侯莉莉，劉海鑫，李青山

（山西中醫(yī)藥大學(xué)1.中藥與食品工程學(xué)院，2.基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 晉中 030600）

血管生成是新血管形成的過(guò)程，可促進(jìn)胚胎發(fā)育，并調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程。異常的血管生成是包括腫瘤轉(zhuǎn)移和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成在內(nèi)的各種病理過(guò)程的基礎(chǔ)［1］。多種中藥對(duì)血管新生有調(diào)節(jié)作用，如活血化瘀類(lèi)藥物。曾有研究者發(fā)現(xiàn)活血化瘀類(lèi)藥物對(duì)血管新生具有雙向調(diào)節(jié)的作用［2-5］。臨床常用活血化瘀藥對(duì)配伍丹參和川芎是常見(jiàn)的活血化瘀類(lèi)中藥配伍，研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)心肌缺血的大鼠有促進(jìn)血管生成的作用［6，7］，同時(shí)對(duì)腫瘤模型中的血管生成有抑制血管新生作用［8，9］。在臨床上，抑制血管新生可用于腫瘤治療，而促進(jìn)血管新生作用則用于缺血性疾病。丹參和川芎配伍之后對(duì)血管新生的作用、關(guān)鍵有效成分及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物學(xué)、計(jì)算機(jī)以及藥理等多門(mén)科目研究藥物作用及機(jī)制的新方法［10］，為中藥及配伍藥方對(duì)疾病的作用和機(jī)制研究開(kāi)辟了一條新的道路。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法，研究丹參和川芎兩種活血化瘀類(lèi)中藥配伍對(duì)血管新生的作用及調(diào)控機(jī)制，對(duì)活血化瘀藥在臨床上的使用有一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926，購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

木犀草素（大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：MB2172-1）；磷酸鹽緩沖液（博士得生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：PYG14040）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco，貨 號(hào)：12800017）；青-鏈 霉 素（Hycolne，貨 號(hào)：J180034）；0.05%胰酶溶液（含EDTA）（博士得生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：PYG0014）；Trizol（Takara，貨 號(hào)：9108）；反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（Takara，貨 號(hào)：AJ92003A）；PCR 擴(kuò) 增 試 劑 盒（Takara，貨 號(hào)：638314）；matrigel 基質(zhì)膠（BD，貨號(hào)：356231）

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光定量PCR（App Bio，QuantStudio3）；高內(nèi)涵（MD，ImageXpress Micro4.0）

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 丹參和川芎的信息收集 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）平臺(tái)中檢索出丹參和川芎兩種活血化瘀類(lèi)中藥的有效活性成分［11，12］。由于中藥中含有的成分很多，并且各個(gè)成分的結(jié)構(gòu)也不盡相同，所以需要根據(jù)類(lèi)藥性（DL）和生物利用度（OB）篩選出中藥的有效成分［11］進(jìn)行篩選。OB 是藥物的生物利用度，是中藥中的有效活性成分治療疾病的重要指標(biāo)；DL 代表類(lèi)藥性，是預(yù)測(cè)有效活性化合物的性質(zhì)的指標(biāo)?；谏锢枚萇B≥30%，類(lèi)藥性DL≥0.18 的條件，篩選出丹參和川芎兩種藥物的有效數(shù)據(jù)。通過(guò)Swiss Target Prediction 網(wǎng) 站 預(yù) 測(cè) 丹 參 和 川 芎 的 靶 點(diǎn)［13］，以Probability≥0.6 為 條 件［14，15］，篩 選 得 到 丹 參 和 川 芎兩種藥物的有效靶點(diǎn)。

1.4.2 血管新生的靶點(diǎn)分析 在疾病-基因數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET）（http：//www.disgenet.org/）［16，17］數(shù) 據(jù)庫(kù)中以“Inhibit angiogenesis”和“Promote angiogenesis”為關(guān)鍵詞檢索有關(guān)抑制和促進(jìn)血管新生的靶點(diǎn)，合并后得出與血管新生相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.4.3 藥物-疾病的核心靶點(diǎn)分析 將得到的丹參和川芎兩種藥物有效成分的靶點(diǎn)合并并刪除重復(fù)值，將得到的成分靶點(diǎn)與血管新生的靶點(diǎn)取交集得到藥物與疾病的交集靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。將交集的9 個(gè) 靶 點(diǎn) 通 過(guò)STRING 數(shù) 據(jù) 庫(kù)［18］和Cytoscape3.7.2 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系分析，獲得對(duì)應(yīng)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4.4 GO 和KEGG 富集分析 將9 個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)［19，20］中，在P≤0.05 的篩選條件下，篩選得出KEGG 通路和GO 生物通路的最終有效數(shù)據(jù)。

1.4.5 丹參-川芎-有效成分-血管新生靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖將得到的丹參和川芎兩種藥物的有效成分及靶點(diǎn)與血管新生的靶點(diǎn)按照一定的格式導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4.6 分子對(duì)接 在蛋白質(zhì)銀行數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB，https：//www.rcsb.org/）中收集蛋白質(zhì)構(gòu)象。 篩選條件設(shè)定如下：（1）通過(guò)X-晶體衍射獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；（2）蛋白質(zhì)的晶體分辨率小于2.8 ?；（3）分子對(duì)接文獻(xiàn)中報(bào)道的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)先選擇；（4）該生物來(lái)自智人。隨后，使用SYBYL-X 2.0 進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算。

1.4.7 細(xì)胞培養(yǎng) 將EA.Hy926 細(xì)胞置于DMEM完全培養(yǎng)基（含10% 的胎牛血清，1% 雙抗）中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃恒溫飽和濕度，5% CO2。

1.4.8 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 在定量RT-qPCR 分析中，空白對(duì)照組添加含0.1% FBS 的培養(yǎng)基，干預(yù)組的細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入用含0.1% FBS 的培養(yǎng)基稀釋的木犀草素（10-6mol/L），每孔為100 μL 體系，處理24 h 后，按照制造商的說(shuō)明，使用Trizol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用擴(kuò)增試劑盒將cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增。RT-qPCR 的體系如下：在95 ℃預(yù)變性15 min，在95 ℃變性10 s，在60 ℃退火20 s，在72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。用于RT-qPCR 的引物序列如下：MMP-9引物序列：正義鏈：5'-AGTCCAC-CCTTGTGCTCTTCCC-3'，反義鏈：5'-TCTGCCAC-CCGAGTGTAACCAT-3'；內(nèi)參GAPDH 引物序列：正義鏈：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，反義鏈：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。

1.4.9 血管形成分析實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)選擇10 代以前的細(xì)胞進(jìn)行體外血管形成分析（Tube Formation Assay）實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞復(fù)蘇后至少傳代兩次并于細(xì)胞活力旺盛時(shí)進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)操作。復(fù)蘇細(xì)胞常規(guī)接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)傳代至75 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞至少傳代兩次貼壁后置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞形態(tài)、活力較好并融合至80%～90%時(shí)，換成無(wú)血清培養(yǎng)基同步化饑餓24 h。BD 基質(zhì)膠提前4 ℃過(guò)夜至少24 h 解凍至液體狀態(tài)，1 mL 無(wú)菌分液器槍頭、96 孔黑板、離板機(jī)托架提前置于4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷。Tube Formation Assay 實(shí)驗(yàn)操作時(shí)（本實(shí)驗(yàn)一切操作均需保證無(wú)菌），取出冰盒并用照過(guò)紫外的冰盒打一盒冰置于超凈臺(tái)內(nèi)，將96 孔黑板置于冰盒上、BD 基質(zhì)膠使用時(shí)快速?gòu)? ℃冰箱中取出插在冰盒內(nèi)進(jìn)行操作。使用分液器插上經(jīng)4 ℃預(yù)冷處理的槍頭將基質(zhì)膠迅速加入各孔底部中間位置（每孔50 μL，本實(shí)驗(yàn)一切操作都需避免孔內(nèi)氣泡的產(chǎn)生），鋪膠完畢適度震蕩96 孔黑板使基質(zhì)膠鋪滿(mǎn)整個(gè)孔底，平放于4 ℃冰箱內(nèi)靜置15 min。靜置完畢后取出黑板置于預(yù)冷的離板機(jī)托架上（另一個(gè)托架的96 孔黑板離心前需配平，于對(duì)應(yīng)孔內(nèi)添加55 μL ddH2O）離心2 500 r/min，15 min。離心完畢后將去除氣泡加有BD 基質(zhì)膠的黑板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中平衡30～60 min。胰酶消化收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板中?？瞻讓?duì)照組添加含0.1% FBS 的培養(yǎng)基，干預(yù)組的細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入用含0.1% FBS 的培養(yǎng)基稀釋的木犀草素（10-6mol/L），陽(yáng)性對(duì)照組加VEGF（50 ng/mL），每孔為100 μL 體系。一切操作完畢后，將96 孔黑板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育6～16 h（注意96 孔黑板在放入培養(yǎng)箱內(nèi)的第一個(gè)小時(shí)內(nèi)切勿晃動(dòng)）。96孔黑板于孵箱中孵育8 h 左右后可于顯微鏡下觀察孔內(nèi)細(xì)胞形成血管腔的情況，觀測(cè)成腔順利后用Calcein AM（1 μmol/L）對(duì)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行染色，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中30 min，PBS 清洗3 次。在高內(nèi)涵分析儀器下每孔選取中間9 個(gè)視野、10 倍物鏡進(jìn)行拍照，計(jì)算各孔內(nèi)血管網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的個(gè)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參和川芎的有效成分及靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP 中檢索出丹參有3 714 個(gè)成分，川芎有602 個(gè)成分，經(jīng)過(guò)OB≥30%，DL≥0.18 篩選后結(jié)果得出丹參有10 個(gè)有效成分，川芎有2 個(gè)有效成分。通過(guò)Swiss Target Prediction 網(wǎng)站預(yù)測(cè)成分靶點(diǎn)，去除重復(fù)值后得出丹參有50 個(gè)靶點(diǎn)，川芎有4 個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 雙向調(diào)節(jié)血管新生的作用靶點(diǎn)

在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索血管新生的靶點(diǎn)，得到526 個(gè)促進(jìn)血管新生和抑制血管新生的靶點(diǎn)。

2.3 丹參/川芎藥對(duì)中具有雙向調(diào)節(jié)血管新生作用的有效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路-血管新生的作用關(guān)系展示

將檢索出來(lái)的丹參和川芎兩種藥物的有效成分?jǐn)?shù)據(jù)與血管新生的相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)分析得出疾病和藥物的交集靶點(diǎn)，共有9 個(gè)。分析得出KEGG 通路主要富集在5 條信號(hào)通路，KEGG 通路是丹參-川芎兩種藥物的靶點(diǎn)富集的通路，代表藥物調(diào)控相關(guān)疾病的信號(hào)通路［11］。使用Cytoscape3.7.2 軟件制作出丹參/川芎-有效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路-血管新生網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。圖中的節(jié)點(diǎn)表示的是丹參和川芎以及兩種藥物的有效成分，還有疾病與兩種藥物的交集靶點(diǎn)等；而其中的邊代表的是丹參-川芎與其有效成分、有效成分與交集靶點(diǎn)、疾病與核心通路以及核心通路與交集靶點(diǎn)之間的關(guān)系。從該網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，丹參和川芎的5 個(gè)活性成分可以調(diào)控9 個(gè)靶點(diǎn)，而這9 個(gè)靶點(diǎn)富集在5 個(gè)KEGG 通路上，即每個(gè)靶點(diǎn)基因蛋白富集在不同的信號(hào)通路，每個(gè)有效成分也調(diào)控不同的靶點(diǎn)基因蛋白，體現(xiàn)了冠心寧注射液多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同雙向調(diào)節(jié)血管新生的作用。

圖1 丹參/川芎-有效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路-血管新生網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Danshen/Chuanxiong-active ingredient-target-signal pathway-angiogenesis network diagram

2.4 丹參/川芎藥對(duì)中具有雙向調(diào)節(jié)血管新生作用的有效成分和作用靶點(diǎn)

將丹參/川芎藥對(duì)靶點(diǎn)與雙向調(diào)節(jié)血管新生作用靶點(diǎn)做交集，得出的疾病和藥物的交集靶點(diǎn)有9個(gè)（圖2），分 別 為AR、PARP1、MMP9、MMP2、MMP12、AKR1B10、ABCC1、CDK6、STAT3，即為丹參-川芎治療血管新生相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)。將9 個(gè)靶點(diǎn)在丹參和川芎兩種藥物的數(shù)據(jù)中查找，得出靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的有效成分（表1）。用Cytoscape 分析活性成分和靶蛋白之間的相互作用（圖3）。單個(gè)化合物可以調(diào)節(jié)多個(gè)靶標(biāo)以觸發(fā)生物學(xué)效應(yīng)，這可能在調(diào)節(jié)血管新生中起著至關(guān)重要的作用。結(jié)果顯示，木犀草素的Degree 值最大（Degree=7），可以調(diào)控PARP1、MMP9、MMP2、MMP12、AKR1B10、ABCC1、CDK6 等多個(gè)靶點(diǎn)，因此木犀草素作為關(guān)鍵有效成分成為后續(xù)的深入研究對(duì)象。

表1 藥物-疾病交集靶點(diǎn)及成分Tab 1 Drug-disease intersection targets and components

圖2 丹參/川芎活性成分靶點(diǎn)與血管新生靶點(diǎn)交集Fig 2 The intersection of Danshen/chuanxiong active ingredient targets and angiogenesis targets

圖3 丹參/川芎活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（Degree 值越大節(jié)點(diǎn)越大）Fig 3 Danshen/Chuanxiong active ingredient-target network diagram（the greater the degree value，the greater the node）

2.5 MMP9 為丹參/川芎藥對(duì)雙向調(diào)節(jié)血管新生作用的核心靶點(diǎn)

通過(guò)丹參/川芎活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖得出木犀草素為丹參/川芎藥對(duì)的影響血管新生作用的關(guān)鍵有效成分，因此將木犀草素作用于血管新生的靶點(diǎn)導(dǎo)入string 網(wǎng)站得出蛋白-蛋白相互作用并利用Cytoscape3.7.2 軟件分析得出蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。圖4 中顯示共有7 個(gè)丹參-川芎治療血管新生相關(guān)疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)的互作節(jié)點(diǎn)（PARP1、MMP9、 MMP2、 MMP12、 CDK6、 ABCC1、AKR1B10）和12 條邊，平均節(jié)點(diǎn)為2.89。圖中的節(jié)點(diǎn)代表藥物-疾病交集靶點(diǎn)蛋白，而邊代表的是交集靶點(diǎn)蛋白之間的交聯(lián)關(guān)系。此外，圖3 中得出MMP9 的Degree 值最高（Degree=10），因此MMP9可能是丹參-川芎影響血管新生作用的核心靶點(diǎn)。

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Protein-protein interaction（PPI）network

2.6 丹參/川芎藥對(duì)雙向調(diào)節(jié)血管新生作用的主要生物學(xué)過(guò)程和核心通路

核心通路分析（KEGG）發(fā)現(xiàn)丹參/川芎藥對(duì)雙向調(diào)節(jié)血管新生作用的主要通路富集在5 條信號(hào)通路（表2），KEGG 通路是丹參/川芎兩種藥物的靶點(diǎn)富集的通路，代表藥物調(diào)控相關(guān)疾病的信號(hào)通路［11］。丹參和川芎影響的作用通路主要為腫瘤相關(guān)通路、腫瘤中的MicroRNAs 等信號(hào)通路。其中P值最小的通路為腫瘤相關(guān)通路。而且，5 條通路中均含有作用靶點(diǎn)MMP9，因此蛋白與蛋白相互作用分析結(jié)果相互佐證了MMP9 為丹參/川芎藥對(duì)雙向調(diào)節(jié)血管新生作用核心作用靶點(diǎn)。GO 分析得到分子功能13 條通路、生物過(guò)程1 條通路和細(xì)胞成分8條通路（圖5）。GO 功能富集主要涉及膠原分解代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、金屬內(nèi)肽酶活性等與核心靶點(diǎn)MMP9 關(guān)系密切（圖6）。

圖5 KEGG 通路氣泡圖Fig 5 Bubble diagram of KEGG pathway

圖6 GO 生物通路圖Fig 6 GO biological pathway diagram

表2 KEGG 通路分析Tab 2 KEGG pathway analysis

2.7 分子對(duì)接模擬

基于丹參/川芎活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，PPI 網(wǎng)絡(luò)和KEGG 信號(hào)通路分析，筆者選擇MMP9核心靶基因與木犀草素進(jìn)行分子對(duì)接。觀察到木犀草素進(jìn)入了蛋白質(zhì)的活性口袋（圖7）。木犀草素小分子主要與MMP9上的TYR64，ARG116 及GLU117 形成3 個(gè)氫鍵。結(jié)合分?jǐn)?shù)是4.1652，達(dá)到繼續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證的條件。

圖7 分子對(duì)接模擬分析Fig 7 Analysis of target-compound docking simulation

2.8 木犀草素對(duì)體外小管形成的影響

為了驗(yàn)證木犀草素對(duì)體外小管形成的影響，本研究利用血管形成分析實(shí)驗(yàn)方法。與空白組比較，經(jīng)木犀草素處理后抑制EA.hy926 細(xì)胞的體外血管形成，經(jīng)VEGF 處理后促進(jìn)EA.hy926 細(xì)胞的體外血管形成（圖8A）。經(jīng)過(guò)環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)目統(tǒng)計(jì)，用單因素方差分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白組比較，經(jīng)木犀草素處理的EA.hy926 細(xì)胞的環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)目明顯減少（P＜0.01），經(jīng)VEGF 處理的EA.hy926 細(xì)胞的環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)目明顯增高（P＜0.01）（圖8B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明木犀草素處理EA.hy926 細(xì)胞能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的新血管生成。

圖8 體外血管形成分析Fig 8 Tube formation assay

2.9 木犀草素對(duì)MMP9 及VEGF-A 的mRNA 表達(dá)的影響

為了更深入的分析木犀草素的血管新生作用和作用靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平，本研究利用RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證核心有效成分木犀草素是否對(duì)核心靶點(diǎn)MMP9的表達(dá)有影響。同時(shí)VEGF-A作為血管新生的重要靶點(diǎn)［21］，因此驗(yàn)證木犀草素是否對(duì)其表達(dá)具有影響具有重要意義。用配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示：木犀草素與空白組比較，經(jīng)木犀草素處理的EA.Hy926 細(xì)胞的MMP9表達(dá)明顯降低（P＜0.01）（圖9A）；木犀草素處理的EA.hy926 細(xì)胞的VEGF-A的表達(dá)同樣顯著降低（P＜0.05）（圖9B）。木犀草素對(duì)MMP9與VEGF-A的轉(zhuǎn)錄均有抑制作用，給藥組MMP9與VEGF-A的表達(dá)與空白組相比均降低，表明丹參/川芎藥對(duì)中主要成分木犀草素通過(guò)MMP9反向調(diào)節(jié)血管新生，與血管形成分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖9 RT-qPCR 檢測(cè)木犀草素對(duì)MMP9 及VEGF-A 的mRNA 表達(dá)的影響Fig 9 RT-qPCR detection of the effect of luteolin on the mRNA expression of MMP9 and VEGF-A

3 討論

血管生成是由先前存在的血管形成的新血管的過(guò)程，參與了多種生理（例如發(fā)育和傷口愈合）過(guò)程，也是許多病理過(guò)程（包括癌癥，感染性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬）的關(guān)鍵因素［22］。它包括以獨(dú)特的內(nèi)皮細(xì)胞功能為特征的幾個(gè)步驟，例如增殖，遷移，管腔形成、分化和成熟［23］。每個(gè)步驟都涉及多種生長(zhǎng)因子、受體和分子，從而影響不同疾病中血管新生的致病性的信號(hào)傳導(dǎo)［24］。

丹參是我國(guó)的一種傳統(tǒng)中藥材，具有活血化瘀、涼血清心、養(yǎng)血安神等功效［25］。其中丹參粗提物和丹酚酸B（丹參的成分）通過(guò)上調(diào)VEGF和VEGF-R2基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)鼠內(nèi)皮細(xì)胞系的血管生成［26］。隱丹參酮可以在體外降低基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9 的蛋白表達(dá)，它還可能通過(guò)抑制血管生成相關(guān)因素來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成和大鼠主動(dòng)脈環(huán)體外血管生成［27］。川芎辛散溫通，具有活血化瘀、溫通經(jīng)脈的功能［28］。川芎總酚可以通過(guò)促進(jìn)缺血心肌血管新生而改善心功能［29］。中藥丹參藥材對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有最佳療效，據(jù)報(bào)道其主要有效成分四甲基吡嗪和芍藥苷可減輕動(dòng)脈粥樣硬化。四甲基吡嗪和芍藥苷的組合通過(guò)抑制VEGF/VEGFR2 和Jagged1/Notch1 信號(hào)通路抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的HUVEC 血管生成，這可能有助于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性［30］。但是丹參和川芎配伍影響血管新生的作用機(jī)制仍不明確。

本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)丹參和川芎配伍影響血管新生的活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)通路等方面進(jìn)行了探討。篩出丹參有10 個(gè)有效成分，川芎有2 個(gè)有效成分；丹參有50 個(gè)靶點(diǎn)，川芎有4 個(gè)靶點(diǎn)。其中木犀草素為最重要的活性成分，木犀草素是多酚類(lèi)黃酮化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性［31，32］。有研究表明木犀草素對(duì)血管新生活力具有抑制作用，從而達(dá)到抗癌的效果［33］。

在丹參和川芎配伍影響血管新生的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中有7 個(gè)節(jié)點(diǎn)和24 條邊，其中MMP9基因在網(wǎng)絡(luò)中處于重要的地位，可能是丹參和川芎配伍影響血管新生的重要靶點(diǎn)。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類(lèi)依賴(lài)于鋅離子的蛋白酶家族，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用。MMP9 是MMP 家族中重要成員，在血管生成和細(xì)胞遷移中發(fā)揮著重要的作用。MMP9 最早在炎癥和某些癌癥中被發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用與其促進(jìn)血管新生密切相關(guān)［34］。

KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)丹參和川芎配伍可以通過(guò)影響血管新生進(jìn)而調(diào)節(jié)癌癥通路。1971 年，?？寺凇缎掠⒏裉m醫(yī)學(xué)雜志》上提出了一種思考癌癥的全新方式。通過(guò)應(yīng)用有效的策略來(lái)抑制驅(qū)動(dòng)腫瘤血管生成的關(guān)鍵參與者，從而使腫瘤“餓死”［35］。并提出抗血管生成作為預(yù)防癌癥的策略，其作為一種治療癌癥的革命性方法成為當(dāng)今最令人激動(dòng)的科學(xué)探究領(lǐng)域之一［36］。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法研究了丹參和川芎配伍影響血管新生的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)丹參和川芎配伍可以通過(guò)影響血管新生從而達(dá)到抗癌的效果，其作用機(jī)制可能與MMP9、MMP2 等靶點(diǎn)有關(guān)。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法的基礎(chǔ)上分析兩種藥物有效成分、靶點(diǎn)蛋白和作用通路結(jié)果顯示丹參-川芎是通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路、多成分對(duì)血管新生相關(guān)疾病發(fā)揮作用的。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

侯莉莉：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分子對(duì)接及PCR 實(shí)驗(yàn)部分。劉海鑫：血管形成分析實(shí)驗(yàn)部分及指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。李青山：實(shí)驗(yàn)思路指導(dǎo)。