黃曉東 楊磊 黃清云 高雪辰

近年來記憶性T淋巴細胞在移植物免疫損傷中的作用已越來越受到人們的重視[1-2]，特別是同種移植中CD8+記憶性T細胞的作用尤受關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，CD8+記憶性T細胞能在極短的時間內(nèi)清除再次進入到體內(nèi)的抗原，發(fā)揮強大的免疫效能[3-4]。正是由于免疫反應(yīng)以及免疫記憶的存在，使受體體內(nèi)移植的健康器官難以長時間發(fā)揮功能甚至難以長期存活。自體移植在正常情況下，一般不會發(fā)生移植排斥反應(yīng)，但是在同種異體間進行移植，常會發(fā)生不同程度的排斥反應(yīng)，T細胞同樣具有特異性和記憶性，在抑制排斥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[5-6]。免疫學相關(guān)文獻指出，不同品系小鼠之間進行皮膚移植和輸注淋巴細胞的方法可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)[7-8]。本研究采用兩種方法誘導(dǎo)小鼠機體產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，探討并比較兩種方法形成CD8+記憶性T細胞性質(zhì)和數(shù)量的差異，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 受體小鼠采用4～6周齡雌性Bal B/C小鼠，共100只，體重18～20 g；提供皮片和脾臟淋巴細胞的為同一只6周齡C57小鼠，體重25 g。所有小鼠均由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供。本研究動物實驗設(shè)計方案已通過廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 儀器和試劑 冷凍離心機（德國Eppendorf公司，5810R）；流式細胞儀（美國 BD 公司，CannonⅡ）；流式熒光抗體 CD3-FITC、CD8-PE、CD44-FITC、CD62L-cy5.5（美國BD公司）；細胞培養(yǎng)箱（德國Thermo公司）；細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑及耗材（中國四季青公司）；無菌手術(shù)器械，包括一次性方巾、眼科剪、眼科鑷、持針器、一次性6-0帶針縫合線（美國FST公司）；高壓滅菌鍋（德國Thermo公司）；1%戊巴比妥鈉（中國點滴實驗試劑有限公司）。

1.3 分組 將75只Bal B/C小鼠按隨機數(shù)字表法分為移植組、1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組、空白對照組，每組15只。

1.4 供體處理 將C57小鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇5 min，在生物安全柜內(nèi)應(yīng)用無菌操作取背部皮片，剪成每塊約0.25 cm2，共15塊，均浸泡于放有0.9%氯化鈉溶液的平皿中并置于冰上，備用于移植組小鼠背部移植。然后將小鼠取右側(cè)臥位，皮膚表面消毒后依次剪開皮膚、腹膜，無菌操作下取出整個脾臟，將脾臟置于有0.9%氯化鈉溶液的平皿中，用2支1 ml注射器的針頭（彎成直角）在脾臟表面刺破3～5個小孔后，再輕刮脾臟表面，充分將內(nèi)部組織刮出置于平皿中形成細胞懸液。將細胞懸液用冷凍離心機以1 200 r/min離心5 min，棄上清液后加入紅細胞裂解液，充分混勻后靜置10 min。重復(fù)該步驟2次后，使用200目過濾網(wǎng)過濾掉雜質(zhì)，所得細胞懸液即為淋巴細胞懸液。用牛鮑計數(shù)板計數(shù)后分別取出1×106個、5×106個、1×107個細胞各15份，重懸于0.2 ml PBS緩沖液中，制成相應(yīng)的淋巴細胞懸液并置于冰上，備用于 1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組小鼠腹腔注射。

1.5 受體處理 移植組小鼠采用1%戊巴比妥鈉0.1 ml/10 g腹腔注射麻醉。剃除背部皮膚毛發(fā)后用75%乙醇消毒，并剪除約0.25 cm2，取供體皮膚在2、3、5、6、8、9、11、12 點鐘方向進行縫合，然后置于臺燈下復(fù)蘇。1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組小鼠分別注射制備好的淋巴細胞懸液0.2 ml?？瞻讓φ战M小鼠腹腔注射PBS緩沖液0.2 ml。

1.6 CD8+記憶性T細胞百分比及CD3+T細胞數(shù)檢測上述處理后1、2、3個月時，5組小鼠均按隨機數(shù)字表法各取5只頸椎脫臼處死，取出脾臟制成淋巴細胞懸液，采用流式細胞儀檢測CD8+記憶性T淋巴細胞百分比及CD3+T細胞數(shù)。CD8+記憶性T細胞用CD8-PE、CD44-FITC、CD62L-cy5.5進行標記。4℃避光染色30 min后用 300 μl PBS洗滌細胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液。重復(fù)該步驟2次，最終加入500 μl PBS重懸，上流式細胞儀檢測CD8+記憶性T細胞百分比。CD3+T細胞數(shù)檢測時采用CD3-FITC進行標記，細胞染色步驟同上，上流式細胞儀檢測后可從軟件中直接獲得細胞CD3+T細胞數(shù)。

1.7 CD8+記憶性T細胞增殖能力檢測 將剩余25只小鼠按照1.4、1.5中的方法重新制備5種小鼠模型，每組5只。在淋巴細胞產(chǎn)生最多的時間點（經(jīng)預(yù)實驗結(jié)果顯示為2個月）處死各組小鼠，按1.4操作步驟將小鼠脾臟制成淋巴細胞懸液，進行CD8+記憶性T細胞分選、純化。具體步驟按照CD8+記憶性T淋巴細胞隱性分選試劑盒說明書操作：分別將50 μl CD8&CD44&CD62L生物素抗體與各組小鼠淋巴細胞懸液混合，孵育15 min后加入試劑盒中所配磁珠，將細胞與磁珠充分混勻后孵育15 min，過磁力架15 min，棄磁珠，所得淋巴細胞懸液重復(fù)上述步驟1次，即得CD8+記憶性T淋巴細胞。CD8+記憶性T淋巴細胞的分選純度使用流式細胞儀檢測，染色及操作步驟同上；檢測結(jié)果使用EXPO32流式軟件進行分析，所分析細胞均為CD8+細胞。隨后建立十字坐標系，橫軸指標為CD62L，縱軸指標為CD44，目的細胞CD8+記憶性T細胞表達情況為CD44+CD62L-，即落在第二象限的細胞比例為CD8+記憶性T細胞比例。

經(jīng)牛鮑計數(shù)板計數(shù)后，各組取相同數(shù)目的CD8+記憶性T淋巴細胞經(jīng)羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxy fluorescein diacetate succinimide ester，CFSE）染色，與經(jīng)過輻照的C57小鼠脾臟細胞共培養(yǎng)，1周后采用流式細胞術(shù)檢測CFSE染色陽性細胞熒光強度，并將結(jié)果使用Modify 3.0軟件進行分析，比較5組小鼠CD8+記憶性T細胞的增殖指數(shù)，從而評價其增殖能力。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內(nèi)不同時點的比較采用單因素重復(fù)測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠不同時點CD8+記憶性T細胞百分比及CD3+T細胞總數(shù)的變化和比較 5組小鼠處理后1個月時CD8+記憶性T細胞百分比和CD3+T細胞總數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。處理后2個月時，3個注射組小鼠CD8+記憶性T細胞百分比均高于移植組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中以1×106注射組百分比最高；移植組、1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組CD3+T細胞總數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但與空白對照組比較均明顯升高（P＜0.05）；處理后 3個月時，5×106注射組CD8+記憶性T細胞百分比高于移植組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而5組間CD3+T細胞總數(shù)比較，結(jié)果同2個月時。

1×106注射組小鼠在處理后2個月時CD8+記憶性T細胞比例最高，與處理后1、3個月比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；5×106注射組、1×107注射組、移植組小鼠均在處理后3個月時CD8+記憶性T細胞比例最高，其中5×106組3個月時與1、2個月時比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。移植組、1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組小鼠CD3+T細胞總數(shù)均在處理后2個月時最高，與1、3個月時比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 5組小鼠不同時點CD8+記憶性T細胞百分比及CD3+T細胞總數(shù)的變化和比較

2.2 5組小鼠CD8+記憶性T細胞增殖能力變化與比較 5組小鼠脾臟CD8+記憶性T細胞分選純化后，純度達到95.3%（圖1），達到本研究所需要求。純化后的CD8+記憶性T細胞與C57小鼠淋巴細胞共培養(yǎng)后，各注射組與移植組增殖指數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；各注射組、移植組與空白對照組比較，其增殖指數(shù)均有明顯提高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表 2。

圖1 CD8+記憶性T細胞分選、純化后純度檢測

表2 5組小鼠CD8+記憶性T細胞增殖指數(shù)的比較

3 討論

人體的免疫系統(tǒng)不僅具有實時免疫功能，同時也存在免疫記憶功能[9]，即在抗原初次對機體進行刺激時，促使一系列免疫細胞增殖、活化，進而發(fā)揮免疫功能[10]，如T淋巴細胞、B淋巴細胞以及漿細胞等，在抗原完全被清除后，會形成少量具有記憶功能的免疫細胞儲存在機體免疫器官中，如CD8+T細胞，通常會在外界抗原入侵機體后1周左右達到高峰[11]。隨后，在抗原被完全清除后，大部分效應(yīng)性CD8+T細胞凋亡，并被脾臟所破壞，少部分則逐漸分化成為能夠長期存活的記憶性T細胞[12]。記憶性T細胞無論是在器官移植排斥和抗腫瘤過程中，均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時也是移植免疫和腫瘤免疫領(lǐng)域的研究熱點。近年來，關(guān)于記憶性T細胞的研究越來越多。由于機體在正常狀態(tài)下細胞免疫未受到激活，記憶性T細胞在機體內(nèi)含量十分低。因此，如何獲取足夠的記憶性T細胞，是進行記憶性T細胞研究的一個重要且困難的環(huán)節(jié)[13]。

本研究將傳統(tǒng)的應(yīng)用皮膚移植誘導(dǎo)CD8+記憶性T細胞的方法，與新的方法，即對小鼠進行同種異基因脾臟淋巴細胞注射誘導(dǎo)CD8+記憶性T細胞的方法進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理后2個月時最高CD8+記憶性T細胞比例可達到（42.28±2.74）%，高于傳統(tǒng)的移植組；處理后3個月時，各注射組小鼠脾臟中CD8+記憶性T細胞百分比最高達到（56.57±1.28）%，而此時小鼠開始逐漸進入免疫記憶階段，體內(nèi)的CD3+T細胞總數(shù)開始下降，因此建議選取注射1×106個細胞，誘導(dǎo)時間為2個月，此時產(chǎn)生的CD8+記憶性T細胞百分比相對較高，CD3+T細胞總數(shù)較多，誘導(dǎo)周期相對較短，效果令人滿意。同時，各注射組、移植組與空白對照組比較，CD8+記憶性T細胞增殖指數(shù)均有明顯提高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

綜上所述，記憶性T細胞通常以低水平存在于脾臟及外周血中，本研究所采用的方法有助于獲取足夠的記憶性T細胞，在進行記憶性T細胞的課題研究中具有一定的應(yīng)用價值。