCA4 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot 檢 測SMARCA4 蛋 白 的 表達(dá) 將組織勻漿后用含1%PMSF的RIPA裂緩沖液裂解并離心(4℃，12 000 r/min，10 min)，提取總蛋白，Βradford 法測定總蛋白濃度。取10 μ蛋白上樣，于10%的SDS-PAGE 中分離蛋白后，經(jīng)電轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，將PVDF 膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，孵育于對應(yīng)一抗(1∶1 000)4℃搖床過夜，加二抗(1∶1 000)室溫?fù)u床1 h，洗膜。采用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)法對PVDF膜進(jìn)行掃描。以β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中SMARCA4 mRNA的表達(dá)水平比較 40 例肝癌組織與對應(yīng)的癌旁組織比較顯示，肝癌組織中SMARCA4 mRNA的表達(dá)量為6.356±0.57，明顯高于癌旁組織的1.31±0.31，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.755，P＜0.05)。

2.2 肝癌組織及癌旁組織中SMARCA4 蛋白的表達(dá)水平比較 Western blot 檢測結(jié)果顯示，肝癌組織及部分癌旁組織都存在SMARCA4 蛋白的表達(dá)，但SMARCA4 蛋白在肝癌組織中的表達(dá)量為0.96±0.33，明顯高于癌旁組織的0.45±0.14，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.859，P＜0.05)，與PCR 結(jié)果趨勢一致，見圖1。

圖1 Western-bot 檢測SMARCA4 蛋白在肝癌及癌旁組織中的相對表達(dá)量

2.3 肝癌組織中SMARC4 蛋白的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)患者性別、年齡、腫瘤直徑、有無肝硬化、HΒsAg、ΒCLC 分期、組織分化程度、有無淋巴轉(zhuǎn)移及甲胎蛋白(AFP)予以分組比較，結(jié)果顯示：女性患者肝癌組織中SMARCA4 蛋白的表達(dá)量顯著高于男性，與AFP 小于2 000 的肝癌患者比較，AFP 大于2 000 的肝癌患者SMARCA4 的表達(dá)明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。但肝癌組織中SMARCA4 蛋白的表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤大小、肝硬化、乙肝表面抗原(HΒsAg) 、ΒCLC 分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)(P＞0.05)，見表1。

表1 不同臨床病理特征的肝癌患者肝癌組織中SMARCA4表達(dá)水平比較(±s)

表1 不同臨床病理特征的肝癌患者肝癌組織中SMARCA4表達(dá)水平比較(±s)

病理特征性別男女年齡(歲)＜50≥50腫瘤大小(cm)＜7≥7肝硬化有無HΒsAg陽性陰性ΒCLC分期A期～Β期C期～D期分化程度Ⅰ級～Ⅱ級Ⅲ級～Ⅳ級淋巴轉(zhuǎn)移有無AFP(ng/mL)＜2 000≥2 000例數(shù)35 5 16 24 20 20 22 18 31 9 25 15 20 20 6 34 21 19 SMARCA4表達(dá)量0.70±0.17 1.05±0.33 0.94±0.34 0.98±0.34 0.98±0.37 0.92±0.29 0.90±0.29 1.02±0.37 0.98±0.34 0.83±0.29 0.98±0.30 0.93±0.38 0.92±0.27 1.04±0.44 1.01±0.24 0.92±0.37 0.79±0.2 1.11±0.35 t值2.283 0.220 0.393 0.788 0.717 0.270 0.789 0.540 2.323 P值0.036 0.828 0.699 0.441 0.482 0.791 0.441 0.597 0.033

3 討論

SMARCA4 的編碼基因定位于染色體19p13 上，編碼一種磷酸化核蛋白，是SWI/SNF復(fù)合物中的重要組成亞基，可通過利用ATP 水解時產(chǎn)生的能量參與了染色質(zhì)的重塑過程，對基因的表達(dá)調(diào)節(jié)起到了重要作用[5-6]。在多種腫瘤中，可觀察到SMARCA4 的的異常表達(dá)，并證實SMARCA4 的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。SMARCA4 最初被報道在癌癥中具有腫瘤抑制作用。在非小細(xì)胞肺癌的研究中，觀察到35%的肺癌細(xì)胞發(fā)生了SAMRCA4 突變，從而導(dǎo)致SMARCA4 蛋白表達(dá)缺失，促進(jìn)了肺癌的發(fā)生[7]。同時在高鈣型卵巢小細(xì)胞癌[8]、胰腺癌[9]、乳腺癌[10]等癌癥中都能觀察到這一現(xiàn)象。然而在前列腺癌[11]和結(jié)直腸癌[12]的研究中卻得到不同的結(jié)果。SMARCA4在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著提高，SMARCA4的缺失會導(dǎo)致G1期阻滯，影響細(xì)胞周期進(jìn)程和DNA復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)敲低SMARCA4 可通過p53/p21 途徑誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞死亡。因此，推測SMARCA4 可能在不同類型的腫瘤中發(fā)揮不同的功能[12]。

本研究結(jié)果顯示：無論在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平，肝癌組織中SMARCA4 的表達(dá)均顯著高于癌旁組織，由此推測SMARCA4 在肝癌中很可能發(fā)揮促癌作用。關(guān)于SMARCA4 促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究近年來也取得了一定的進(jìn)展。有研究表明，SMARCA4 的過表達(dá)可激活I(lǐng)RAK1、Gankyrin、AKR1Β 10 等一系列促癌因子，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[13]。CHEN等[14]報道高表達(dá)的SMARCA4 還可上調(diào)SMAD6 的表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖?！案窝?肝硬化-肝癌”是目前臨床上較為公認(rèn)的三部曲。有學(xué)者認(rèn)為SMARCA4 促進(jìn)肝癌進(jìn)展的機制可能還與乙型肝炎病毒感染相關(guān)。當(dāng)患者感染乙型肝炎病毒后，SMARCA4 rs11879293 等位基因可作為內(nèi)含子增強子，改變Pol2結(jié)合位點，從而增強肝癌易感性[15]。此外LI 等[16]的研究顯示SMARCA4 通過轉(zhuǎn)化生長因子β/SMAD信號通路調(diào)節(jié)HSCs的激活，促進(jìn)了肝纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。

本研究將SMARCA4 的表達(dá)結(jié)合肝癌患者病理特征分析發(fā)現(xiàn)，SMARCA4 蛋白在肝癌中的表達(dá)水平可能與患者性別、AFP 水平有關(guān)。與男性肝癌患者相比，女性肝癌患者SMARCA4 的表達(dá)水平明顯升高。然而本研究納入研究的對象只有5例女性，數(shù)量較少，存在一定局限性，后續(xù)需要擴大樣本量進(jìn)一步驗證。AFP 大于2 000 ng/mL的肝癌患者肝癌組織中SMARCA4 的表達(dá)水平顯著高于AFP 小于2 000 ng/mL的肝癌患者，提示AFP水平較高的患者，SMARCA4的表達(dá)也較高，由此可見，在臨床上，針對女性及AFP較高的肝癌患者，可將SMARCA4 作為治療靶點，為這類患者制定個性化的診療策略。

有學(xué)者在對肝癌患者進(jìn)行預(yù)后評估中發(fā)現(xiàn)，SMARCA4 的表達(dá)水平與患者預(yù)后密切相關(guān)，SMARCA4 高表達(dá)往往預(yù)示著預(yù)后不良[17]，推測SMARCA4可用作肝癌的預(yù)后標(biāo)記物。提示肝癌患者進(jìn)行手術(shù)或者介入治療之后，可通過監(jiān)測SMARCA4 的表達(dá)水平來對患者預(yù)后進(jìn)行評估。因此，無論是在肝癌患者的診斷還是預(yù)后評估，SMARCA4 都展現(xiàn)了較高的應(yīng)用價值。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，SMARCA4 mRNA和蛋白在肝癌中高表達(dá)。并且與患者性別及AFP 表達(dá)可能相關(guān)，對肝癌的診斷和治療具有一定的臨床應(yīng)用價值，有望為肝癌患者的個性化診療提供一個新方向。