劉昌森，周 歡，周辰炎，范良苗，唐 凡，胡欣朦，王佩玉，楊文杰

（江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心/淮陰師范學(xué)院，江蘇淮安 223300）

黃瓜作為一種廣受歡迎的蔬菜，其口感佳、維生素含量高，一直以來市場需求量都很大[1]。黃瓜在我國各地廣泛種植，在許多地區(qū)采用的是溫室或塑料大棚栽培方式。據(jù)了解，目前市售黃瓜大多在栽種時(shí)，施加氮肥的同時(shí)也添加了硝化抑制劑，一方面可以增加作物產(chǎn)量，降低硝酸鹽含量，提高作物品質(zhì)；另一方面也可以抑制土壤細(xì)菌硝化作用，減少氮肥損失，提高環(huán)境效益。采用這種生產(chǎn)方法，不僅對消費(fèi)者健康有益，提高種植戶收入，還可以減輕環(huán)境壓力，有利于生態(tài)建設(shè)。

雙氰胺（DCD）和3,4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP）是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的兩種硝化抑制劑[2-3]，其在增加農(nóng)作物產(chǎn)量、提高農(nóng)作物品質(zhì)和改善土壤生態(tài)等方面的作用，國內(nèi)外學(xué)者已開展了大量研究，取得了很多成果。伍少福等[4]在大田種植中，施用添加了DMPP 的復(fù)合肥，對黃瓜、西瓜產(chǎn)量及營養(yǎng)品質(zhì)有很大提高，且對不同西瓜品種的作用效果不同。溫室栽培黃瓜時(shí)，趙歐亞等[5]在農(nóng)民習(xí)慣施肥量基礎(chǔ)上，添加了氮肥用量20%的DCD，其黃瓜品質(zhì)和產(chǎn)量均得到顯著提高；另外，張琳等[6]種植時(shí)配施含DCD 的氮肥，發(fā)現(xiàn)可明顯減少溫室氣體N2O 排放量，氮素流失減少，氮肥在土壤中留存時(shí)間延長；趙婉伊等[7]將硝化抑制劑與脲酶抑制劑配合使用，發(fā)現(xiàn)黃瓜生長過程中，除產(chǎn)量提升外，氮素可以緩慢釋放，礦物質(zhì)利用率也得到提高。同時(shí)也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硝化抑制劑的施用濃度過高時(shí)，會(huì)對作物幼苗產(chǎn)生種種危害[8-10]。

上述研究中，硝化抑制劑作為添加劑直接使用，是否會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響仍不明確，因此明確硝化抑制劑的安全添加量是當(dāng)前需要解決的問題。在適宜環(huán)境下，黃瓜種子吸漲水分后便開始萌發(fā)，萌發(fā)過程中內(nèi)部各種酶活力的動(dòng)態(tài)變化，可間接反映種子發(fā)芽的長勢。種子萌發(fā)過程，這一系列相關(guān)酶活力變化，是植物整個(gè)生命活動(dòng)周期里最為強(qiáng)烈的一個(gè)階段[11]，可以反映出硝化抑制劑對植物生長發(fā)育的影響。本試驗(yàn)采用培養(yǎng)皿發(fā)芽法，研究DCD、DMPP 對黃瓜種子發(fā)芽率、淀粉酶、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的影響，以了解其對黃瓜種子發(fā)芽的影響，為明確設(shè)施黃瓜栽培中DCD、DMPP 的合理使用量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜種子（津研4 號，購自淮安市農(nóng)科院）；3,4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP）、雙氰胺（DCD），均為國藥分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取飽滿無蟲害的黃瓜種子，經(jīng)1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒30 min，充分洗凈后浸種4 h，然后轉(zhuǎn)入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，上覆雙層紗布，保持濕度，置于人工氣候箱中28 ℃條件下培養(yǎng)發(fā)芽。

設(shè)置DCD、DMPP 兩個(gè)試驗(yàn)組，分別設(shè)置5 個(gè)處理，其中DCD 試驗(yàn)組設(shè)置T1 （1 μmol·mL-1）、T2（3 μmol·mL-1）、T3（5 μmol·mL-1）、T4（7 μmol·mL-1）、T5（10 μmol·mL-1）5個(gè)濃度處理；DMPP試驗(yàn)組設(shè)置T1（0.1μmol·mL-1）、T2（0.3μmol·mL-1）、T3（0.5μmol·mL-1）、T4（0.7 μmol·mL-1）、T5（1 μmol·mL-1）5 個(gè)濃度處理；試驗(yàn)組黃瓜種子第一天噴施不同濃度梯度的硝化抑制劑溶液，之后每天在固定時(shí)間噴施等量的去離子水；兩試驗(yàn)組均以噴施去離子水的黃瓜種子為對照（CK）；試驗(yàn)各處理均設(shè)3 次重復(fù)。分別統(tǒng)計(jì)第3 天和第6 天各處理組黃瓜種子的發(fā)芽數(shù)量，并計(jì)算發(fā)芽勢及發(fā)芽率。

黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率計(jì)算公式為：

種子發(fā)芽勢=（第3天發(fā)芽數(shù)/總數(shù)）×100%；

種子發(fā)芽率=（第6天發(fā)芽數(shù)/總數(shù)）×100%。

1.3 測定項(xiàng)目

在種子發(fā)芽率試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別篩選確定兩個(gè)試驗(yàn)組中的3 個(gè)處理，進(jìn)一步檢測不同濃度的DCD 和DMPP 處理?xiàng)l件下黃瓜種子的淀粉酶活性、抗氧化酶活性及MDA 含量等生理指標(biāo)，每處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。分別采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定淀粉酶活性[12]，紫外吸收法測定CAT 活性[13]，氮藍(lán)四唑染色法測定SOD 活性[14]，愈創(chuàng)木酚法測定POD 活性[12]，硫代巴比妥酸法測定MDA含量[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對黃瓜種子發(fā)芽率的影響

由表1 可知，DCD 試驗(yàn)組中，與CK 相比，T1、T2 處理的黃瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率與其差異不明顯，而T3、T4、T5 處理的黃瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率均顯著下降（P＜0.05），T5 處理組黃瓜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別降低至84.67%和93.67%，顯著低于CK 和其他處理。DMPP 試驗(yàn)組呈現(xiàn)出與DCD 試驗(yàn)組相似的結(jié)果，即在T1、T2處理?xiàng)l件下，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率與CK 差異不顯著，而隨著DMPP 處理濃度的增高，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率顯著降低（P＜0.05），T5 處理?xiàng)l件下黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率達(dá)到最低值，分別為81.67%、83.00%。由此可見，在一定范圍內(nèi)，低濃度DCD 溶液、DMPP 溶液對黃瓜種子發(fā)芽無明顯抑制作用，而高濃度的DCD 溶液、DMPP 溶液則會(huì)抑制黃瓜種子發(fā)芽，顯著降低種子發(fā)芽率。

表1 DCD、DMPP對黃瓜種子發(fā)芽的影響

2.2 對黃瓜種子淀粉酶活性的影響

由表2可知，在DCD試驗(yàn)組中，CK、T1、T3、T5處理之間的差異顯著（P＜0.05），其中T1 處理的黃瓜種子淀粉酶顯著高于CK，達(dá)到798.85 U·g-1，并隨著DCD 處理濃度的增加，黃瓜種子的淀粉酶活性均有所降低，當(dāng)DCD溶液濃度為10 μmol·mL-1時(shí)，種子淀粉酶活性降至最低，為530.26 U·g-1。而在DMPP 試驗(yàn)組中，T1、T3處理的黃瓜種子淀粉酶活性與對照組差異不顯著，T5處理的黃瓜種子淀粉酶活性為738.73 U·g-1，顯著低于CK（P＜0.05）。綜合分析，低濃度的DCD提高了黃瓜種子萌發(fā)時(shí)的淀粉酶活性，高濃度的DCD 則會(huì)抑制其活性；DMPP處理下，表現(xiàn)出低濃度的DMPP對淀粉酶活性無顯著影響，而高濃度DMPP則會(huì)抑制其活性。

表2 DCD、DMPP對黃瓜種子淀粉酶活性的影響 單位：U·g-1

2.3 對黃瓜種子CAT活性的影響

如表3 所示，DCD 試驗(yàn)組中，T1、T3 處理黃瓜種子的CAT 活性明顯增加，極顯著高于CK（P＜0.01），當(dāng)DCD 溶液濃度為1 μmol·mL-1時(shí)，黃瓜種子的CAT活性最高，為357.49 U·g-1；而在10 μmol·mL-1DCD溶液的處理?xiàng)l件下，黃瓜種子的CAT 活性則降低至192.83 U·g-1，顯著低于CK（P＜0.01）。DMPP 試驗(yàn)組中，CK 和T1 處理之間的CAT 活性差異不顯著，但T3、T5 處理的CAT 活性則極顯著低于CK（P＜0.01），隨著DMPP 濃度升高，CAT 活性呈現(xiàn)明顯下降趨勢，當(dāng)DMPP濃度為1 μmol·mL-1時(shí)，其CAT活性最低，為136.14 U·g-1。以上結(jié)果表明，低濃度的DCD 可以增加種子萌發(fā)時(shí)的CAT 活性，而低濃度的DMPP 對黃瓜種子的CAT 活性無明顯影響；但隨著DCD、DMPP 處理濃度的升高，黃瓜種子的CAT 活性則會(huì)受到一定程度的抑制。

表3 DCD、DMPP對黃瓜種子CAT活性的影響 單位：U·g-1

2.4 對黃瓜種子POD活性的影響

由表4 可見，DCD 溶液處理?xiàng)l件下，黃瓜種子的POD 活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢，各處理之間差異達(dá)到1%極顯著水平；T1 處理的黃瓜種子POD 活性最高，為78.24 U·g-1，T3、T5 處理黃瓜種子的POD 活性均有所下降，極顯著低于CK（P＜0.01）；當(dāng)DCD 濃度為10 μmol·mL-1時(shí)，種子的POD 活性降至最低，為43.26 U·g-1。在DMPP 處理?xiàng)l件下，T1處理的種子POD 活性與CK 差異不顯著，但T3、T5 處理的POD 活性呈現(xiàn)明顯下降趨勢，其中T5處理（1 μmol·mL-1）的POD活性降至52.00 U·g-1，極顯著低于CK（P＜0.01）。

表4 DCD、DMPP對黃瓜種子POD活性的影響 單位：U·g-1

2.5 對黃瓜種子SOD活性的影響

由表5 可知，在DCD、DMPP 處理?xiàng)l件下，黃瓜種子的SOD 活性均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。DCD 試驗(yàn)組中，T1 處理的黃瓜種子SOD 活性極顯著高于CK（P＜0.01），T3、T5 處理的SOD 活性極顯著低于CK（P＜0.01），隨濃度升高呈明顯下降趨勢，當(dāng)DCD 濃度 為10 μmol·mL-1時(shí)，種子的SOD活性最低，為19.41 U·g-1。DMPP 試驗(yàn)組中，T1處理黃瓜種子的SOD活性與CK差異不顯著，而T3、T5處理與CK之間的SOD 活性差異達(dá)到1%極顯著水平，其中T3 處理的黃瓜種子SOD 活性最高，為95.89 U·g-1，T5 處理的黃瓜種子SOD活性顯著降低至70.58 U·g-1。

表5 DCD、DMPP對黃瓜種子SOD活性的影響 單位：U·g-1

2.6 對黃瓜種子MDA含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，DCD 試驗(yàn)組和DMPP 試驗(yàn)組中，黃瓜種子的MDA 含量呈現(xiàn)相同的變化趨勢（見表6）。即CK、T1、T2 這3 個(gè)處理組之間的黃瓜種子MDA 含量差異不顯著，但T3 處理的黃瓜種子MDA 含量極顯著高于其他處理（P＜0.01）。綜合分析，試驗(yàn)設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，高濃度的DCD 或DMPP 可能會(huì)導(dǎo)致黃瓜種子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，而低濃度的DCD 或DMPP 處理，則無明顯影響。

表6 DCD、DMPP對黃瓜種子MDA含量的影響單位：μmol·g-1

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，DCD、DMPP 處理濃度較高時(shí)，會(huì)對黃瓜種子的萌發(fā)產(chǎn)生負(fù)面作用，在田間實(shí)際使用時(shí)需要謹(jǐn)慎控制添加量；在黃瓜種子的發(fā)芽期，建議DCD 的施用量控制在1～5 μmol·mL-1，DMPP 施用量控制在0.1～0.5 μmol·mL-1，較為安全。同時(shí)，再配施一定量的氮肥可以有效提高黃瓜種子的發(fā)芽與幼苗生長效率。

淀粉酶主要作用于淀粉分子的α-1,4 糖苷鍵，種子發(fā)芽時(shí)期，需要水解大量的淀粉，為后續(xù)幼苗發(fā)育提供堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)和大量的能量[16]。淀粉酶活性降低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，影響植物生長。植物種子發(fā)芽時(shí)，代謝旺盛，會(huì)生成很多的中間代謝產(chǎn)物，如大量的活性氧[17]，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)可以抵御上述活躍化合物的攻擊，CAT 可以分解H2O2，從而阻止了H2O2與其他物質(zhì)的結(jié)合形成對細(xì)胞的有害產(chǎn)物[17-19]，當(dāng)CAT 活性降低時(shí)，H2O2分解速率將降低，其在體內(nèi)積累，對植物體產(chǎn)生一些毒害作用。因此，CAT 活性的高低可間接反映出種子活力的高低，它們之間呈正相關(guān)的關(guān)系。POD 也能夠?qū)2O2還原成H2O，從而保護(hù)細(xì)胞，然而在逆境下，POD 會(huì)參與活性氧的生成，對細(xì)胞膜有破壞作用，因此可作為評價(jià)組織衰老程度的一種生理指標(biāo)[18]。SOD 能夠催化超氧陰離子自由基形成毒性較小的過氧化氫，進(jìn)而被CAT分解，是保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)最重要的一種酶[20]。MDA 是膜脂過氧化后的產(chǎn)物，它可與蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)結(jié)合，形成褐色沉積物，從而干擾細(xì)胞正常的生命活動(dòng)[21]，其含量高低可間接反映種子受到傷害的程度。

在明確了黃瓜種子對DCD、DMPP 的施用敏感濃度范圍基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)進(jìn)一步探究兩種硝化抑制劑施用條件下，黃瓜幼芽中淀粉酶、抗氧化酶活性等相關(guān)生理指標(biāo)的變化，這些變化是黃瓜種子受到脅迫時(shí)做出的生理反應(yīng)。從試驗(yàn)結(jié)果來看，1μmol·mL-1的DCD溶液便會(huì)觸發(fā)種子細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，細(xì)胞可能動(dòng)用各類途徑，提高了相關(guān)酶的活性，使自身活性氧維持正常水平，隨著濃度升高（5 μmol·mL-1），淀粉酶、SOD 等活性下降，這可能是受到了DCD 的脅迫，但通過MDA 含量與發(fā)芽率表現(xiàn)看，種子未表現(xiàn)出受到損傷，這可能是因?yàn)榈矸勖富钚缘南陆?，?dǎo)致細(xì)胞代謝速率降低，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的水平不高，仍能被清除，當(dāng)DCD 濃度達(dá)到10 μmol·mL-1時(shí)，淀粉酶與三種保護(hù)性酶活性降至最低，MDA 含量上升，顯示細(xì)胞可能受到了一定程度的損害。而低濃度的DMPP（0.1 μmol·mL-1）對黃瓜種子各生理指標(biāo)無明顯作用，隨著DMPP濃度的增加（0.5 μmol·mL-1），毒害作用可能加強(qiáng)，組織內(nèi)的活性氧含量迅速上升，激活了應(yīng)激反應(yīng)，刺激了SOD 活性增強(qiáng)，CAT、POD 活性雖有降低，但仍可使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平維持穩(wěn)定，發(fā)芽率、淀粉酶活和MDA 含量也輔證了這一點(diǎn)。當(dāng)DMPP 濃度達(dá)到最高時(shí)（1.0 μmol·mL-1），細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性大幅下降，活性氧積累增加，MDA 含量升高，種子發(fā)芽率下降，細(xì)胞受到損傷。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，對花生苗期施用硫脲，隨著濃度升高，幼苗的生長與相關(guān)生理指標(biāo)表現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象，即低濃度硫脲對苗期花生生長有益，高濃度會(huì)抑制其生長[8]；也有報(bào)道顯示，在大豆苗期中使用硫脲，低濃度的情況下就對其生長與相關(guān)酶活產(chǎn)生了抑制，高濃度情況下，抑制效果更為明顯[10]。對小麥的研究結(jié)果顯示，硫脲對小麥種子和幼苗的毒性相對較大，而DCD 的毒性相對較小[9]。本試驗(yàn)結(jié)果：高濃度的DCD、DMPP 均會(huì)對黃瓜種子的相關(guān)生理指標(biāo)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響，降低種子的發(fā)芽率，也證明過量使用硝化抑制劑，會(huì)對作物產(chǎn)生損害。

相對于環(huán)境穩(wěn)定的試驗(yàn)室環(huán)境，田間具有更多的不確定因素，此外，不同的黃瓜品種及遺傳背景對硝化抑制劑耐受性的表現(xiàn)可能也會(huì)有所不同，因此，DCD、DMPP 的安全用量與最佳施用濃度尚有待開展田間試驗(yàn)進(jìn)一步完善。目前，國內(nèi)學(xué)者對硝化抑制劑的研究大部分集中在對環(huán)境與經(jīng)濟(jì)效益方面，關(guān)于硝化抑制劑的毒理研究較少，并且DCD、DMPP 影響黃瓜種子相關(guān)生理指標(biāo)變化的具體機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。