索菲婭，朱曉燃，楊振寰，姚樹坤

（1.北京中醫(yī)藥大學研究生院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院消化科，北京 100029）

目前原發(fā)性肝癌是我國發(fā)病率第4 位的惡性腫瘤，死亡率第2 位的腫瘤，嚴重威脅我國人民的生命和健康［1］。肝癌腹水是晚期肝癌最常見的并發(fā)癥之一，可引起腹脹、腹痛、乏力、納差、呼吸困難、活動受限、循環(huán)障礙以及多器官功能衰竭等，嚴重影響患者生活質(zhì)量，且目前臨床治療棘手，預后極差，臨床尚無明確治療方案［2-4］。研究表明中醫(yī)藥治療能夠改善上述癥狀，提高機體的抵抗力，提高生活質(zhì)量，有效控制腹水的進一步增長，延長患者生存期［1，5］。因此研究中醫(yī)藥對惡性腹水的治療意義重大［6，7］。清肝化瘀方是姚樹坤教授結(jié)合三十余年臨床經(jīng)驗擬成，前期研究結(jié)果證實清肝化瘀方可顯著提高原發(fā)性肝癌患者免疫功能，提高生存質(zhì)量，延長生存期，具有極高的開發(fā)研發(fā)價值，因而在此基礎(chǔ)上開發(fā)了“清肝化瘀顆粒”以便用于新藥研發(fā)與臨床推廣［8-10］。本研究對清肝化瘀顆粒治療H22 肝癌腹水瘤小鼠進行療效評價及基本機制探討，為新藥研發(fā)提供藥效學依據(jù)，也為其對原發(fā)性肝癌伴惡性腹水患者的治療提供基礎(chǔ)實驗支持。

1 材料與試劑

1.1 主要實驗材料

小鼠肝癌細胞H22，購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所；雄性ICR 小鼠，4 周齡，體重20 g 左右，由北京華阜康生物科技有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0008，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院SPF 級動物實驗室。實驗符合動物實驗倫理規(guī)定，倫理編號：190114。

1.2 藥材與試劑

氟尿嘧啶注射液，購于天津金耀藥業(yè)有限公司，批號1504261；0.9%生理鹽水注射液，購于北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號1003182；肝復樂膠囊，購于湖南九典制藥股份有限公司，批號Z20050817；清肝化瘀顆粒干膏粉（批號：20170731）由中日友好醫(yī)院藥學部提供?！案筛喾邸敝傅氖潜竟┰嚻诽崛∥?，每克提取物相當于4.472 g 生藥。

1.3 小鼠H22 肝癌腹水瘤模型建立

1.3.1 H22 肝癌細胞準備 水浴37 ℃將細胞快速復蘇，加入PBS、離心去除凍存液，加入生理鹽水重懸，將細胞配制成濃度為1×107cells/mL 的細胞懸液。

1.3.2 小鼠H22 肝癌細胞腹腔內(nèi)傳代 取4 周齡SPF 級雄性ICR 小鼠3 只，于右下腹腔注射0.2 mL已備細胞懸液，置于SPF 級動物室飼養(yǎng)，每日觀察小鼠生長情況及腹部變化，1 周后抽取腹水，于超凈工作臺中進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×107cells/mL。再以同樣方法進行小鼠腹腔內(nèi)細胞傳代，連續(xù)傳代2 次。第3 次傳代后取適量腹水計數(shù)，檢測細胞存活率98% 以上，調(diào)整細胞濃度到2×107cells/mL。

1.4 小鼠H22 肝癌腹水瘤模型建立

取4 周齡SPF 級雄 性ICR 小鼠120 只，體重20 g左右。無菌操作于小鼠右下腹腔內(nèi)注射0.2 mL 制備好的細胞懸液，建立小鼠H22 肝癌腹水瘤模型，接種完成后觀察小鼠狀態(tài)，于SPF 級動物實驗室條件下飼養(yǎng)。

1.5 分組及給藥

接種24 h 后將120 只小鼠隨機分為模型組、清肝化瘀顆粒低、中、高劑量組及肝復樂組、氟尿嘧啶組，每組20 只。模型組給予無菌水每日灌胃一次，清肝化瘀顆粒低劑量組（0.67 g/kg）、清肝化瘀顆粒中劑量組（1.34 g/kg）、清肝化瘀顆粒高劑量組（2.68 g/kg）、肝復樂組（1.35 g/kg），以上各組每日灌胃一次，及氟尿嘧啶組（50 mg/kg）每7 天腹腔注射1 次，以上各組給藥10 d 停藥。

1.6 觀測指標

1.6.1 小鼠一般情況及體重腹圍監(jiān)測 監(jiān)測各組小鼠的一般情況，包括外觀、活動情況和精神狀態(tài)等，每3 天測量小鼠的體重及腹圍。

1.6.2 小鼠腹水量、腹水抑制率及腹膜滲透性 用藥結(jié)束24 h，每組隨機選擇8 只小鼠，于尾靜脈注射濃度為5%的伊文藍溶液0.2 mL，2 h 后處死，抽取腹水，量取腹水體積，并計算腹水抑制率。腹水離心取上清，酶標儀測定吸光度（OD 值）（波長540 nm），計算腹膜滲透性。腹水抑制率=（1-治療組平均腹水量/模型組平均腹水量）×100%；腹水滲透性：采用伊文藍的吸光度OD 值測定腹膜血管的滲透性。

1.6.3 小鼠腹膜組織病理染色 取上述抽取過腹水的小鼠，剝?nèi)ジ共勘砥?，剪下左?cè)中下腹1 cm×1 cm 腹膜一塊，生理鹽水沖洗后將樣本放入包埋盒防止樣本卷皺，將樣本連同包埋盒置于福爾馬林溶液中固定，后續(xù)進行病理H-E 染色切片觀察。

1.6.4 生存期觀察 記錄每組剩余12 只小鼠的自然存活天數(shù)，統(tǒng)計平均生存天數(shù)、中位生存期，繪制生存曲線圖，計算生命延長率。生命延長率=［（治療組平均生存天數(shù)-模型組平均生存天數(shù)）/模型組平均生存天數(shù)］×100%。

1.7 腹膜組織Western bolt 檢測

依據(jù)上述藥效學評價，確定清肝化瘀顆粒最佳用藥劑量組。取該組及模型組小鼠腹膜應用Western bolt 法檢測VEGFA、VEGFR2 表達量。腹膜組織進行裂解、蛋白定量、變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，4 ℃條件下VEGFA 抗體（ab1316，abcam）及VEGFR2抗體（9698S，CST）孵育過夜，后孵育對應二抗，顯像。條帶灰度值采用ImageJ v1.53c 軟件進行分析，灰度值與內(nèi)參條帶進行對比，得出相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對所得到的所有數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計學分析，計量資料均以均值±標準差（±s）表示，若方差齊，采用單因素方差分析整體比較，兩兩比較采用Dunnet't檢驗，若方差不齊時采用非參數(shù)檢驗進行整體比較，兩兩比較采用Kruskal-Wallis 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般狀況觀察

所有小鼠接種H22 細胞后，均有毛發(fā)變暗黃、成簇、打結(jié)，活動速度減少減慢，眼睛深凹，腹部膨隆等表現(xiàn)。與模型組比較，各用藥組小鼠以上表現(xiàn)出現(xiàn)稍晚，尤以氟尿嘧啶組、清肝化瘀顆粒中、高劑量組出現(xiàn)最遲。

2.2 小鼠的體重監(jiān)測

與模型組相比，各用藥組小鼠體重增長緩慢，其中氟尿嘧啶組和清肝化瘀中、高劑量組體重增長趨勢明顯緩慢（P＜0.05～0.01），清肝化瘀低劑量組及肝復樂組小鼠體重與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體重（g，n=12，±s）Tab 1 Body weight of mice in each group（g，n=12，±s）

表1 各組小鼠體重（g，n=12，±s）Tab 1 Body weight of mice in each group（g，n=12，±s）

注：同一時間，與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別模型組清肝化瘀低劑量組清肝化瘀中劑量組清肝化瘀高劑量組肝復樂組氟尿嘧啶組15 d 41.17±1.83 39.90±1.87 37.77±1.31*38.68±2.52*39.15±0.38 34.75±4.22**5.471 0.01 FP 0 d 21.11±0.69 20.98±0.77 21.40±0.96 21.45±0.96 21.20±1.07 21.75±0.76 1.444 0.237 3 d 26.60±1.10 26.39±1.13 26.18±1.04 26.05±1.22 25.88±0.73 25.73±1.05 1.169 0.347 6 d 30.90±2.17 30.73±1.57 29.53±1.63 30.68±1.28 30.87±0.49 27.63±0.95**21.360 0.01 9 d 35.00±2.97 34.27±2.94 31.03±1.90*31.63±2.01 34.48±1.88 28.49±1.85**14.493 0.01 12 d 37.00±2.18 37.95±3.22 34.68±0.96*35.56±2.27*37.52±1.20 32.66±1.98**31.490 0.01

2.3 小鼠的腹圍監(jiān)測

與模型組相比，各用藥組小鼠腹圍增長較慢，其中氟尿嘧啶組和清肝化瘀中劑量組的腹圍于第6天開始差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05～0.01），清肝化瘀高劑量組于第12 天開始差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而清肝化瘀低劑量組及肝復樂組小鼠腹圍差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腹圍（cm，n=12，±s）Tab 2 Abdominal circumference of mice in each group（cm，n=12，±s）

表2 各組小鼠腹圍（cm，n=12，±s）Tab 2 Abdominal circumference of mice in each group（cm，n=12，±s）

注：同一時間，與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別模型組清肝化瘀低劑量組清肝化瘀中劑量組清肝化瘀高劑量組肝復樂組氟尿嘧啶組15 d 12.58±0.73 11.80±0.58 11.09±0.53*11.73±0.16*11.88±0.25 10.37±0.45**18.881 0.01 FP 0 d 8.00±0.16 8.03±0.10 8.06±0.09 8.03±0.15 7.98±0.19 7.99±0.17 0.454 0.809 3 d 8.18±0.14 8.12±0.12 8.19±0.14 8.18±0.15 8.22±0.10 8.14±0.08 1.008 0.420 6 d 9.07±0.26 8.84±0.34 8.74±0.22*8.94±0.26 8.91±0.19 8.13±0.12**37.392 0.01 9 d 10.01±0.20 9.73±0.31 9.09±0.29*9.58±0.22 9.46±0.53 8.55±0.18**49.077 0.01 12 d 11.49±0.63 11.21±0.57 10.63±0.80*10.77±0.58*11.07±0.39 9.68±0.49**28.913 0.01

2.4 小鼠腹水量、腹水抑制率及腹膜滲透性

與模型組相比，氟尿嘧啶組、清肝化瘀中劑量和高劑量組小鼠腹水量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），腹水抑制率分別為48.78%、25.67%、19.28%，清肝化瘀低劑量組、肝復樂組小鼠的腹水量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組結(jié)果相比，清肝化瘀中、高劑量組、氟尿嘧啶組小鼠腹水上清OD 值明顯降低（P＜0.05），以上結(jié)果顯示清肝化瘀顆粒中、高劑量治療可以抑制H22 腹水瘤小鼠的腹水增長，并降低腹膜滲透性。見表3。

表3 各組小鼠腹水量、腹水抑制率及腹水上清OD 值（n=8，±s）Tab 3 Amount and inhibition rate of ascites and OD value of ascites supernatant of mice in each group（n=8，±s）

表3 各組小鼠腹水量、腹水抑制率及腹水上清OD 值（n=8，±s）Tab 3 Amount and inhibition rate of ascites and OD value of ascites supernatant of mice in each group（n=8，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

腹水上清OD 值1.92±0.15 1.98±0.22 1.68±0.30*1.73±0.38*1.91±0.17 1.29±0.50*15.182 0.01組別模型組清肝化瘀低劑量組清肝化瘀中劑量組清肝化瘀高劑量組肝復樂組氟尿嘧啶組腹水抑制率（%）-18.00 25.67 19.28 15.23 48.78 FP腹水量（mL）9.39±0.99 7.70±1.44 6.98±0.68*7.58±0.68*7.96±0.93 4.81±1.43**17.739 0.01

2.5 小鼠腹膜組織病理H-E 染色結(jié)果

結(jié)果顯示模型組腹膜組織細胞排列松散，呈破絮樣改變，出現(xiàn)新生血管，伴大量的中性粒細胞浸潤，大量細胞變性壞死。清肝化瘀低劑量組腹膜組織細胞排列松散，出現(xiàn)新生血管，伴大量的中性粒細胞浸潤，部分細胞變性壞死。清肝化瘀中劑量組組織細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，輕度水腫，中性粒細胞數(shù)量較少。清肝化瘀高劑量組組織細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，輕度水腫，中性粒細胞數(shù)量較多。肝復樂組組織細胞結(jié)構(gòu)排列松散，明顯水腫，中性粒細胞數(shù)量明顯增多，腹膜厚度明顯增加。氟尿嘧啶組細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，僅出現(xiàn)輕微的水腫。以上結(jié)果表明氟尿嘧啶組小鼠腹膜結(jié)構(gòu)最完整、水腫較輕微，未觀察到新生的血管，考慮化療藥物直接接觸癌性腹水，作用效果最佳；與模型組相比，清肝化瘀中、高劑量組小鼠腹膜結(jié)構(gòu)較完整、水腫較輕、血管新生較少，優(yōu)于肝復樂組和清肝化瘀低劑量組。見圖1。

圖1 各組小鼠腹膜組織病理H-E 染色結(jié)果（×200）Fig 1 H-E staining results of peritoneal tissues in mice of each group（×200）

2.6 小鼠生存情況

與模型組相比，清肝化瘀顆粒中劑量組和氟尿嘧啶組的平均生存天數(shù)明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05～0.01）。模型組和清肝化瘀低、中、高劑量組小鼠的中位生存期分別為14、16、18、16天。與模型組比較，清肝化瘀各劑量組的生存期均有延長，其中清肝化瘀中劑量組中位生存期差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4 各組小鼠生存情況（n=12，±s）Tab 4 Survival of mice in each group（n=12，±s）

表4 各組小鼠生存情況（n=12，±s）Tab 4 Survival of mice in each group（n=12，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別模型組清肝化瘀低劑量組清肝化瘀中劑量組清肝化瘀高劑量組肝復樂組氟尿嘧啶組生命延長率(%)-16.7 25.7 15.3 18.1 66.7中位生存期(d)14.5 16.5 18.5*16.0 16.5 26.0**FP平均生存天數(shù)(d)14.4±2.7 16.8±3.0 18.1±4.0*16.6±2.7 17.0±3.7 24.0±4.6**25.674 P＜0.01

圖2 各組小鼠生存曲線Fig 2 Survival curve of the mice

2.7 Western blot 檢測

清肝化瘀中劑量組小鼠腹膜的VEGFA 及VEGFR2 表達量顯著低于模型組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

圖3 模型組與清肝化瘀中劑量組VEGFA、VEGFR2 表達量Fig 3 Expression of VEGFA and VEGFR2 in the model group and the middle-dose Qinggan Huayu group

3 討論

腹水是原發(fā)性肝癌晚期常見的并發(fā)癥之一，原發(fā)性肝癌腹水具有反復性、難治性，一直以來都是肝癌臨床治療的難題［11］。目前肝癌腹水的治療缺少循證醫(yī)學證據(jù)的支持，主要包括多種姑息措施，然而治療效果并不理想，且存在禁忌證多、副作用大、風險性高等問題［12，13］。肝癌腹水的形成機制復雜，尚未完全明確，除肝功能異常導致白蛋白減低及門靜脈高壓導致組織液漏出外，腫瘤侵襲導致的腹膜血管滲透性增加及腹膜新生血管的增多被認為是腹水形成的主要原因之一，因此降低腹膜微血管滲透性和抑制腹膜血管新生也被認為是減少惡性腹水的重要策略［14］。有研究者已嘗試將靶向藥物如抗VEGF 抗體貝伐珠單抗、重組人血管內(nèi)皮抑制素等藥物應用于惡性腹水的治療，可以獲得較好近期療效，但長期療效不確切，且藥物價格高昂，患者生存期難以顯著延長，有效的治療方法仍需進一步研究［15-18］。

原發(fā)性肝癌腹水屬中醫(yī)學“鼓脹”范疇，《素問》記載：“諸脹腹大，……，諸病有聲，鼓之如鼓，……水液渾濁，皆屬于熱”，將鼓脹認識為熱癥。姚樹坤教授認為肝癌腹水患者臨床可見兩脅疼痛、呼出臭穢，抽出的腹水黃濁質(zhì)重、腹表皮溫升高，舌紅苔黃膩，脈弦滑數(shù)，局部辨證屬熱癥，整體辨證為濕熱瘀毒熾盛伴有氣血虧虛，其主要病機在于癌毒侵犯隧道，隧道不通、郁生濕熱，濕熱毒瘀停結(jié)日久則阻滯氣血的運行和津液的輸布，使三焦決瀆失調(diào)、水液停聚腹中、使腹部脹大。病至晚期，患者正虛邪盛，氣血陰陽俱損，而患者平素飲酒或進食高熱量食物補品，更加重了濕熱毒瘀停結(jié)?！端貑枴吩疲骸皾駸嵯嗖珓t怫郁痞膈，小便不利而水腫也”，“瘀血不去，其水乃成”，說明了濕熱、瘀血阻閉氣機為水氣病的關(guān)鍵病機，姚樹坤教授以此為基礎(chǔ)，提出了“祛濕熱瘀血以利肝癌腹水”的治法，即破除痹阻之濕熱毒瘀實邪，宣通三焦水道、輔助氣血運行、改善津液輸布，達到祛濕逐瘀不傷陽、調(diào)氣利水不傷陰的效果。因此總結(jié)得出清肝化瘀方，適用于治療原發(fā)性肝癌中晚期、終末期，失去化療機會，或合并多種并發(fā)癥如伴肝功能異常、伴惡性腹水的患者，在前期的臨床實踐中取得了良好效果。清肝化瘀顆粒組方以黃芩、苦參為君，清熱燥濕，瀉火解毒；以白術(shù)、莪術(shù)、半枝蓮、蛇舌草為臣，活血破瘀，消積利水，抗癌毒；以三棱為佐，破血行氣，消積止痛；以甘草為使，調(diào)和諸藥；全方藥味精妙，功專力強，共奏清熱祛濕，破瘀利水，散結(jié)抗癌之功。

從現(xiàn)代藥理研究的角度來看清肝化瘀顆粒的組成，黃芩主要成分之一的黃芩素可通過破壞腫瘤血管發(fā)育，抑制血管生成［19］，另一種主要成分黃芩苷可降低VEGF 的表達和活性，抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［20］。苦參的主要成分苦參堿可通過抑制血管內(nèi)皮細胞增殖、下調(diào)血管內(nèi)皮生成因子和MMP-9 蛋白表達來抑制腫瘤血管生成［21］。有研究表明莪術(shù)主要單體成分莪術(shù)醇可以抑制VEGF 蛋白表達，進而抑制腫瘤血管生成［22］，莪術(shù)油能顯著抑制肝癌細胞生長增殖［23］。半枝蓮不同提取物或不同化學成分均具有一定的抗腫瘤活性，可通過降低血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子（CD31）的密度，降低VEGF 含量，抑制腫瘤血管的生成［24，25］。因此筆者推測清肝化瘀顆粒的作用可能與抑制腹膜血管滲透性的增加及腹膜新生血管生成相關(guān)，并通過腹膜病理學檢查及腹水上清OD 值檢測進行驗證，及進行VEGFA、VEGFR2 表達量檢測初步機制探索。

VEGF 已被證實是腹水腫瘤中腹水形成、血管生成的重要介質(zhì)，并且靶向VEGF 的治療可以抑制腹 水 產(chǎn) 生［26］。VEGFR2 是VEGF 的 主 要 受 體，是VEGF 介導的血管生成最重要的轉(zhuǎn)導因子［27］。靶向VEGF/VEGFR 信號通路的治療可以抑制腹水生成。本研究檢測H22 肝癌腹水瘤小鼠腹膜組織VEGFA、VEGFR2 的蛋白表達量，結(jié)果顯示清肝化瘀顆粒組的表達量顯著低于模型組，提示清肝化瘀顆粒的作用機制可能與抑制VEGF/VEGFR 信號通路相關(guān)。

肝復樂膠囊是治療以肝瘀脾虛為主證的原發(fā)性肝癌的中成藥，強調(diào)祛邪兼扶正，組方功效全面［28］。清肝化瘀顆粒以祛濕熱毒瘀以利水之法，其藥味少而精，功專效強而直達病所，急則治其標，避免過早補益閉門留寇，二者處方思路有所差別。在本研究中，兩種藥物分別作用于H22 肝癌腹水瘤小鼠模型，結(jié)果顯示清肝化瘀顆粒抗腹水生成作用較肝復樂更強，可更顯著地減少腹水生成、延長小鼠生存期。

本研究選取H22 肝癌腹水瘤小鼠模型，將H22肝癌細胞種植于小鼠腹腔內(nèi)，能恰當?shù)啬M原發(fā)性肝癌腹水的形成。結(jié)果證實，清肝化瘀顆粒對于H22 肝癌腹水瘤小鼠具有抑制腹水生成、延長生存時間的作用，且最佳治療劑量為1.34 g/kg，其腹水抑制率為25.67%，療效確切；通過對腹膜組織病理學及腹水上清OD 值的檢測，提示清肝化瘀顆粒可能是通過抑制腹膜新生血管的增加和腹膜血管滲透性的升高，發(fā)揮治療惡性腹水的作用，其作用機制可能與抑制VEGF/VEGFR 通路相關(guān)。

作者貢獻度說明：

索菲婭負責共同完成實驗、樣本檢測、論文書寫、數(shù)據(jù)分析；朱曉燃、楊振寰負責共同完成實驗及文章核對等審校工作；姚樹坤負責實驗指導、整體把握。