劉震坤，陳鮮鑫，任思宇，李世易

（1.樂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川樂山 614000；2.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶萬州 404155）

自2020年起，我國飼料進入全面“禁抗”時代。微生物飼料添加劑能促進動物健康生長，維護腸道微生態(tài)平衡、提高飼料轉(zhuǎn)化率、降低動物發(fā)病率等，逐漸成為抗生素的有效替代品。本試驗對雞腸道來源的一株植物乳桿菌的生長曲線、產(chǎn)酸性能、抗逆性、抗氧化能力和黏附能力等進行測定，以期為開發(fā)雞微生物飼料添加劑提供菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、沙 門 菌（Salmonella enteritidis）ATCC14028、金 黃 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538由上海保藏生物技術(shù)中心提供。蛋白水解培養(yǎng)基：配制15%的脫脂奶粉水溶液，滅菌后以10%的量加入到NA培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 生長曲線和產(chǎn)酸曲線 將植物乳桿菌DK106菌懸液以1%～2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧振蕩培養(yǎng)，分別于第 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、24 小 時 取 樣 測 定OD600nm值，同時測定pH。

1.2.2 耐酸和耐受膽鹽能力 將菌株DK106菌懸液以1%～2%的接種量分別接種于pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，膽鹽濃 度 為 0.1%、0.2%、0.3%的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧振蕩培養(yǎng)3 h。然后分別取發(fā)酵液5 mL于離心管中，置于低溫離心機中10000 r/min離心2 min，棄去上清液。將菌體沉淀用生理鹽水洗滌2～3次，加入等體積的生理鹽水，混合均勻。然后以10%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測定OD600nm值，評價該菌株耐酸和膽鹽能力。

1.2.3 藥敏試驗 采用紙片擴散法測定菌株的藥物敏感性。移取菌株DK106菌懸液200μL滴至MRS固體培養(yǎng)基上，均勻涂布，每個培養(yǎng)皿放置3個相同的藥敏紙片，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察是否形成透明圈，并精確量取透明圈直徑。

1.2.4 DPPH自由基清除能力 取菌株DK106菌懸液1 mL于2 mL離心管中，置于低溫離心機中10000 r/min離心2 min，取上清液400 μL，分別加入600 μL 0.2mmol/L DPPH無水乙醇溶液和80%的甲醇溶液（作為對照）中；混合均勻后室溫避光反應(yīng)30 min，10000 r/min離心2 min，取上清液測定OD517nm值。取400 μL 80%甲醇溶液和600μL DPPH無水乙醇溶液，混合均勻后作為空白。DPPH自由基清除率計算公式為：

DPPH自由基清除率/%=[1-（OD樣品-OD空白）/OD對照]×100。

1.2.5 黏附性試驗

1.2.5.1 表面疏水性和自凝聚性測定 將菌株DK106菌懸液置于低溫離心機中10000 r/min離心2 min，用生理鹽水洗滌2～3次，加適量生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液OD600nm=0.4～0.8（A0）。

（1）表面疏水性測定。取3 mL上述菌懸液和3 mL二甲苯于10 mL離心管中，渦旋振蕩混合均勻，室溫靜置30 min，小心吸取上層水溶液，測量OD600nm（A30min）。以生理鹽水為空白。疏水率計算公式如下：

疏水率 /%=[（A0-A30min）/A0]×100 ；

式中：A30min為靜置30 min時的OD600nm值；A0為0時的OD600nm值。

（2）自凝聚性測定。取4 mL上述菌懸液于10 mL 離心管中，室溫靜置 1、2、3、4、5 h，小心吸取上層溶液，測量OD600nm（A1），以生理鹽水為空白。自凝聚率公式計算如下：

自凝聚率 /%=[（A0-A1）/A0]×100 ；

式中：A1為菌懸液靜置不同時間的OD600nm值；A0為0時的OD600nm值。

1.2.5.2 與致病菌共凝集性 取菌株DK106和大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌菌懸液于低溫離心機中10000 r/min離心2 min，用生理鹽水洗滌2～3次，加適量生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液OD600nm=0.4～0.8（A0）。分別取菌株DK106菌懸液3 mL和致病菌菌懸液3 mL于10 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，37℃恒溫培養(yǎng)2 h后吸取上層溶液，測定OD600nm值。以生理鹽水為空白。與致病菌共凝集率計算如下：

共凝集率 /%=[1-2A1/（A2+A3）]×100 ；

式中：A1值為混合菌懸液OD600nm值；A2值為0h DK106菌懸液OD600nm值；A3值為0h病原菌菌懸液OD600nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線和產(chǎn)酸曲線 由圖1可知，該菌株在第2小時進入生長對數(shù)期，菌體迅速增長；14 h開始進入生長穩(wěn)定期。發(fā)酵液pH由初始6.09，在第14小時降至3.98，14～24 h發(fā)酵液的pH維持在3.95～3.98。

圖1 植物乳桿菌DK106的生長曲線和產(chǎn)酸曲線

2.2 耐酸和耐膽鹽能力 由圖2可知，菌株 DK106 接 種 于 pH 分 別 為 5.0、4.0、3.0、2.0的MRS培養(yǎng)基中，厭氧振蕩培養(yǎng)3 h，發(fā)酵液OD600nm值逐漸下降，pH=6.0時，OD600nm值為2.602，但當(dāng)pH迅速降至0.419過程中，pH=2.0時OD600nm值最低。表明菌株DK106在初始pH=4.0～6.0時可正常生長，pH降至3.0時生長速度緩慢，pH=2時幾乎完全被抑制。

由圖3可知，MRS液體培養(yǎng)基中膽鹽濃度越高，菌株DK106菌懸液的OD值逐漸越低。膽鹽濃度從0升高到0.3%，該菌株發(fā)酵液OD值從1.776降至1.216。表明高濃度膽鹽對該菌株有一定的抑制作用，但仍有較高的存活率。

圖3 植物乳桿菌DK106在不同膽鹽濃度的MRS培養(yǎng)基中的生長情況

2.3 藥敏試驗 由表1可知，菌株DK106對氟苯尼考、頭孢噻肟、頭孢曲松和林可霉素敏感；對頭孢哌酮、頭孢氨芐、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素、氨芐西林、阿莫西林、氧氟沙星、恩諾沙星中度敏感；對磺胺異惡唑、青霉素、鏈霉素、甲氧氨芐嘧啶、卡那霉素和慶大霉素不敏感。

表1 植物乳桿菌DK106的藥敏試驗結(jié)果

2.4 DPPH自由基清除能力 試驗得出，DK106的DPPH自由基清除率為90.79%，表明該菌株有很強的抗氧化能力。

2.5 黏附性 試驗通過測定菌株DK106的表面疏水性、自凝聚性和與致病菌凝聚性評價其黏附性。結(jié)果表明：（1）菌株DK106經(jīng)二甲苯處理30 min后，其表面疏水率高達97.40%；（2）第1小時的自凝聚率僅為18.82%。而隨著孵育時間的延長，自凝聚率逐漸升高，在第5小時達到68.80%；（3）試驗分別測定該菌株與大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌的第2小時共凝聚率。該菌株與金黃色葡萄球菌的共凝聚率最高，達到55.32%；大腸桿菌和沙門菌相對較低，分別是20.59%和16.37%。

3 討論

乳酸菌的生長曲線包括延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個時期。菌株DK106最初2 h生長遲緩，為延滯期，之后生長迅速，進入對數(shù)期；14 h后進入生長穩(wěn)定期。乳酸菌在適宜的培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生大量乳酸等有機酸，降低發(fā)酵液pH。

乳酸菌要到達腸道發(fā)揮益生作用就要能耐受低 pH的胃酸環(huán)境（RAMOS等，2013）。本試驗的菌株DK106能在pH4.0以上的環(huán)境中正常生長繁殖，但當(dāng)pH下降到3.0以下時，存活率降低，生長繁殖受到抑制。膽鹽是膽汁的主要成分，它能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)菌的生長繁殖（BEGLEY等，2005）。因此，能耐受高濃度膽鹽也是評價乳酸菌性能的重要指標(biāo)。通常動物小腸內(nèi)的膽鹽濃度在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動（Taranto等，2006）。本試驗將菌株DK106接種于0.1%、0.2%、0.3%的MRS液體培養(yǎng)基中，隨著膽鹽濃度升高，該菌株仍有較高的存活率。

Essid等（2009）、高佳媛等（2018）對植物乳桿菌的藥物敏感性進行了大量研究，與本試驗結(jié)果有所區(qū)別，表明同一菌種不同菌株間的耐藥性存在一定的差異，原因可能是在封閉環(huán)境中，乳酸菌處于抗生素和抗藥性元件的影響所致。乳酸菌具有抗氧化活性，起到清除自由基的作用。DPPH自由基清除率能反映乳酸菌的抗氧化能力（LIN和CHANG，2000）。菌株DK106的DPPH自由基清除率高達90.79%，表明該菌株有很高的抗氧化能力，該菌株進入動物機體后，能在一定程度上避免機體氧化損傷。

乳酸菌的黏附性是其在動物腸道中長期定植的重要條件，也是評價乳酸菌益生性能的重要指標(biāo)之一。乳酸菌表面疏水性、自凝集能力與黏附能力存在一定的相關(guān)性（龔虹等，2016）。其中，表面疏水性與黏附能力存在顯著相關(guān)性（MALDONADO等，2012）。本試驗將 DK106經(jīng)二甲苯處理30 min后，表面疏水性達到97.40%，而自凝聚率在第5小時也高達68.80%，與大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌的第2小時共凝聚率也分別達到20.59%、16.37%和55.32%。反映出菌株DK106有很高的黏附能力，可以到達腸道進行定植并發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

植物乳桿菌DK106能耐受pH3.0和0.3%的膽鹽濃度環(huán)境；對氟苯尼考、頭孢噻肟、頭孢曲松和林可霉素敏感；具有良好的產(chǎn)蛋白酶能力、抗氧化能力和黏附性，是一株性能優(yōu)良的乳酸菌株，可作為家禽用微生物飼料添加劑的菌株來源。